Abstract
Drug metabolite profiling and identification studies are nowadays regularly conducted with liquid chromatography (LC) coupled with mass spectrometry (MS) as an analytical tool. The speed, selectivity and sensitivity of modern LC–MS instruments have been significantly increased in recent years. Especially the use of ultra-high-performance LC (UHPLC) in combination with a modern high-resolution MS instrument offers high full scan detection sensitivity, mass accuracy and the detection of both expected and unexpected metabolites in a single LC–MS run. The present study showed that no single LC–MS conditions were suitable for the analysis of a large group of structurally diverse compounds. The testing of optimum conditions for each individual compound led to more high-quality data when chromatographic retention behavior and mass spectrometric ionization efficiency for in vitro metabolite profiling were considered. The developed LC–MS methods were applicable for measuring both the disappearance of the parent compound and the formation of metabolites. Tentative metabolite identification was based on the measured accurate mass time-of-flight (TOF) MS data. In the second part, a rapid and sensitive assay was designed and built for the trapping, screening and characterization of reactive metabolites in vitro. In total, 78 trapped reactive metabolite conjugates were detected and identified based on accurate mass data using 12 structurally different test compounds. The majority of the detected conjugates were reported for the first time. Amine-containing compounds, that formed methylated and cyanide-trapped products after CYP-mediated reaction steps in human liver microsomal (HLM) incubations, were studied further. The observed methylated cyano conjugates were shown to be experimental artifacts, i.e., metabonates. The study also describes the use of traditional high-performance LC (HPLC) and the more modern UHPLC coupled to time-of-flight, triple quadrupole and hybrid linear ion trap mass spectrometers in drug metabolism studies, and reviews on how to choose the most suitable LC–MS system for metabolite profiling purposes in drug discovery and early drug development. / Tiivistelmä
Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on nykyaikana yleisesti käytetty analyysimenetelmä lääkeaineiden aineenvaihduntatuotteiden (metaboliittien) havaitsemisessa ja tunnistamisessa. Modernien LC–MS -laitteiden nopeus, selektiivisyys ja herkkyys ovat merkittävästi parantuneet viime vuosina. Käytettäessä ultrakorkean suorituskyvyn nestekromatografia (UHPLC) yhdessä nykyaikaisen korkean massaresoluution MS-laitteen kanssa on mahdollista havaita kaikki sekä odotetut että odottamattomat metaboliitit yhdellä kertaa. Tutkimalla suurta joukkoa rakenteellisesti erilaisia yhdisteitä voitiin todeta, että yksittäiselle yhdisteelle optimoidut mittausolosuhteet johtivat korkealaatuisempaan dataan kuin yleiset ei-optimoidut olosuhteet, kun arvioitiin sekä kromatografista piikin profiilia ja pidättymistä että ionisaatiotehokkuutta. Yksikään yksittäinen analyysiolosuhde ei myöskään soveltunut kaikille yhdisteille. Tutkimuksessa kehitetyillä LC–MS -analyysimenetelmillä tutkittiin sekä kanta-aineen häviämistä että metaboliatuotteiden muodostumista in vitro -menetelmillä. Alustava metaboliatuotteiden tunnistus perustui tarkan massan mittaukseen lentoaikamassaspektrometrillä (TOFMS). Tutkimustyön seuraavassa vaiheessa kehitettiin nopea ja herkkä analyysimenetelmä reaktiivisten metaboliittien pyydystämiseen, havaitsemiseen ja tunnistamiseen ihmisen maksamikrosomivalmisteista in vitro -menetelmin. 12 testiyhdisteelle havaittiin kaikkiaan 78 erilaista reaktiivisen metaboliitin konjugaatiotuotetta, jotka tunnistettiin tarkan massan perusteella. Suurin osa tunnistetuista konjugaatiotuotteista raportoitiin ensimmäistä kertaa. Amiineja sisältäville testiyhdisteille havaittiin muodostuvan sytokromi P450 (CYP) entsyymien katalysoimien reaktioiden välityksellä metyloituneita ja syanidianionilla konjugoituneita metaboliatuotteita. Tarkempien tutkimusten jälkeen näiden todettiin olevan koejärjestelyistä johtuvia artefaktoja, toisin sanoen metabonaatteja, eivätkä todellisia reaktiivisten metaboliittien konjugaatiotuotteita. Tässä tutkimuksessa arvioitiin myös perinteiseen korkean suorituskyvyn nestekromatografiin (HPLC) sekä uudempaan UHPLC-laitteistoon kytkettyjen lentoaika-, kolmoiskvadrupoli- ja hybridimallisten ioniloukkumassaspektrometrien soveltuvuutta aikaisen lääkekehitysvaiheen metaboliatutkimuksiin.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:oulo.fi/oai:oulu.fi:isbn978-951-42-9817-2 |
| Date | 29 May 2012 |
| Creators | Rousu, T. (Timo) |
| Contributors | Mattila, S. (Sampo), Tolonen, A. (Ari) |
| Publisher | Oulun yliopisto |
| Source Sets | University of Oulu |
| Language | English |
| Detected Language | Finnish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, © University of Oulu, 2012 |
| Relation | info:eu-repo/semantics/altIdentifier/pissn/0355-3191, info:eu-repo/semantics/altIdentifier/eissn/1796-220X |
Page generated in 0.003 seconds