Aspidosperma species belonging to the Apocynaceae family are restricted to the Americas. Ethnopharmacological studies have shown the use of these species as a potential agent against malaria and trypanosomatids, also used as antibiotics, anti-inflammatory and antitumor. The search for new chemical entities with antimicrobial activity has significant importance due to the versatility of microorganisms to acquire resistance to the therapeutic arsenal, and due to the prevalence of neglected diseases, such as leishmaniasis. These are endemic in developing countries have few therapeutic options, which are toxic and have limited effectiveness. The aim of this study was to evaluate the crude extracts and fractions from different parts of the species A. macrocarpon, A. tomentosum and A. pyrifolium, as the antimicrobial action and realize bioguided chemical study of the species with high activity against the microorganisms tested, and less toxic to mammalian cells. About antibacterial activity alkaloidal fraction from A. pyrifolium stem presented moderate minimal inhibitory concentration (MIC): 125 and 250 g/mL for Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis, respectively. The ethyl acetate fraction of A. macrocarpon stem had a weak MIC of 250 g/mL on Candida parapsilosis. The activity of the extract of the stem bark of A. macrocapon against Leishmania amazonensis promastigotes showed inhibitory concentration (IC50) of 151.5 g/mL and selectivity index (SI) of 6.52 on LLCMK2 cells, this species were considered the most promising for the bioguided chemical study. The chloroform and ethyl acetate fractions of the A. macrocarpon stem bark showed IC50 29.00 1.65 and 29.50 0.95 g/mL, respectively on promastigotes forms of L. amazonensis. The bioguided study with chloroform fraction led to subfraction of monoacylglycerols, wich were the most active on L. amazonensis, with IC50 2.31 0.08 and 2.29 0.14 g/mL on promastigotes and intracellular amastigotes, respectively. SI showed that this fraction were 42 fold more toxic to L. amazonensis than to macrophages. Studies related to the mechanism of action of monoacylglycerols evaluated by optical microscopy, scanning electron (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) showed abnormalities such as mitochondrial swelling, concentric membranes inside the mitochondria, presence of perforations on the cell surface of the parasite and autophagic vacuoles. These data together with results of flow cytometry showed necrosis and autophagy as a possible mechanism of cell death. Quercetin was identified as the active substance of the ethyl acetate fraction against evolutionary forms of L. amazonensis. This substance had, IC50 of 61.93 1.36 and 63.86 3.25 M/mL on promastigotes and intracellular amastigotes, respectively. Quercetin was evaluated in combination with amphotericin B (Q + A) and miltefosine (Q + M), the combinatorial effect of both was considered synergistic against all forms of L. amazonensis. The combinations Q+A and Q+M showed antagonistic action on macrophages and human erythrocytes. Evaluation of the combination using SEM and TEM associated with literature data indicate apoptotic cell death after treatment with both combinations. These findings are relevant as a first step in the search for new therapies for the treatment of cutaneous leishmaniasis. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As espécies do gênero Aspidosperma pertencentes à família Apocynaceae são restritas às Américas. Estudos etnofarmacológicos revelaram a utilização destas espécies como agente potencial contra a malária e tripanosomatídeos, como antimicrobianos, anti-inflamatórios e antitumorais. A pesquisa em busca de novas entidades químicas com ação antimicrobiana apresenta significativa importância devido à versatilidade dos micro-organismos em adquirir resistência ao arsenal terapêutico, e devido à prevalência de doenças consideradas negligenciadas, como as leishmanioses. Estas são endêmicas nos países em desenvolvimento e possuem poucas opções terapêuticas, sendo estas tóxicas e de eficácia limitada. O objetivo do estudo consistiu em avaliar os extratos brutos e frações de diferentes partes das espécies de A. macrocarpon, A. tomentosum e A. pyrifolium, quanto à ação antimicrobiana e realizar o estudo químico bioguiado da espécie mais ativa sobre os micro-organismos testados e menos tóxica para células de mamíferos. Sobre a atividade antibacteriana a fração alcaloídica da casca de A. pyrifolium apresentou concentração inibitória mínima (CIM) moderada de 125 e 250 μg/mL para Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis, respectivamente. A fração acetato de etila do caule de A. macrocarpon apresentou CIM fraca de 250 μg/mL sobre Candida parapsilosis. A atividade do extrato da casca do caule de A. macrocapon contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis apresentou concentração inibitória (CI50) de 151,5 g/mL e índice de seletividade (IS) de 6,52 sobre células LLCMK2, sendo a espécie mais promissora para a realização do estudo químico bioguiado. As frações de clorofórmio e acetato de etila obtidas da casca do caule de A. macrocarpon demonstraram CI50 de 29,00 1,65 e 29,50 0,95 g/mL respectivamente, sobre as formas promastigotas de L. amazonensis. O estudo bioguiado do fracionamento da fração clorofórmio conduziu à obtenção da subfração com monoacilglicerois (MAG) como a mais ativa sobre as formas evolutivas de L. amazonensis, com CI50 2,31 0,08 e 2,29 0,14 g/mL sobre promastigotas e amastigotas intracelulares, respectivamente e IS sobre macrófagos J774-A1 de 42, para ambas as formas evolutivas. Estudos relacionados ao mecanismo de ação da fração MAG avaliados por microscopia óptica, eletrônica de varredura (MEV), e transmissão (MET) evidenciaram alterações como inchaço mitocondrial, membranas concêntricas dentro da mitocôndria, presença de perfurações na superfície celular do parasito e vacúolos autofágicos. Estes dados quando analisados em conjunto com resultados da citometria de fluxo indicaram a autofagia e necrose como provável mecanismo de morte celular. Após o fracionamento da fração acetato de etila foi identificada a quercetina como substância ativa sobre as formas evolutivas de L. amazonensis, com CI50 de 61,93 1,36 e 63,86 3,25 M/mL sobre promastigotas e amastigotas intracelulares, respectivamente. A quercetina foi avaliada em combinação com anfotericina B (Q+A) e miltefosina (Q+M), o efeito combinatório de ambas foi considerado sinérgico sobre as formas evolutivas de L. amazonensis. As combinações Q+A e Q+M demonstraram ação antagônica sobre macrófagos e eritrócitos humanos. A avaliação da combinação por MEV e MET associada aos dados da literatura indicaram provável morte celular por apoptose de ambas as combinações. Estes achados nos ensaios in vitro são relevantes como primeiro passo na busca por novas terapias para o tratamento da leishmaniose cutânea.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufal.br:riufal/1878 |
| Date | 25 September 2015 |
| Creators | Pessini, Greisiele Lorena |
| Contributors | Araújo Júnior, João Xavier de, http://lattes.cnpq.br/5717734170464420, Nakamura, Celso Vataru, http://lattes.cnpq.br/3410067114297676, Aquino, Thiago Mendonça de, http://lattes.cnpq.br/3395195195361558, Bortoluzzi, Janaína Heberle, http://lattes.cnpq.br/6238767491074844, Moreira, Magna Suzana Alexandre, http://lattes.cnpq.br/1313843948155733, Silva, Tânia Maria Sarmento da, http://lattes.cnpq.br/2835093153489923, Santos, Bárbara Viviana de Oliveira, http://lattes.cnpq.br/5648456118559210 |
| Publisher | Universidade Federal de Alagoas, Brasil, Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia, UFAL |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFAL, instname:Universidade Federal de Alagoas, instacron:UFAL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | bitstream:http://www.repositorio.ufal.br:8080/bitstream/riufal/1878/2/license.txt, bitstream:http://www.repositorio.ufal.br:8080/bitstream/riufal/1878/1/Atividade+antimicrobiana+e+estudo+qu%C3%ADmico+bioguiado+de+esp%C3%A9cies+de+Aspidosperma.pdf |
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