Introdução: Estudos prévios com leveduras evidenciaram um importante papel de substâncias amiloide (SA) na regulação da gametogênese, questionando seu potencial como marcador da qualidade gamética. Contudo, até o presente momento, nenhum estudo avaliou a presença de SA em óocitos e embriões de mamíferos. Objetivos: Descrever a presença, caracterizar o padrão de distribuição e comparar os níveis das SA em óocitos maduros e embriões pré-implantação, utilizando modelo murino. Identificar, caracterizar o padrão de distribuição e quantificar SA em oócitos humanos em diferentes estágios de desenvolvimento (VG- vesícula germinativa, MI- metáfase I e MII- metáfase II) e estabelecer a correlação entre os níveis de SA nos oócitos e as características clínicas de pacientes submetidas a estimulação ovariana controlada (EOC) para fertilização in vitro (FIV). Metodologia: Realizou-se um estudo piloto experimental, prospectivo, utilizando 20 oócitos maduros e 200 embriões pré-implantação de camundongos (1 célula, 2 células, 4 células, 8 células e blastocistos) e 46 oócitos humanos imaturos e in vitro maturados, doados por 11 pacientes submetidas à EOC para FIV. Oócitos em MII e embriões pré-implantação de camundongos congelados, imediatamente após o descongelamento, foram fixados para imunocoloração para visualização de SA por microscopia confocal e por microscopia imunoeletrônica de transmissão. Oócitos humanos imaturos (VG e MI) e maturados in vitro (VG Parado, MI, MI Parado e MII) também foram fixados e imunocorados para avaliação de SA, utilizando o mesmo anticorpo, por microscopia confocal. Para quantificar a imunocoloração de SA, nos oócitos e ao longo do desenvolvimento embrionário inicial, foi utilizado o programa ImageJ. Resultados: Em todas as amostras (camundongos e humanos), a imunocoloração para SA aparece por toda a zona pelúcida, bem como no citoplasma e no núcleo de oócitos, corpúsculos polares e embriões pré- implantação. Em camundongos, o estágio embrionário de 2 células apresentou níveis mais elevados de SA (69000187,4 DP 6733098,1 a.u.), quando comparado aos outros estágios de desenvolvimento (p <0,0001). A microscopia imunoeletrônica confirmou a presença de SA em oócitos e embriões pré- implantação. Em humanos, oócitos no estágio de VG, frescos, apresentaram níveis mais elevados de substância amiloide (4164.7 DP 1573.5 a.u.), quando comparados a oócitos em MI e MII (p = 0,008). Foi encontrada uma associação negativa entre níveis de SA e o índice de massa corporal (IMC) (-0,54; p = 0,0007), o número de dias de estimulação ovariana (-0,44; p = 0,002), a dose de hMG (-0,44; p = 0,002), o tempo entre a captação dos oócitos e a fixação das amostras (-0,33; p = 0,02) e o tempo decorrido após o trigger (-0,33; p = 0,02). Níveis elevados de SA foram encontrados em oócitos de pacientes que apresentaram valores de hormônio anti-mülleriano (AMH) entre 1 e 3 ng/ml, quando comparados a <1 ng/ml (4592,7 DP 2126,3 a.u vs. 737,3 DP 14,7 a.u.; p = 0,0002) e > 3 ng/ml (4592,7 DP 2126,2 a.u. vs. 3197,3 DP 895,0 a.u ; p = 0,006).16 Conclusões: Nós demonstramos pela primeira vez que as SA estão presentes no citoplasma e núcleo de oócitos murinos e humanos e embriões pré- implantação de camundongos. Também mostramos que as SA se distribuem de forma heterogênea ao longo do processo de maturação de oócitos humanos e do desenvolvimento pré-implantacional de embriões de camundongos. Embriões murinos no estágio de 2 células e oócitos humanos no estágio de VG apresentaram os maiores níveis de SA. Evidenciamos também uma correlação entre os níveis de SA nos oócitos humanos e características clínicas de bom prognóstico em pacientes submetidas a FIV, como por exemplo, baixo IMC e valores normais de AMH. Levando em conta que as SA estão envolvidas em mecanismos fundamentais relacionados a alterações celulares patológicas, bem como no processo de divisão celular, estudos futuros devem investigar o seu possível papel como biomarcador do envelhecimento e/ou da qualidade oocitária / Introduction: Previous studies with budding yeasts evidenced an important role of amyloid substances (AS) in the regulation of gametogenesis, questioning its potential as a marker of gametic quality. However, to date, no study has evaluated the presence of AS in mammalian oocytes and embryos. Objectives: To describe the presence, to characterize the distribution pattern and to compare AS levels in mature oocytes and preimplantation embryos using murine model. Identify, characterize the distribution pattern and quantify AS in human oocytes at different stages of development (GV- germinal vesicle, MImetaphase I and MII-metaphase II) and establish the correlation between oocytes AS levels and clinical characteristics of patients undergoing control ovarian stimulation (COE) for in vitro fertilization (IVF). Methods: An experimental prospective pilot study was carried out using 20 mature oocytes and 200 preimplantation mouse embryos (1-cell, 2-cell, 4-cell, 8- cell and blastocysts) and 46 immature and in vitro mature human oocytes donated from 11 consenting patients submitted to COE for IVF. Frozen MII oocytes and mouse preimplantation embryos, immediately after thawing, were fixed for immunostaining for visualization of AS by confocal microscopy and by transmission electron microscopy. Immature (GV and MI) and in vitro mature (GV Arrested, MI, MI Arrested and MII) human oocytes were also fixed and immunostained for AS evaluation, using the same antibody, by confocal microscopy. Fluorescence intensity from immunofluorescent staining and data from confocal microscopy were quantified using ImageJ program. Results: In all samples (mice and humans), immunostaining for AS appears throughout the zona pellucida, as well as in the cytoplasm and nucleus of oocytes, polar bodies, and preimplantation embryos. In mouse, 2-cell embryos exhibited higher levels of AS (69000187,4 SD 6733098,1 a.u.) when compared to the other stages of development (p <0.0001). Electron microscopy confirmed the presence of AS in mouse oocytes and preimplantation embryos. In humans, fresh GV stage oocytes exhibited higher levels of AS (4164.7 SD 1573.5 a.u.) when compared to MI and MII oocytes (p = 0.008). A negative association was found between levels of AS and patient body mass index (BMI) (-0.54; p = 0.0007), number of days of control ovarian stimulation (-0.44; p = 0.002); (-0.34, p = 0.002), dose of gonadotropin used, time between oocyte retrieval and fixation (-0.33; p = 0.02) and time after the hCG trigger (-0.33; p = 0.02). Significantly higher levels of AS were found in patients with AMH between 1 and 3 ng/ml, compared to <1 ng/ml (4592.7 SD 2126.3 a.u. vs. 737, 3 SD 14.7 a.u.; p = 0.0002) and > 3 ng/ml (4592.7 SD 2126.2 a.u. vs. 3197.3 SD 895.0 a.u.; p = 0.006). Conclusions: We demonstrate for the first time the presence, distribution, and change in AS throughout mouse and human oocyte maturation, and mouse embryonic development. Two-cell mouse embryos and GV human oocytes had the highest levels of AS. We also determine associations between AS in human oocytes with good prognosis clinical characteristics in patients submitted to IVF, such as low BMI and normal AMH values. Considering that AS are involved in fundamental mechanisms related to pathological cell changes, as well as in the19 conclusion of cell division process, future studies should investigate their possible role as a biomarker of oocyte aging and/or quality
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05082019-132718 |
| Date | 31 May 2019 |
| Creators | Pimentel, Ricardo Novato |
| Contributors | Keefe, David Lawrence, Navarro, Paula Andrea de Albuquerque Salles |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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