A produção in vitro de embriões, no Brasil, ocupa lugar de destaque dentre as biotecnologias da reprodução animal e o atual desafio é torná-la cada vez mais acessível, para tanto, é fundamental aproximar os resultados de produção e sobrevivência dos embriões produzidos in vitro daqueles desenvolvidos naturalmente. Boa parte desta variação do potencial de desenvolvimento do embrião está relacionada à características do oócito. Há a possibilidade de essa capacidade estar relacionada ao perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo, neste sentido, este projeto teve como objetivo principal avaliar a correlação do potencial de desenvolvimento de oócitos com o conteúdo do perfil lipídico no líquido folicular e das células foliculares, baseado no sistema de ativação partenogenética, cultivo individual e analise retrospectiva. Não existe, até o momento, uma caracterização detalhada do microambiente folicular, um componente importante dos fluídos são os lipídios e recentemente tem sido demonstrado que eles estão envolvidos em vários aspectos do metabolismo além de também funcionarem como moléculas sinalizadoras ou até mesmo serem capazes de induzir modificações na cromatina. Os íons oriundos do estudo do perfil lipídico foram avaliados em comparação ao potencial de desenvolvimento do oócito. No conjunto de dados do MALDI observou-se maior concentração de triacilglicerídeos, principalmente contendo ácidos graxos como o oleico, linoleico e esteárico nos líquidos foliculares e células do folículo provenientes do ambiente folicular de oócitos que clivaram. No perfil lipídico do líquido folicular feito por LC-MS/MS os lipídios identificados foram de classes diversas, com participação expressiva no modo positivo de triacilgliceróis, fosfatidilcolinas, esfingomielinas, monoacildiacilglicerídeos entre outros e no modo negativo a classe lipídica que prevaleceu foi dos lipídios mitocondriais, as cardiolipinas. Também foram detectados lipídios citosólicos como o CE e alguns pouco descritos no líquido folicular como o PIP2 e PIP3, além disso, alguns lipídios foram característicos dos grupos clivados e blastocistos. O perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo é complexo e alguns lipídios deste ambiente tem potencial para serem biomarcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production in Brazil occupies a prominent place among the animal reproduction biotechnology, the current challenge is to make it increasingly accessible so it is essential to approach the results of production and survival of in vitro produced embryos of those developed naturally. Much of this potential change of embryo development is related to the oocyte characteristics. There is the possibility of this ability is related to the lipid profile of follicular fluid and follicle cells , in this sense, this project aimed to evaluate the correlation of the oocytes development potential with the content of the lipid profile in follicular fluid and cells follicular, based on parthenogenetic activation , individual cultivation and retrospective analysis system. There isn\'t, to date, a detailed characterization of the follicular microenvironment, an important component of the follicular fluid and cels are the lipids and recently has been shown that they are involved in various aspects of metabolism in addition also function as signaling molecules or even be capable of inducing changes in chromatin. Derived ions from the study of lipid profile were evaluated compered with oocyte developmental potential. In MALDI dataset observed triacylglycerides higher concentration, mainly containing fatty acids such as oleic, linoleic and stearic acids in follicular fluid and follicle cells from follicular environment of cleaved oocytes. In follicular fluid lipid profile done by LC-MS/MS lipids were identified in diferent classes, with significant participation in positive mode of triacylglycerols, phosphatidylcholines, sphingomyelins, monoacildiacilglicerídeos among others and in negative mode prevailed lipid class was of mitochondrial lipids, the cardiolipin. Cytosolic lipids were also detected as CE and some little follicular fluid as described in the PIP2 and PIP3, and others lipids were characteristic of cleaved and blastocysts groups. The lipid profile of follicular fluid and follicle cells is complex and some of this lipid environment has the potential to be biomarkers of oocyte quality.

A produção in vitro de embriões, no Brasil, ocupa lugar de destaque dentre as biotecnologias da reprodução animal e o atual desafio é torná-la cada vez mais acessível, para tanto, é fundamental aproximar os resultados de produção e sobrevivência dos embriões produzidos in vitro daqueles desenvolvidos naturalmente. Boa parte desta variação do potencial de desenvolvimento do embrião está relacionada à características do oócito. Há a possibilidade de essa capacidade estar relacionada ao perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo, neste sentido, este projeto teve como objetivo principal avaliar a correlação do potencial de desenvolvimento de oócitos com o conteúdo do perfil lipídico no líquido folicular e das células foliculares, baseado no sistema de ativação partenogenética, cultivo individual e analise retrospectiva. Não existe, até o momento, uma caracterização detalhada do microambiente folicular, um componente importante dos fluídos são os lipídios e recentemente tem sido demonstrado que eles estão envolvidos em vários aspectos do metabolismo além de também funcionarem como moléculas sinalizadoras ou até mesmo serem capazes de induzir modificações na cromatina. Os íons oriundos do estudo do perfil lipídico foram avaliados em comparação ao potencial de desenvolvimento do oócito. No conjunto de dados do MALDI observou-se maior concentração de triacilglicerídeos, principalmente contendo ácidos graxos como o oleico, linoleico e esteárico nos líquidos foliculares e células do folículo provenientes do ambiente folicular de oócitos que clivaram. No perfil lipídico do líquido folicular feito por LC-MS/MS os lipídios identificados foram de classes diversas, com participação expressiva no modo positivo de triacilgliceróis, fosfatidilcolinas, esfingomielinas, monoacildiacilglicerídeos entre outros e no modo negativo a classe lipídica que prevaleceu foi dos lipídios mitocondriais, as cardiolipinas. Também foram detectados lipídios citosólicos como o CE e alguns pouco descritos no líquido folicular como o PIP2 e PIP3, além disso, alguns lipídios foram característicos dos grupos clivados e blastocistos. O perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo é complexo e alguns lipídios deste ambiente tem potencial para serem biomarcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production in Brazil occupies a prominent place among the animal reproduction biotechnology, the current challenge is to make it increasingly accessible so it is essential to approach the results of production and survival of in vitro produced embryos of those developed naturally. Much of this potential change of embryo development is related to the oocyte characteristics. There is the possibility of this ability is related to the lipid profile of follicular fluid and follicle cells , in this sense, this project aimed to evaluate the correlation of the oocytes development potential with the content of the lipid profile in follicular fluid and cells follicular, based on parthenogenetic activation , individual cultivation and retrospective analysis system. There isn\'t, to date, a detailed characterization of the follicular microenvironment, an important component of the follicular fluid and cels are the lipids and recently has been shown that they are involved in various aspects of metabolism in addition also function as signaling molecules or even be capable of inducing changes in chromatin. Derived ions from the study of lipid profile were evaluated compered with oocyte developmental potential. In MALDI dataset observed triacylglycerides higher concentration, mainly containing fatty acids such as oleic, linoleic and stearic acids in follicular fluid and follicle cells from follicular environment of cleaved oocytes. In follicular fluid lipid profile done by LC-MS/MS lipids were identified in diferent classes, with significant participation in positive mode of triacylglycerols, phosphatidylcholines, sphingomyelins, monoacildiacilglicerídeos among others and in negative mode prevailed lipid class was of mitochondrial lipids, the cardiolipin. Cytosolic lipids were also detected as CE and some little follicular fluid as described in the PIP2 and PIP3, and others lipids were characteristic of cleaved and blastocysts groups. The lipid profile of follicular fluid and follicle cells is complex and some of this lipid environment has the potential to be biomarkers of oocyte quality.

Introdução: Estudos prévios com leveduras evidenciaram um importante papel de substâncias amiloide (SA) na regulação da gametogênese, questionando seu potencial como marcador da qualidade gamética. Contudo, até o presente momento, nenhum estudo avaliou a presença de SA em óocitos e embriões de mamíferos. Objetivos: Descrever a presença, caracterizar o padrão de distribuição e comparar os níveis das SA em óocitos maduros e embriões pré-implantação, utilizando modelo murino. Identificar, caracterizar o padrão de distribuição e quantificar SA em oócitos humanos em diferentes estágios de desenvolvimento (VG- vesícula germinativa, MI- metáfase I e MII- metáfase II) e estabelecer a correlação entre os níveis de SA nos oócitos e as características clínicas de pacientes submetidas a estimulação ovariana controlada (EOC) para fertilização in vitro (FIV). Metodologia: Realizou-se um estudo piloto experimental, prospectivo, utilizando 20 oócitos maduros e 200 embriões pré-implantação de camundongos (1 célula, 2 células, 4 células, 8 células e blastocistos) e 46 oócitos humanos imaturos e in vitro maturados, doados por 11 pacientes submetidas à EOC para FIV. Oócitos em MII e embriões pré-implantação de camundongos congelados, imediatamente após o descongelamento, foram fixados para imunocoloração para visualização de SA por microscopia confocal e por microscopia imunoeletrônica de transmissão. Oócitos humanos imaturos (VG e MI) e maturados in vitro (VG Parado, MI, MI Parado e MII) também foram fixados e imunocorados para avaliação de SA, utilizando o mesmo anticorpo, por microscopia confocal. Para quantificar a imunocoloração de SA, nos oócitos e ao longo do desenvolvimento embrionário inicial, foi utilizado o programa ImageJ. Resultados: Em todas as amostras (camundongos e humanos), a imunocoloração para SA aparece por toda a zona pelúcida, bem como no citoplasma e no núcleo de oócitos, corpúsculos polares e embriões pré- implantação. Em camundongos, o estágio embrionário de 2 células apresentou níveis mais elevados de SA (69000187,4 DP 6733098,1 a.u.), quando comparado aos outros estágios de desenvolvimento (p <0,0001). A microscopia imunoeletrônica confirmou a presença de SA em oócitos e embriões pré- implantação. Em humanos, oócitos no estágio de VG, frescos, apresentaram níveis mais elevados de substância amiloide (4164.7 DP 1573.5 a.u.), quando comparados a oócitos em MI e MII (p = 0,008). Foi encontrada uma associação negativa entre níveis de SA e o índice de massa corporal (IMC) (-0,54; p = 0,0007), o número de dias de estimulação ovariana (-0,44; p = 0,002), a dose de hMG (-0,44; p = 0,002), o tempo entre a captação dos oócitos e a fixação das amostras (-0,33; p = 0,02) e o tempo decorrido após o trigger (-0,33; p = 0,02). Níveis elevados de SA foram encontrados em oócitos de pacientes que apresentaram valores de hormônio anti-mülleriano (AMH) entre 1 e 3 ng/ml, quando comparados a <1 ng/ml (4592,7 DP 2126,3 a.u vs. 737,3 DP 14,7 a.u.; p = 0,0002) e > 3 ng/ml (4592,7 DP 2126,2 a.u. vs. 3197,3 DP 895,0 a.u ; p = 0,006).16 Conclusões: Nós demonstramos pela primeira vez que as SA estão presentes no citoplasma e núcleo de oócitos murinos e humanos e embriões pré- implantação de camundongos. Também mostramos que as SA se distribuem de forma heterogênea ao longo do processo de maturação de oócitos humanos e do desenvolvimento pré-implantacional de embriões de camundongos. Embriões murinos no estágio de 2 células e oócitos humanos no estágio de VG apresentaram os maiores níveis de SA. Evidenciamos também uma correlação entre os níveis de SA nos oócitos humanos e características clínicas de bom prognóstico em pacientes submetidas a FIV, como por exemplo, baixo IMC e valores normais de AMH. Levando em conta que as SA estão envolvidas em mecanismos fundamentais relacionados a alterações celulares patológicas, bem como no processo de divisão celular, estudos futuros devem investigar o seu possível papel como biomarcador do envelhecimento e/ou da qualidade oocitária / Introduction: Previous studies with budding yeasts evidenced an important role of amyloid substances (AS) in the regulation of gametogenesis, questioning its potential as a marker of gametic quality. However, to date, no study has evaluated the presence of AS in mammalian oocytes and embryos. Objectives: To describe the presence, to characterize the distribution pattern and to compare AS levels in mature oocytes and preimplantation embryos using murine model. Identify, characterize the distribution pattern and quantify AS in human oocytes at different stages of development (GV- germinal vesicle, MImetaphase I and MII-metaphase II) and establish the correlation between oocytes AS levels and clinical characteristics of patients undergoing control ovarian stimulation (COE) for in vitro fertilization (IVF). Methods: An experimental prospective pilot study was carried out using 20 mature oocytes and 200 preimplantation mouse embryos (1-cell, 2-cell, 4-cell, 8- cell and blastocysts) and 46 immature and in vitro mature human oocytes donated from 11 consenting patients submitted to COE for IVF. Frozen MII oocytes and mouse preimplantation embryos, immediately after thawing, were fixed for immunostaining for visualization of AS by confocal microscopy and by transmission electron microscopy. Immature (GV and MI) and in vitro mature (GV Arrested, MI, MI Arrested and MII) human oocytes were also fixed and immunostained for AS evaluation, using the same antibody, by confocal microscopy. Fluorescence intensity from immunofluorescent staining and data from confocal microscopy were quantified using ImageJ program. Results: In all samples (mice and humans), immunostaining for AS appears throughout the zona pellucida, as well as in the cytoplasm and nucleus of oocytes, polar bodies, and preimplantation embryos. In mouse, 2-cell embryos exhibited higher levels of AS (69000187,4 SD 6733098,1 a.u.) when compared to the other stages of development (p <0.0001). Electron microscopy confirmed the presence of AS in mouse oocytes and preimplantation embryos. In humans, fresh GV stage oocytes exhibited higher levels of AS (4164.7 SD 1573.5 a.u.) when compared to MI and MII oocytes (p = 0.008). A negative association was found between levels of AS and patient body mass index (BMI) (-0.54; p = 0.0007), number of days of control ovarian stimulation (-0.44; p = 0.002); (-0.34, p = 0.002), dose of gonadotropin used, time between oocyte retrieval and fixation (-0.33; p = 0.02) and time after the hCG trigger (-0.33; p = 0.02). Significantly higher levels of AS were found in patients with AMH between 1 and 3 ng/ml, compared to <1 ng/ml (4592.7 SD 2126.3 a.u. vs. 737, 3 SD 14.7 a.u.; p = 0.0002) and > 3 ng/ml (4592.7 SD 2126.2 a.u. vs. 3197.3 SD 895.0 a.u.; p = 0.006). Conclusions: We demonstrate for the first time the presence, distribution, and change in AS throughout mouse and human oocyte maturation, and mouse embryonic development. Two-cell mouse embryos and GV human oocytes had the highest levels of AS. We also determine associations between AS in human oocytes with good prognosis clinical characteristics in patients submitted to IVF, such as low BMI and normal AMH values. Considering that AS are involved in fundamental mechanisms related to pathological cell changes, as well as in the19 conclusion of cell division process, future studies should investigate their possible role as a biomarker of oocyte aging and/or quality

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Resumo: Análises morfológicas para seleção de oócitos podem subestimar os gametas femininos em relação ao seu potencial de desenvolvimento, pela subjetividade da técnica por identificar apenas alterações aparentes em microscopia de luz. Este método pode não ser capaz de avaliar por exemplo, a competência a nível molecular, nuclear e citoplasmática do oócito, como perfil de transcritos acumulados, organização de organelas e vias de apoptose ativas. Portanto, sob a hipótese que grânulos citoplasmáticos em oócitos não alteram a capacidade de desenvolvimento, a qualidade dos embriões gerados e o desenvolvimento embrionário e fetal, o objetivo do nosso estudo foi avaliar os efeitos de grânulos citoplasmáticos na produção in vitro de embriões. Para testar esta hipótese, utilizamos o modelo bovino em dois experimentos para avaliar grupos de oócitos com citoplasma homogêneo (controle) e oócitos que apresentam granulações no citoplasma (granular). No experimento 1, através de amostras de ovários de abatedouro, observamos que: i. Nas análises de perfil funcional do oócito, estruturas que possuem grânulos citoplasmáticos apresentam maiores níveis de caspase 3 ativa (indicador da cascata de apoptose), no entanto não demonstram nenhuma diferença em relação a atividade de junções GAP (comunicação oócito-células do cumulus), ii: Nas análises de expressão de genes marcadores de qualidade realizadas em oócitos, blastocistos e células do cumulus, apenas o transcrito ZAR1 foi diferencialmente expresso,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Morphological analysis for oocyte selection may underestimate female gametes in regarding their developmental potential, due to the technique subjectivity for only identifies apparent changes in light microscopy. This method may not be able to evaluate for example the molecular, nuclear and cellular oocyte competence, such as transcript profile accumulations, organelles organization and active apoptosis pathways. Therefore, under the hypothesis that oocytes cytoplasmic granules do not alter the development capacity, embryos quality and embryonic and fetal development, the study objective was to evaluate cytoplasmic granules effects on in vitro embryo production. To test this hypothesis we used bovine model in two experiments to evaluate groups of homogeneous cytoplasm oocytes (control) and granular cytoplasm oocytes (granular). In experiment 1, through slaughterhouse ovarian samples we observed: i. In the analysis of oocyte functional profile structures that have cytoplasmic granules have higher active caspase 3 levels (apoptosis cascade indicator), but do not show any difference in GAP junction activity (oocyte-cumulus cell communication). ii. In the analysis of quality marker gene expression performed in oocytes, blastocysts and cumulus cells, only the ZAR1 transcript was differentially expressed and poorly detected in granular group oocytes and iii. In embryonic development rates (cleavage, blastocyst) and kinetics analysis we did not detect differences between the groups.... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O objetivo desse estudo foi avaliar se a baixa fertilidade de vacas Holandesas repetidoras de serviço [RS; comparativamente a novilhas (NOV) e vacas próximas ao pico de lactação (PL)] está associada com comprometimento da qualidade oocitária e se esta condição é agravada pelo estresse térmico. Fêmeas das três categorias foram tratadas com o mesmo protocolo de sincronização da emergência de onda folicular. Cinco dias após o início do protocolo, a ovum pick-up (OPU) foi realizada e foram avaliados (Capítulo; Cap. 1) o número de folículos ovarianos, de oócitos totais e viáveis, temperatura retal (TR), temperatura de superfície cutânea (TC) e frequência respiratória (FR). Os oócitos viáveis foram utilizados para a produção in vitro de embriões (Cap. 2) e avaliações biomoleculares (Cap. 3). No Cap. 2, foram avaliados o desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, de blastocisto e de eclosão) e a qualidade dos embriões produzidos (número de células e frequência de núcleos fragmentados). No Cap. 3, realizou-se a extração de RNA e DNA de parte dos oócitos coletados para a quantificação relativa e absoluta de DNA mitocondrial (mtDNA) e a avaliação da expressão de genes relacionados à replicação/transcrição do mtDNA (PPARGC1A, NRF1, POLG, POLG2, TFAM e MT-CO1), à apoptose (BAX, BCL2 e ITM2B) e ao estresse térmico (HSP90AA1 e HSPA1AB). No Cap. 4, a taxa de concepção após IATF foi avaliada em ambas as estações do ano e nas três categorias quando o mesmo protocolo de sincronização para IATF e a mesma partida de sêmen foram utilizados. No Cap. 1, vacas RS e PL aumentaram sua FR e TR no verão em relação ao inverno (P<0,0001), enquanto as NOV mantiveram essas variáveis constantes em ambas as estações. Nas três categorias houve aumento (P<0,0001) da TC no verão, mas esta sempre foi superior (P<0,001) em vacas RS e PL do que nas NOV, independente da estação. O número de folículos e de oócitos totais e viáveis declinou nas RS e PL durante o verão, mantendo-se semelhante em NOV em ambas as estações. No Cap. 2, a taxa de clivagem foi semelhante entre categorias e estações. Já a taxa de blastocisto foi reduzida no verão nas três categorias, sendo essa queda mais acentuada nas RS. A taxa de eclosão e o número de células dos blastocistos foram menores no verão (independente de categoria). Menor número de células foi observado em embriões de RS e PL (independente da estação). Além disso, a porcentagem de núcleos fragmentados foi maior nos blastocistos das RS no verão. No Cap. 3, a expressão de ITM2B e BAX foi maior em RS durante o verão. Ainda, detectaram-se indícios da ativação de mecanismos pró-apoptóticos nos oócitos de RS (maior relação BAX/BCL-2) comparadas a PL e de mecanismos compensatórios da deficiência da função mitocondrial (menor conteúdo de mtDNA e maior expressão de PPARGCC1, NRF1, TFAM, POLG e POLG2) nas RS durante o verão em relação as demais categorias. No Cap. 4, menor taxa de concepção foi observada em RS e durante o verão. Os resultados geram evidências de que o baixo desempenho reprodutivo de vacas RS durante o verão deva estar relacionado ao comprometimento da qualidade de seus oócitos, demonstrado pelo seu reduzido conteúdo de mtDNA e elevada expressão de genes relacionados a replicação/transcrição do mtDNA, apoptose e síntese de chaperonas, culminado em baixa taxa de blastocisto e alta fragmentação nuclear destes. / The aims of the present study were to evaluate whether lower fertility of repeat-breeder (RB) Holstein cows [compared to peak lactation cows (PL) and heifers (H)] is associated with oocyte quality and whether this condition is aggravated by summer heat stress. Females of the three categories were treated with same protocol for synchronization of follicular wave emergence during summer and winter. Five days after the protocol onset, the ovum pick-up (OPU) was performed. The following variables were evaluated in Chapter 1: number of ovarian follicles before OPU, number of total and viable oocytes, rectal temperature (RT), cutaneous temperature (CT) and respiration rate (RR). Viable oocytes were sent forThe aims of the present study were to evaluate whether lower fertility of repeat-breeder (RB) Holstein cows [compared to peak lactation cows (PL) and heifers (H)] is associated with oocyte quality and whether this condition is aggravated by summer heat stress. Females of the three categories were treated with same protocol for synchronization of follicular wave emergence during summer and winter. Five days after the protocol onset, the ovum pick-up (OPU) was performed. The following variables were evaluated in Chapter 1: number of ovarian follicles before OPU, number of total and viable oocytes, rectal temperature (RT), cutaneous temperature (CT) and respiration rate (RR). Viable oocytes were sent for in vitro embryo production (Chapter 2) and bimolecular evaluation (Chapter 3). In Chapter 2, embryo development (rates of cleavage, blastocyst and hatching) and quality (total number of nuclei and frequency of nuclear fragmentation) were assessed. In Chapter 3, part of the oocytes were subjected to DNA and RNA extraction to allow relative and absolute quantification of mitochondrial DNA (mtDNA), and the evaluation of the expression of genes related to mtDNA replication/transcription (PPARGC1A, NRF1, POLG, POLG2, TFAM and MT-CO1), apoptosis (BAX, BCL2 and ITM2B) and heat stress (HSP90AA1 e HSPA1AB). In Chapter 4, RB, PL and H were subjected to same protocol for fixed-time AI using the same batch of semen of a single sire in order to evaluate their P/AI during summer and winter. In Chapter 1, RB and PL had increased (P<0.0001) RR and RT during summer compared to winter; while H maintained similar RR and RT in both seasons. CT was greater (P<0.0001) during summer than winter in all categories, but it was always higher (P<0.001) in RB and PL than H, regardless of season. The numbers of follicles and total and viable oocytes were lower in RB and PL during summer than winter, and maintained stable in H in both seasons. In Chapter 2, cleavage rate was similar among categories and between seasons. However, blastocyst rate was invariably reduced during summer, but more pronouced in RB. Hatching rate and the total number of nuclei were decreased during summer, regardless of category. Lower number of nuclei was observed in RB and PL embryos compared to H, regardless of the season. Furthermore, the percentage of fragmented nuclei was greater in RB blastocysts during the summer. In Chapter 3, expressions of ITM2B and BAX were greater in RB oocytes collected during summer. Also, the activation of pro-apoptotic mechanisms (greater BAX/BCL2 ratio) was suggested in RB heat stressed-oocytes compared with PL. Activation of compensatory mechanisms of deficient mitochondrial function (low number of copies of mtDNA and increased expression of PPARGCC1, NRF1, TFAM, POLG and POLG2) were also observed in RB heat stressed-oocytes compared with PL and H. In Charpter 4, lower P/AI was observed in RB and under summer heat stress. These data provide evidences that the lower reproduction performance observed in RB during heat stress may be due to impaired oocyte quality, as shown by their reduced mtDNA content and upregulation of several genes related to mtDNA replication/transcription, apoptosis and chaperones synthesis, resulting in lower blastocyst rate and higher nuclear fragmentation of embryos.

O objetivo desse estudo foi avaliar se a baixa fertilidade de vacas Holandesas repetidoras de serviço [RS; comparativamente a novilhas (NOV) e vacas próximas ao pico de lactação (PL)] está associada com comprometimento da qualidade oocitária e se esta condição é agravada pelo estresse térmico. Fêmeas das três categorias foram tratadas com o mesmo protocolo de sincronização da emergência de onda folicular. Cinco dias após o início do protocolo, a ovum pick-up (OPU) foi realizada e foram avaliados (Capítulo; Cap. 1) o número de folículos ovarianos, de oócitos totais e viáveis, temperatura retal (TR), temperatura de superfície cutânea (TC) e frequência respiratória (FR). Os oócitos viáveis foram utilizados para a produção in vitro de embriões (Cap. 2) e avaliações biomoleculares (Cap. 3). No Cap. 2, foram avaliados o desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, de blastocisto e de eclosão) e a qualidade dos embriões produzidos (número de células e frequência de núcleos fragmentados). No Cap. 3, realizou-se a extração de RNA e DNA de parte dos oócitos coletados para a quantificação relativa e absoluta de DNA mitocondrial (mtDNA) e a avaliação da expressão de genes relacionados à replicação/transcrição do mtDNA (PPARGC1A, NRF1, POLG, POLG2, TFAM e MT-CO1), à apoptose (BAX, BCL2 e ITM2B) e ao estresse térmico (HSP90AA1 e HSPA1AB). No Cap. 4, a taxa de concepção após IATF foi avaliada em ambas as estações do ano e nas três categorias quando o mesmo protocolo de sincronização para IATF e a mesma partida de sêmen foram utilizados. No Cap. 1, vacas RS e PL aumentaram sua FR e TR no verão em relação ao inverno (P<0,0001), enquanto as NOV mantiveram essas variáveis constantes em ambas as estações. Nas três categorias houve aumento (P<0,0001) da TC no verão, mas esta sempre foi superior (P<0,001) em vacas RS e PL do que nas NOV, independente da estação. O número de folículos e de oócitos totais e viáveis declinou nas RS e PL durante o verão, mantendo-se semelhante em NOV em ambas as estações. No Cap. 2, a taxa de clivagem foi semelhante entre categorias e estações. Já a taxa de blastocisto foi reduzida no verão nas três categorias, sendo essa queda mais acentuada nas RS. A taxa de eclosão e o número de células dos blastocistos foram menores no verão (independente de categoria). Menor número de células foi observado em embriões de RS e PL (independente da estação). Além disso, a porcentagem de núcleos fragmentados foi maior nos blastocistos das RS no verão. No Cap. 3, a expressão de ITM2B e BAX foi maior em RS durante o verão. Ainda, detectaram-se indícios da ativação de mecanismos pró-apoptóticos nos oócitos de RS (maior relação BAX/BCL-2) comparadas a PL e de mecanismos compensatórios da deficiência da função mitocondrial (menor conteúdo de mtDNA e maior expressão de PPARGCC1, NRF1, TFAM, POLG e POLG2) nas RS durante o verão em relação as demais categorias. No Cap. 4, menor taxa de concepção foi observada em RS e durante o verão. Os resultados geram evidências de que o baixo desempenho reprodutivo de vacas RS durante o verão deva estar relacionado ao comprometimento da qualidade de seus oócitos, demonstrado pelo seu reduzido conteúdo de mtDNA e elevada expressão de genes relacionados a replicação/transcrição do mtDNA, apoptose e síntese de chaperonas, culminado em baixa taxa de blastocisto e alta fragmentação nuclear destes. / The aims of the present study were to evaluate whether lower fertility of repeat-breeder (RB) Holstein cows [compared to peak lactation cows (PL) and heifers (H)] is associated with oocyte quality and whether this condition is aggravated by summer heat stress. Females of the three categories were treated with same protocol for synchronization of follicular wave emergence during summer and winter. Five days after the protocol onset, the ovum pick-up (OPU) was performed. The following variables were evaluated in Chapter 1: number of ovarian follicles before OPU, number of total and viable oocytes, rectal temperature (RT), cutaneous temperature (CT) and respiration rate (RR). Viable oocytes were sent forThe aims of the present study were to evaluate whether lower fertility of repeat-breeder (RB) Holstein cows [compared to peak lactation cows (PL) and heifers (H)] is associated with oocyte quality and whether this condition is aggravated by summer heat stress. Females of the three categories were treated with same protocol for synchronization of follicular wave emergence during summer and winter. Five days after the protocol onset, the ovum pick-up (OPU) was performed. The following variables were evaluated in Chapter 1: number of ovarian follicles before OPU, number of total and viable oocytes, rectal temperature (RT), cutaneous temperature (CT) and respiration rate (RR). Viable oocytes were sent for in vitro embryo production (Chapter 2) and bimolecular evaluation (Chapter 3). In Chapter 2, embryo development (rates of cleavage, blastocyst and hatching) and quality (total number of nuclei and frequency of nuclear fragmentation) were assessed. In Chapter 3, part of the oocytes were subjected to DNA and RNA extraction to allow relative and absolute quantification of mitochondrial DNA (mtDNA), and the evaluation of the expression of genes related to mtDNA replication/transcription (PPARGC1A, NRF1, POLG, POLG2, TFAM and MT-CO1), apoptosis (BAX, BCL2 and ITM2B) and heat stress (HSP90AA1 e HSPA1AB). In Chapter 4, RB, PL and H were subjected to same protocol for fixed-time AI using the same batch of semen of a single sire in order to evaluate their P/AI during summer and winter. In Chapter 1, RB and PL had increased (P<0.0001) RR and RT during summer compared to winter; while H maintained similar RR and RT in both seasons. CT was greater (P<0.0001) during summer than winter in all categories, but it was always higher (P<0.001) in RB and PL than H, regardless of season. The numbers of follicles and total and viable oocytes were lower in RB and PL during summer than winter, and maintained stable in H in both seasons. In Chapter 2, cleavage rate was similar among categories and between seasons. However, blastocyst rate was invariably reduced during summer, but more pronouced in RB. Hatching rate and the total number of nuclei were decreased during summer, regardless of category. Lower number of nuclei was observed in RB and PL embryos compared to H, regardless of the season. Furthermore, the percentage of fragmented nuclei was greater in RB blastocysts during the summer. In Chapter 3, expressions of ITM2B and BAX were greater in RB oocytes collected during summer. Also, the activation of pro-apoptotic mechanisms (greater BAX/BCL2 ratio) was suggested in RB heat stressed-oocytes compared with PL. Activation of compensatory mechanisms of deficient mitochondrial function (low number of copies of mtDNA and increased expression of PPARGCC1, NRF1, TFAM, POLG and POLG2) were also observed in RB heat stressed-oocytes compared with PL and H. In Charpter 4, lower P/AI was observed in RB and under summer heat stress. These data provide evidences that the lower reproduction performance observed in RB during heat stress may be due to impaired oocyte quality, as shown by their reduced mtDNA content and upregulation of several genes related to mtDNA replication/transcription, apoptosis and chaperones synthesis, resulting in lower blastocyst rate and higher nuclear fragmentation of embryos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-10Bitstream added on 2014-06-13T18:39:05Z : No. of bitstreams: 1 miguel_mcv_me_jabo.pdf: 1104174 bytes, checksum: b2be0e2d9f0acd211260bc64835b4e10 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O presente trabalho teve como objetivo avaliar, em novilhas da raça Nelore (n=84) mantidas em duas alturas de pasto (15 e 35 cm) e com suplementação isoproteica (26%PB) ou com dois níveis de proteína (24,7%PB e 13,1%PB) associada à gordura insaturada protegida, as concentrações plasmáticas de progesterona, do colesterol, da glicose, do peso e da qualidade do complexo cumulus oophorus. Os suplementos do experimento 1 foram isoproteicos e divididos em: SL1: Grupo controle suplementado com sal mineral; FA1: Grupo suplementado com alta relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, farelo de algodão, Megalac-E®, minerais e uréia (26% PB e 81% NDT) e GT1: Grupo suplementado com baixa relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, glutenose, Megalac-E®, minerais e uréia (26% PB e 81% NDT). Os suplementos do experimento 2 diferiram na porcentagem de PB divididos em: SL2: Grupo controle suplementado com sal mineral; FA2: Grupo suplementado com alta relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, farelo de algodão, Megalac-E®, minerais e uréia (24,7% PB e 89,4% NDT) e GT2: Grupo suplementado com baixa relação PDR/NDT composto por polpa cítrica, glutenose, Megalac-E®, minerais e uréia (13,1% PB e 95% NDT). Para mensuração das concentrações de progesterona, glicose e colesterol foram realizadas coletas de sangue por venopunção da veia jugular no início do experimento e, posteriormente, a cada período de 28 dias juntamente com as pesagens (Dezembro a Maio). As análises plasmáticas de glicose foram determinadas pelo método God-Trinder, as análises séricas de colesterol pelo método Enzimático-Trinder e a concentração de progesterona plasmática foi determinada por RIA. As três mensurações foram realizadas utilizando kits comerciais. No momento do abate, os ovários das novilhas foram coletados, separados nos três... / This study aimed to evaluate in Nelore heifers (n=84) under two different grass heights (15 and 35cm) and supplemntes with isinitrogenous (26 % CP) or two protein leves (24,7 % CP and 13,1% CP) associated with unsaturated fat protected to assess plasma concentrations of progesterone, cholesterol, glucose, weight and quality of the cumulus oophorus complex. Supplements isonitrogenous of Experiment 1 were divided into SL1: control group supplemented with mineral salt; FA1: group supplemented with high for RDP / TDN composed of citrus pulp, cottonseed meal, Megalac-E®, minerals and urea (26 % CP and 81% TDN) and GT1: group supplemented with low ratio RDP / TDN composed of citrus pulp, corn gluten meal, Megalac-E®, minerals and urea (26% CP and 81% TDN). Supplements of Experiments 2 differed in the percentage of CP were divided into SL2: control group supplementes with mineral salt; FA2: group supplementes with high ratio for RDP/TDN composed of citrus pulp, cottonseed meal, Megalac -E® , minerals and urea (24,7% CP e 89,4% TND) and GT2: Group supplemented with low ratio RDP/TDN composed of citrus pulp, corn gluten meal, Megalac-E®, minerals and urea (13,1% CP e 95% TND). To measure the concentrations of progesterone, glucose and cholesterol blood was collected from the jugular vein at baseline each 28 days together the weights (December to May).The analysis of serum glucose were determined by God-Trinder method and analysis of cholesterol by the enzyme-Trinder method using the commercial kits. Plasma progesterone concentration was determined using a commercial kit for RIA. At the time of slaughter, the ovaries of heifers were collected, separated into three groups of supplementation, and transported to the laboratory in saline solution at 32-36ºC. The antral follicles with diameters between 3 and 8 mm were... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by biblioteca unifenas (biblioteca@unifenas.br) on 2017-05-15T14:52:32Z No. of bitstreams: 1 Asafe Costa Lopes Dissertacao.pdf: 1929011 bytes, checksum: 1dc4bf9c485be92cb6513c5cc951df87 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-15T14:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Asafe Costa Lopes Dissertacao.pdf: 1929011 bytes, checksum: 1dc4bf9c485be92cb6513c5cc951df87 (MD5) Previous issue date: 2016-08-03 / In last years it has been noted increasing utilization of in vitro embryo production (IVEP) in dairy breeds production. In this context, is known that differences in the number and development potential of oocytes between European (Bos taurus taurus) and Zebu (Bos indicus taurus) cows affect extremely the efficiency and economic viability of IVEP. Since, insulin-like growth factor (IGF) system is related to developmental capacity of oocytes, the aim of this study was to quantify mRNA abundance of IGF system members in cumulus oocytes complex (COCs) from Gir, Holstein and 1/2 Holstein x 1/2 Gir donor cows. Pools of 30 immature COCs from Gir (n=4 pools), Holstein (n=4 pools) and 1/2 Holstein x 1/2 Gir donor cows (n=4 pools) were obtained by ovum pick-up on farms in the southern region of Minas Gerais state, Brazil. Oocytes and cumulus cells were mechanically separated and stored in liquid nitrogen. Only selected COCs were analyzed with homogeneous cytoplasm and surrounded by, at least, three layers of compact cumulus cells were selected for the experiment. Total RNA was extracted from pools of 30 oocytes and their respective cumulus cells using the RNeasy® kit (Qiagen). The investigation of target genes (IGF1 and IGF2), their receptors (IGFR1 and IGFR2), as well as IGF binding proteins (IGFBP2, IGFBP4), and pregnancy-associated plasma protein-A (PAPPA) was assessed by real time RT-PCR using Power SYBR® green master mix (Applied Biosystems) and normalized by Cyclophilin (CYC-A). Relative quantification of mRNA abundance was determined using the ΔΔCt method with correction by Pfaffl’s equation. Effects of breeds on the expression of target genes in oocytes and cumulus cells were tested by ANOVA and means were compared by Tukey-Kramer HSD test. Differences were considered significant when P<0.05. In oocytes, mRNA encoding IGFR1 was higher in Gir compared to Holstein and 1/2 Holstein x 1/2 Gir animals. The relative mRNA abundance of IGF2, IGFR2 and IGFBP4 was higher in the cumulus cells of Holstein donor compared to Gir cows. The mRNA abundance of PAPPA was higher in cumulus cells and oocytes in Gir and 1/2 Holstein x 1/2 Gir donor cows compared to the Holstein donors. No differences on mRNA abundance of IGF1, IGF2, IGFR2, IGFBP2 and IGFBP4 in oocytes and IGF1, IGFR1 and IGFBP2 in cumulus cells were demonstrated among different breeds. In conclusion, the higher PAPPA mRNA abundance in oocyte and cumulus cells from Gir and 1/2 Holstein x 1/2 Gir donors associated with low expression of IGFBP4 in cumulus cells of these breeds, suggest more efficient degradation of IGFBPs, which results in greater bioavailability of IGF in Gir and crossbred (1/2 Holstein x 1/2 Gir) COCs when compared to the Holstein immature COCs. / Nos últimos anos observou-se um aumento expressivo do uso da Produção In-vitro de Embriões (PIVE) em raças bovinas leiteiras. Neste contexto, é conhecido que as diferenças na quantidade e no potencial de desenvolvimento oocitário entre fêmeas de raças europeias (Bos taurus taurus) e zebuínas (Bos indicus taurus) afetam consideravelmente a eficiência e a viabilidade econômica da PIVE. Sabendo que o sistema dos fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF) está relacionado à capacidade de desenvolvimento dos oócitos, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de genes do sistema IGF nos complexos cumulus oócitos (COCs) oriundos de doadoras das raças Gir, Holandesa e mestiças F1 (1/2 Holandesa x 1/2 Gir). Os COCs imaturos foram recuperados por aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU) em fazendas na região sul do estado de Minas Gerais, Brasil. Os oócitos e as células do cumulus provenientes de grupos de 30 COCs (n=4/raça) foram mecanicamente separados e armazenados em nitrogênio líquido. Foram selecionados para as análises somente COCs classificados como grau 1 e viáveis. O RNA total foi extraído de “pools” de 30 oócitos e das células do cumulus correspondentes utilizando o kit RNeasy® (Qiagen). A expressão dos genes alvo (IGF1 e IGF2), seus receptores (IGFR1 e IGFR2), proteínas de ligação aos IGFs (IGFBP2 e IGFBP4) e proteína de inativação IGFBPase ( também conhecida como “Proteína Plasmática Associada a Gravidez”; PAPP-A), foi investigada por RT-PCR em tempo real utilizando o sistema Power Sybr® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e normalizada pela Ciclofilina-A (CYC-A). A quantificação relativa do RNAm foi determinada pelo método de ΔΔCt com correção de eficiência. Os efeitos das diferentes raças sobre a expressão dos genes alvo nos oócitos e nas células do cumulus foram testados por ANOVA e os grupos foram comparados pelo teste de Tukey-Kramer HSD. O nível de significância foi considerado P<0,05. Nos oócitos houve uma maior expressão do RNAm codificante para IGFR1 em doadoras Gir em relação às 1/2 Holandesa x 1/2 Gir e Holandesas. A abundância relativa de RNAm do IGF2, IGFR2 e IGFBP4 foi maior nas células do cumulus de vacas Holandesas quando comparado às vacas Gir e 1/2 Holandesa x 1/2 Gir. A expressão do RNAm da enzima PAPP-A foi maior nas células do cumulus e nos oócitos das doadoras Gir e 1/2 Holandesa x 1/2 Gir em comparação com as Holandesas. Não houve alteração na expressão dos genes IGF1, IGF2, IGFR2, IGFBP2 e IGFBP4 nos oócitos, assim como dos genes IGF1, IGFR1 e IGFBP2 nas células do cumulus entre as raças. Em conclusão, a maior expressão de PAPP-A nos oócitos e células do cumulus de COCs provenientes de doadoras das raças Gir e 1/2 Holandês x 1/2 Gir associada à baixa expressão de IGFBP4 nas células do cumulus destas, sugere uma degradação mais eficiente das IGFBPs, resultando em maior biodisponibilidade dos IGFs em COCs imaturos das raças Gir e meio sangue (1/2 Holandesa x 1/2 Gir) quando comparado com COCs da raça Holandesa.

Introdução: Apesar de controverso, questiona-se um papel deletério da endometriose nos resultados de procedimentos de reprodução assistida, o que pode estar relacionado ao comprometimento da qualidade oocitária. Para que o oócito maduro esteja preparado para a fertilização, é necessário que o fuso meiótico mantenha a sua integridade e funcionabilidade. Objetivos: Comparar a presença e localização do fuso meiótico e o estágio de maturação nuclear de oócitos com o primeiro corpúsculo polar (CP) visível de pacientes inférteis sem e com endometriose. Comparar os resultados de Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) entre os oócitos em telófase I e metáfase II, e entre aqueles com e sem fuso celular visível, nos grupos analisados. Metodologia: Estudo prospectivo e controlado com pacientes inférteis, submetidas à estimulação ovariana para realização de ICSI, selecionadas consecutivamente e divididas em dois grupos: Controle (fator tubário e/ou masculino) e Endometriose (subdividido em endometriose mínima e leve I/II versus moderada e severa III/IV). Os oócitos com extrusão do primeiro CP foram avaliados pela microscopia de polarização imediatamente antes da realização da ICSI e caracterizados quanto à presença/localização do fuso celular em relação ao primeiro CP e ao estágio de maturação nuclear (telófase I ou metáfase II). Foram analisados as taxas de fertilização, clivagem, número de embriões de boa qualidade no segundo (D2) e terceiro (D3) dia de desenvolvimento oriundos dos oócitos em telófase I versus metáfase II, e metáfase II com fuso visível versus sem fuso visível, nos grupos controle, endometriose, endometriose I/II e endometriose III/IV. Resultados: Foram analisados 441 oócitos, sendo 254 do grupo controle e 187 do grupo endometriose (115 do grupo endometriose I/II e 72 do grupo endometriose III/IV). Não observamos diferença significativa entre a percentagem de oócitos em metáfase II com fuso celular visível e não visível (88,6%, 91,3%, 88,2%, respectivamente, nos grupos controle, endometriose I/II e endometriose III/IV) e entre a percentagem de oócitos com fuso celular nas diferentes localizações nos grupos avaliados. Entre os oócitos aparentemente maduros, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I no grupo endometriose III/IV (5,6%) quando comparado ao grupo endometriose I/II (0%). Observamos uma tendência a menores taxas de fertilização dos oócitos injetados em telófase I quando comparados aos em metáfase II, nos grupos controle (p=0,08), endometriose (p=0,05) e endometriose III/IV (p=0,09). Comparando-se os oócitos com e sem fuso celular visível, não observamos diferença significativa nos resultados de ICSI entre os grupos analisados. Conclusão: Não observamos diferença significativa entre os grupos analisados quanto à visualização e localização do fuso celular em oócitos maturados in vivo com o primeiro CP visível. Todavia, observamos um aumento significativo de oócitos em telófase I nas portadoras de endometriose moderada e severa, sugerindo um retardo ou comprometimento na conclusão da meiose I. Considerando que os oócitos injetados em telófase I apresentam piores taxas de fertilização do que os injetados em metáfase II, este achado poderia justificar o comprometimento dos resultados de reprodução assistida em mulheres inférteis com endometriose moderada e severa, além de ser utilizado com ferramenta prognóstica pós-ICSI. / Introduction: Although it has been a controversial issue for decades, a deleterious role of endometriosis on assisted reproductive techniques (ART) outcomes is questioned, which may be related to oocyte quality. For a mature oocyte be prepared for fertilization is necessary that the meiotic spindle keeps its integrity and its function. Objectives: To compare the presence and localization of the meiotic spindle and the oocyte nuclear maturation with the visible first polar body of infertile patients with and without endometriosis. To compare ICSI outcomes between oocytes on telophase I and metaphase II, and the ones with and without visible meiotic spindle, on those two groups. Methodology: A prospective and controlled study with infertile patients who underwent ovarian stimulation for purposes of ICSI, selected consecutively and divided into two groups: control (tubal and/or male factor) and endometriosis (subdivided in minimum and mild stage I/II versus moderate and severe stage III/IV). The oocytes with the first polar body extruded (in vivo matured oocytes) were imaged using a polarization microscopy immediately before ICSI and characterized according to the presence and localization of meiotic spindle and its relation to the first polar body and the nuclear maturation stage (telophase I and metaphase II). We have analyzed the fertilization rates, clivage, number of good quality embryos on the second (D2) and third (D3) day of development from oocytes on telophase I versus the ones on metaphase II, and metaphase II visible spindle versus the non-visible ones, on the control groups, endometriosis, endometriosis stage I/II and endometriosis stage III/IV. Results: A total of 441 oocytes were analyzed, 254 oocytes form the control group and 187 from the endometriosis one (115 from endometriosis stage I/II and 72 from endometriosis stage III/IV). No significant differences between the percentage of metaphase II with visible and non-visible meiotic spindle were found (88,6%, 91,3%, and 88,2%, in the control, endometriosis I/II and endometriosis III/IV groups, respectively). Among the apparently matured oocytes, we have observed a significant increase of oocytes on telophase I on the endometriosis III/IV group (5,6%) when compared with the endometriosis I/II group (0%). We have observed a tendency to fewer fertilization rates from the injected oocytes on telophase I when compared with the ones on metaphase II, on the control group (p=0,08), endometriosis (p=0,05) and endometriosis III/IV group (p=0,09). When we compared oocytes with and without visible meiotic spindle, we found no significant difference on ICSI outcomes among the studied groups. Conclusions: We have found no significant difference among the studied groups regarding the visualization and localization of the meiotic spindle from in vivo matured oocytes with a visible first polar body. However, we have observed a significant increase on the number of oocytes on telophase I from patients with moderate and severe endometriosis, suggesting a delay or an impairment in the completion of meiosis I. Since the injected oocytes on telophase I present a worse fertilization rates than the ones injected on metaphase II, this finding could explain the impairment on the outcomes of ART in infertile women with moderate and severe endometriosis, besides it could be used as a prognosis tool after ICSI procedures.

Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose não foram totalmente elucidados. A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave (estadios III e IV, respectivamente) seria, parcialmente, decorrente de alterações anatômicas pélvicas associadas à endometriose. Entretanto, há evidências de que lesões sutis ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (estágio mínimo e leve) também poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade. Uma pior qualidade oocitária pode estar envolvida nas menores taxas de implantação após fertilização in vitro encontradas nessas pacientes. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, as quais poderiam afetar a aquisição de competência oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença. Sabe-se que, para ser competente e poder ser fertilizado, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso morfologicamente funcional, que garanta a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com e sem endometriose leve sobre a integridade do fuso, alinhamento cromossômico e organização dos microfilamentos de actina de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de fluido follicular foram consecutivamente obtidas de 22 pacientes inférteis (11 com endometriose leve e 11 com infertilidade por fator tubário e/ou masculino) submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) sem adição de fluido follicular (sem fluido) e com 4 concentrações (1%, 5%, 10%, e 15%) de duas amostras de fluido folicular (uma de paciente com endometriose e outra de paciente sem endometriose). Foram realizadas 11 MIVs e cada amostra de fluido follicular foi usada apenas uma vez. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência para visualização morfológica de microtúbulos, cromatina e microfilamentos de actina e, então, analisados por microscopia confocal. A porcentagem de anormalidade de oócitos em MII (fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados) foi significativamente maior naqueles maturados com FF de pacientes com endometriose (1%: 55,56%, 5%: 63,26%, 10%: 54,54%, 15%: 48,84%) quando comparados com oócitos maturados com FF de pacientes controles (1%: 19,15%, 5%: 23,44%, 10%: 25%, 15%: 23,81%) e oócitos maturados sem fluido (23,53%), sem haver diferença entre as concentrações testadas em cada grupo. Pode-se concluir que oócitos bovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres inférteis com endometriose leve têm maior freqüência de anormalidade meiótica. Estes dados sugerem que o FF de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade oocitária por promover danos ao fuso e/ou cromossomos / The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. The infertility presented by patients with moderate and severe disease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes associated with endometriosis. However, there are evidences that subtle lesions or endometriosis implants in the early stages (stages I and II) might also contribute to the etiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that to be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an experimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF (1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis). We performed 11 IVM and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments, and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48.84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23.44%, 10%: 25%, 15%: 23.81%) and those matured without FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage