Spelling suggestions: "subject:"lääkeaineita"" "subject:"lääkeaineiden""
1 |
Liquid chromatography–mass spectrometry in drug metabolism studiesRousu, T. (Timo) 29 May 2012 (has links)
Abstract
Drug metabolite profiling and identification studies are nowadays regularly conducted with liquid chromatography (LC) coupled with mass spectrometry (MS) as an analytical tool. The speed, selectivity and sensitivity of modern LC–MS instruments have been significantly increased in recent years. Especially the use of ultra-high-performance LC (UHPLC) in combination with a modern high-resolution MS instrument offers high full scan detection sensitivity, mass accuracy and the detection of both expected and unexpected metabolites in a single LC–MS run. The present study showed that no single LC–MS conditions were suitable for the analysis of a large group of structurally diverse compounds. The testing of optimum conditions for each individual compound led to more high-quality data when chromatographic retention behavior and mass spectrometric ionization efficiency for in vitro metabolite profiling were considered. The developed LC–MS methods were applicable for measuring both the disappearance of the parent compound and the formation of metabolites. Tentative metabolite identification was based on the measured accurate mass time-of-flight (TOF) MS data. In the second part, a rapid and sensitive assay was designed and built for the trapping, screening and characterization of reactive metabolites in vitro. In total, 78 trapped reactive metabolite conjugates were detected and identified based on accurate mass data using 12 structurally different test compounds. The majority of the detected conjugates were reported for the first time. Amine-containing compounds, that formed methylated and cyanide-trapped products after CYP-mediated reaction steps in human liver microsomal (HLM) incubations, were studied further. The observed methylated cyano conjugates were shown to be experimental artifacts, i.e., metabonates. The study also describes the use of traditional high-performance LC (HPLC) and the more modern UHPLC coupled to time-of-flight, triple quadrupole and hybrid linear ion trap mass spectrometers in drug metabolism studies, and reviews on how to choose the most suitable LC–MS system for metabolite profiling purposes in drug discovery and early drug development. / Tiivistelmä
Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on nykyaikana yleisesti käytetty analyysimenetelmä lääkeaineiden aineenvaihduntatuotteiden (metaboliittien) havaitsemisessa ja tunnistamisessa. Modernien LC–MS -laitteiden nopeus, selektiivisyys ja herkkyys ovat merkittävästi parantuneet viime vuosina. Käytettäessä ultrakorkean suorituskyvyn nestekromatografia (UHPLC) yhdessä nykyaikaisen korkean massaresoluution MS-laitteen kanssa on mahdollista havaita kaikki sekä odotetut että odottamattomat metaboliitit yhdellä kertaa. Tutkimalla suurta joukkoa rakenteellisesti erilaisia yhdisteitä voitiin todeta, että yksittäiselle yhdisteelle optimoidut mittausolosuhteet johtivat korkealaatuisempaan dataan kuin yleiset ei-optimoidut olosuhteet, kun arvioitiin sekä kromatografista piikin profiilia ja pidättymistä että ionisaatiotehokkuutta. Yksikään yksittäinen analyysiolosuhde ei myöskään soveltunut kaikille yhdisteille. Tutkimuksessa kehitetyillä LC–MS -analyysimenetelmillä tutkittiin sekä kanta-aineen häviämistä että metaboliatuotteiden muodostumista in vitro -menetelmillä. Alustava metaboliatuotteiden tunnistus perustui tarkan massan mittaukseen lentoaikamassaspektrometrillä (TOFMS). Tutkimustyön seuraavassa vaiheessa kehitettiin nopea ja herkkä analyysimenetelmä reaktiivisten metaboliittien pyydystämiseen, havaitsemiseen ja tunnistamiseen ihmisen maksamikrosomivalmisteista in vitro -menetelmin. 12 testiyhdisteelle havaittiin kaikkiaan 78 erilaista reaktiivisen metaboliitin konjugaatiotuotetta, jotka tunnistettiin tarkan massan perusteella. Suurin osa tunnistetuista konjugaatiotuotteista raportoitiin ensimmäistä kertaa. Amiineja sisältäville testiyhdisteille havaittiin muodostuvan sytokromi P450 (CYP) entsyymien katalysoimien reaktioiden välityksellä metyloituneita ja syanidianionilla konjugoituneita metaboliatuotteita. Tarkempien tutkimusten jälkeen näiden todettiin olevan koejärjestelyistä johtuvia artefaktoja, toisin sanoen metabonaatteja, eivätkä todellisia reaktiivisten metaboliittien konjugaatiotuotteita. Tässä tutkimuksessa arvioitiin myös perinteiseen korkean suorituskyvyn nestekromatografiin (HPLC) sekä uudempaan UHPLC-laitteistoon kytkettyjen lentoaika-, kolmoiskvadrupoli- ja hybridimallisten ioniloukkumassaspektrometrien soveltuvuutta aikaisen lääkekehitysvaiheen metaboliatutkimuksiin.
|
2 |
Development of LC/MS techniques for plant and drug metabolism studiesPetsalo, A. (Aleksanteri) 25 May 2011 (has links)
Abstract
Liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS) is a powerful tool for qualitative and quantitative analytics of organic molecules from various matrices, and the use of this hyphenated technique is very common in bioanalytical laboratories. In this study, LC/MS methods and the required sample preparation applications were developed for plant flavonoid and drug metabolism studies. The main focus was in developing methods to be used during cytochrome P450 (CYP) -specific drug interaction studies. Traditional high performance liquid chromatography (HPLC) and new, more efficient and faster ultra-performance liquid chromatography (UPLC) were utilized together with time-of-flight (TOF) and triple quadrupole (QqQ) mass spectrometry. In the flavonoid study, collision-induced radical cleavage of flavonoid glycosides was tested and observed to be a suitable tool for the structure elucidation of the 15 flavonol glycosides extracted from the medicinal plant Rhodiola rosea. Ten of these glycosides were previously unreported in the plant.
Several unreported in vivo bupropion metabolites were identified from human urine when developing the method for the new and more extensive in vitro and in vivo N-in-one interaction cocktail assays. The qualified analysis methods developed here enable faster analysis for the N-in-one cocktail assays, in turn enabling a more efficient screening of drugs that affect CYP-enzyme activities. In the case of the human in vitro cocktail assay, fourteen compounds were analyzed using a single LC/MS/MS run. The method has proven to be very reliable and has been used in several interaction studies utilizing different sample matrices. The in vivo cocktail assay that was developed enables totally non-invasive sample collection from the patients, the urine sample being sufficient for the UPLC/MS/MS analysis of all target compounds. The last part of the study consisted of developing a specific and very sensitive UPLC/MS/MS method for the analysis of one of the in vivo cocktail analytes, the antidiabetic drug repaglinide, from human placenta perfusates. / Tiivistelmä
Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on tehokas työväline kvalitatiivisessa ja kvantitatiivisessa analytiikassa, ja tätä tekniikkaa käytetään erityisesti bioalan laboratorioissa. Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin ja sovellettiin LC/MS- ja näytteenkäsittelymenetelmiä kasvien flavonoidimetabolian ja lääkeaineiden metaboliatuotteiden tutkimukseen keskittyen erityisesti sytokromi P450 (CYP) -entsyymispesifisten lääkeaineiden interaktiotutkimuksiin tarvittaviin menetelmiin. Työssä hyödynnettiin perinteistä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) ja uutta, suorituskyvyltään vielä tehokkaampaa ja nopeampaa nestekromatografiaa (UPLC) yhdessä lentoaika- (TOF) ja kolmoiskvadrupolimassaspektrometrian (QqQ) kanssa. Tutkimustyön flavonoidimetaboliaan keskittyneessä osuudessa havaittiin törmäyksen aiheuttaman (CID) radikaalipilkkoutumisen soveltuvan lääkinnällisenä kasvina käytetystä ruusujuuresta (Rhodiola rosea) uutettujen viidentoista flavonoliglykosidin rakennemääritykseen. Kymmentä näistä löydetyistä glykosideista ei oltu aiemmin raportoitu ruusujuuresta. Tutkimustyön keskeisimpänä tavoitteena kehitettiin kvalifioidut LC/MS -analyysimenetelmät käytettäväksi aikaisempaa kattavampien in vitro ja in vivo -olosuhteiden N-in-one -tyyppisten CYP-entsyymi-interaktiotutkimusten analyyttisenä työkaluna. Näitä analyysimenetelmiä kehitettäessä löydettiin ja tunnistettiin ihmisen virtsasta aiemmin raportoimattomia metaboliitteja CYP2B6 -entsyymin malliaineena käytetyn bupropionin annostelun jälkeen. Kyseisten kehitettyjen analyysimenetelmien avulla CYP-entsyymien toimintaan vaikuttavien lääkeaineiden tutkiminen on aiempaa nopeampaa ja antaa yhdellä kertaa samasta tutkimuksesta entistä laaja-alaisempaa tietoa. In vitro -tutkimusta varten kehitetty LC/MS/MS -analyysimenetelmä on osoittautunut erittäin käyttökelpoiseksi lukuisissa interaktiotutkimuksissa, ja in vivo -tutkimusta varten kehitetty UPLC/MS/MS -analyysimenetelmä mahdollistaa täysin ei-invasiivisen näytteenoton potilaista. Tutkimustyön viimeisessä vaiheessa kehitettiin erittäin herkkä ja spesifinen UPLC/MS/MS -analyysimenetelmä CYP2C8-entsyymin toiminnan malliaineena käytetyn repaglinidin analysoimiseksi koejärjestelystä, jossa tutkitaan yhdisteiden kulkeutumista raskausaikana äidin ja sikiön verenkierron välillä istukan kautta.
|
3 |
Liquid chromatography/mass spectrometry of bioactive secondary metabolites – <em>in vivo</em> and <em>in vitro</em> studiesHokkanen, J. (Juho) 05 March 2013 (has links)
Abstract
Liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS) is one of the most widely used techniques in modern analytical laboratories. Remarkable developments during the two previous decades in both techniques has made LC-MS the method of choice in various environmental, pharmaceutical and biochemical laboratories due to selectivity, sensitivity and versatility. The main focuses in this study were to develop new LC-MS methods to identify and quantify phenolic secondary metabolites in bilberry, lingonberry and hybrid bilberry, to study the biosynthesis of the main secondary metabolites (hypericin and hyperforin and their derivatives) in St John’s wort (SJW) both in vitro and in vivo (in plant), to identify in vitro metabolites of hyperforin in human liver microsomes and to identify the cytochrome P450 (CYP) enzymes responsible for their formation. Both high-performance liquid chromatography (HPLC) and ultra high-performance liquid chromatography (U-HPLC) in combination with time-of-flight (TOF) and triple quadrupole (QqQ) mass spectrometry were used in this study.
Identification of 52 phenolic compounds from the leaves of bilberry, lingonberry and hybrid bilberry was accomplished. In total, seven of the identified compounds were reported for the first time in Vaccinium plants and several other compounds were reported for the first time in the studied plants. Incorporation of valine and isoleucine into acyl side chains of phloroglucinols (hyperforin and adhyperforin) via biosynthesis in shoot cultures of SJW was confirmed by using isotopically labeled amino acids and HPLC-MS/MS. Also, 29 biosynthetic in vitro products for HpPKS2 enzyme originating from SJW were identified based on accurate mass data.
The metabolism of hyperforin was studied in human liver microsomes (HLM) for the first time. 57 metabolites for hyperforin were identified in the incubations with HLMs, using a substrate concentration of 1 μM. The phase I metabolism of hyperforin was suggested to rely mainly on CYP3A4 and on CYP2C family. / Tiivistelmä
Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on yksi eniten käytetyistä analyysimenetelmistä nykyaikaisissa analytiikkalaboratorioissa. Viimeisten parin vuosikymmenen aikana LC-MS -laitteet ovat kehittyneet merkittävästi, ja nykyään LC-MS onkin paras menetelmä moniin ympäristö-, lääkeaine- ja biokemiallisiin laboratorioihin sen selektiivisyyden, herkkyyden ja monipuolisuuden vuoksi. Tässä väitöskirjassa kehitettiin uusia LC-MS –menetelmiä mustikan, puolukan ja mustikkapuolukan fenolisten sekundäärimetaboliittien tunnistamiseksi ja kvantitoimiseksi, mäkikuisman pääasiallisten sekundäärimetaboliittien (hyperisiini, hyperforiini ja niiden johdannaiset) tutkimiseksi in vitro- ja kasvinäytteistä sekä hyperforiinin aineenvaihduntatuotteiden tunnistamiseksi ja niitä muodostavien sytokromi P450 (CYP) entsyymien tunnistamiseksi ihmisen maksamikrosomeissa in vitro -menetelmin. Tässä työssä käytettiin sekä korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) että ultra-korkean erotuskyvyn nestekromatografia (U-HPLC) yhdistettynä lentoaikamassaspektrometriin (TOF-MS) ja kolmoiskvadrupolimassaspektrometriin (QqQ-MS).
Mustikan, puolukan ja mustikkapuolukan lehdistä tunnistettiin yhteensä 52 fenolista yhdistettä. Seitsemää näistä tunnistetuista yhdisteistä ei oltu aiemmin löydetty Vaccinium -suvun kasveista ja useat muut yhdisteistä löydettiin ensimmäistä kertaa nyt tutkituista kasveista. Valiinin ja isoleusiinin liittyminen floroglusinolien (hyperforiini ja adhyperforiini) asyylisivuketjuihin biosynteesin välityksellä varmistettiin isotoppileimattujen aminohappojen ja HPLC-MS/MS –mittausten avulla. Tässä työssä tunnistettiin myös 29 mäkikuismasta peräisin olevan HpPKS2 -entsyymin in vitro biosynteesituotetta tarkan massan mittausten avulla. Hyperforiinin metaboliaa tutkittiin ensimmäistä kertaa ihmisen maksamikrosomeissa (HLM). Hyperforiinille tunnistettiin yhteensä 57 aineenvaihduntatuotetta ihmisen maksamikrosomi-inkubaatioissa, kun hyperforiinin alkukonsentraatio oli 1 μM. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella hyperforiinin faasi I metabolia tapahtuu pääasiassa CYP3A4:n ja CYP2C-perheen välityksellä.
|
Page generated in 0.03 seconds