Abstract Liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS) is a powerful tool for qualitative and quantitative analytics of organic molecules from various matrices, and the use of this hyphenated technique is very common in bioanalytical laboratories. In this study, LC/MS methods and the required sample preparation applications were developed for plant flavonoid and drug metabolism studies. The main focus was in developing methods to be used during cytochrome P450 (CYP) -specific drug interaction studies. Traditional high performance liquid chromatography (HPLC) and new, more efficient and faster ultra-performance liquid chromatography (UPLC) were utilized together with time-of-flight (TOF) and triple quadrupole (QqQ) mass spectrometry. In the flavonoid study, collision-induced radical cleavage of flavonoid glycosides was tested and observed to be a suitable tool for the structure elucidation of the 15 flavonol glycosides extracted from the medicinal plant Rhodiola rosea. Ten of these glycosides were previously unreported in the plant. Several unreported in vivo bupropion metabolites were identified from human urine when developing the method for the new and more extensive in vitro and in vivo N-in-one interaction cocktail assays. The qualified analysis methods developed here enable faster analysis for the N-in-one cocktail assays, in turn enabling a more efficient screening of drugs that affect CYP-enzyme activities. In the case of the human in vitro cocktail assay, fourteen compounds were analyzed using a single LC/MS/MS run. The method has proven to be very reliable and has been used in several interaction studies utilizing different sample matrices. The in vivo cocktail assay that was developed enables totally non-invasive sample collection from the patients, the urine sample being sufficient for the UPLC/MS/MS analysis of all target compounds. The last part of the study consisted of developing a specific and very sensitive UPLC/MS/MS method for the analysis of one of the in vivo cocktail analytes, the antidiabetic drug repaglinide, from human placenta perfusates. / Tiivistelmä Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on tehokas työväline kvalitatiivisessa ja kvantitatiivisessa analytiikassa, ja tätä tekniikkaa käytetään erityisesti bioalan laboratorioissa. Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin ja sovellettiin LC/MS- ja näytteenkäsittelymenetelmiä kasvien flavonoidimetabolian ja lääkeaineiden metaboliatuotteiden tutkimukseen keskittyen erityisesti sytokromi P450 (CYP) -entsyymispesifisten lääkeaineiden interaktiotutkimuksiin tarvittaviin menetelmiin. Työssä hyödynnettiin perinteistä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) ja uutta, suorituskyvyltään vielä tehokkaampaa ja nopeampaa nestekromatografiaa (UPLC) yhdessä lentoaika- (TOF) ja kolmoiskvadrupolimassaspektrometrian (QqQ) kanssa. Tutkimustyön flavonoidimetaboliaan keskittyneessä osuudessa havaittiin törmäyksen aiheuttaman (CID) radikaalipilkkoutumisen soveltuvan lääkinnällisenä kasvina käytetystä ruusujuuresta (Rhodiola rosea) uutettujen viidentoista flavonoliglykosidin rakennemääritykseen. Kymmentä näistä löydetyistä glykosideista ei oltu aiemmin raportoitu ruusujuuresta. Tutkimustyön keskeisimpänä tavoitteena kehitettiin kvalifioidut LC/MS -analyysimenetelmät käytettäväksi aikaisempaa kattavampien in vitro ja in vivo -olosuhteiden N-in-one -tyyppisten CYP-entsyymi-interaktiotutkimusten analyyttisenä työkaluna. Näitä analyysimenetelmiä kehitettäessä löydettiin ja tunnistettiin ihmisen virtsasta aiemmin raportoimattomia metaboliitteja CYP2B6 -entsyymin malliaineena käytetyn bupropionin annostelun jälkeen. Kyseisten kehitettyjen analyysimenetelmien avulla CYP-entsyymien toimintaan vaikuttavien lääkeaineiden tutkiminen on aiempaa nopeampaa ja antaa yhdellä kertaa samasta tutkimuksesta entistä laaja-alaisempaa tietoa. In vitro -tutkimusta varten kehitetty LC/MS/MS -analyysimenetelmä on osoittautunut erittäin käyttökelpoiseksi lukuisissa interaktiotutkimuksissa, ja in vivo -tutkimusta varten kehitetty UPLC/MS/MS -analyysimenetelmä mahdollistaa täysin ei-invasiivisen näytteenoton potilaista. Tutkimustyön viimeisessä vaiheessa kehitettiin erittäin herkkä ja spesifinen UPLC/MS/MS -analyysimenetelmä CYP2C8-entsyymin toiminnan malliaineena käytetyn repaglinidin analysoimiseksi koejärjestelystä, jossa tutkitaan yhdisteiden kulkeutumista raskausaikana äidin ja sikiön verenkierron välillä istukan kautta.

Abstract Liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS) is one of the most widely used techniques in modern analytical laboratories. Remarkable developments during the two previous decades in both techniques has made LC-MS the method of choice in various environmental, pharmaceutical and biochemical laboratories due to selectivity, sensitivity and versatility. The main focuses in this study were to develop new LC-MS methods to identify and quantify phenolic secondary metabolites in bilberry, lingonberry and hybrid bilberry, to study the biosynthesis of the main secondary metabolites (hypericin and hyperforin and their derivatives) in St John’s wort (SJW) both in vitro and in vivo (in plant), to identify in vitro metabolites of hyperforin in human liver microsomes and to identify the cytochrome P450 (CYP) enzymes responsible for their formation. Both high-performance liquid chromatography (HPLC) and ultra high-performance liquid chromatography (U-HPLC) in combination with time-of-flight (TOF) and triple quadrupole (QqQ) mass spectrometry were used in this study. Identification of 52 phenolic compounds from the leaves of bilberry, lingonberry and hybrid bilberry was accomplished. In total, seven of the identified compounds were reported for the first time in Vaccinium plants and several other compounds were reported for the first time in the studied plants. Incorporation of valine and isoleucine into acyl side chains of phloroglucinols (hyperforin and adhyperforin) via biosynthesis in shoot cultures of SJW was confirmed by using isotopically labeled amino acids and HPLC-MS/MS. Also, 29 biosynthetic in vitro products for HpPKS2 enzyme originating from SJW were identified based on accurate mass data. The metabolism of hyperforin was studied in human liver microsomes (HLM) for the first time. 57 metabolites for hyperforin were identified in the incubations with HLMs, using a substrate concentration of 1 μM. The phase I metabolism of hyperforin was suggested to rely mainly on CYP3A4 and on CYP2C family. / Tiivistelmä Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on yksi eniten käytetyistä analyysimenetelmistä nykyaikaisissa analytiikkalaboratorioissa. Viimeisten parin vuosikymmenen aikana LC-MS -laitteet ovat kehittyneet merkittävästi, ja nykyään LC-MS onkin paras menetelmä moniin ympäristö-, lääkeaine- ja biokemiallisiin laboratorioihin sen selektiivisyyden, herkkyyden ja monipuolisuuden vuoksi. Tässä väitöskirjassa kehitettiin uusia LC-MS –menetelmiä mustikan, puolukan ja mustikkapuolukan fenolisten sekundäärimetaboliittien tunnistamiseksi ja kvantitoimiseksi, mäkikuisman pääasiallisten sekundäärimetaboliittien (hyperisiini, hyperforiini ja niiden johdannaiset) tutkimiseksi in vitro- ja kasvinäytteistä sekä hyperforiinin aineenvaihduntatuotteiden tunnistamiseksi ja niitä muodostavien sytokromi P450 (CYP) entsyymien tunnistamiseksi ihmisen maksamikrosomeissa in vitro -menetelmin. Tässä työssä käytettiin sekä korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) että ultra-korkean erotuskyvyn nestekromatografia (U-HPLC) yhdistettynä lentoaikamassaspektrometriin (TOF-MS) ja kolmoiskvadrupolimassaspektrometriin (QqQ-MS). Mustikan, puolukan ja mustikkapuolukan lehdistä tunnistettiin yhteensä 52 fenolista yhdistettä. Seitsemää näistä tunnistetuista yhdisteistä ei oltu aiemmin löydetty Vaccinium -suvun kasveista ja useat muut yhdisteistä löydettiin ensimmäistä kertaa nyt tutkituista kasveista. Valiinin ja isoleusiinin liittyminen floroglusinolien (hyperforiini ja adhyperforiini) asyylisivuketjuihin biosynteesin välityksellä varmistettiin isotoppileimattujen aminohappojen ja HPLC-MS/MS –mittausten avulla. Tässä työssä tunnistettiin myös 29 mäkikuismasta peräisin olevan HpPKS2 -entsyymin in vitro biosynteesituotetta tarkan massan mittausten avulla. Hyperforiinin metaboliaa tutkittiin ensimmäistä kertaa ihmisen maksamikrosomeissa (HLM). Hyperforiinille tunnistettiin yhteensä 57 aineenvaihduntatuotetta ihmisen maksamikrosomi-inkubaatioissa, kun hyperforiinin alkukonsentraatio oli 1 μM. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella hyperforiinin faasi I metabolia tapahtuu pääasiassa CYP3A4:n ja CYP2C-perheen välityksellä.

Abstract Vaccinium berries contain high yields of antioxidant compounds, such as flavonoids and carotenoids, which are recognized to benefit human health. Therefore, commercial interest in cultivated and wild Vaccinium berries is increasing globally. Flavonoids and carotenoids are important secondary metabolites, the biosynthesis of which is regulated by interaction of the genetic background of the plant and the surrounding environment. In fruits the production of secondary metabolites has also a tight linkage with developmental processes. The present thesis is focused on developmental and environmental factors affecting the biosynthesis of carotenoids and flavonoids in berries of the genus Vaccinium. In bilberry altogether eight carotenoids were detected, with lutein and β-carotene being the most abundant compounds, accompanied by minor amounts of xanthophylls, such as antheraxanthin, neoxanthin, violaxanthin and zeaxanthin. During ripening the accumulation of carotenoids decreased. Simultaneously the expression of a carotenoid cleavage dioxygenase (VmCCD1) gene increased, indicating degradation of carotenoids during the fruit development. Simultaneously, flavonols and anthocyanins accumulated during the last stages of berry ripening. Environmental factors had a marked effect on the anthocyanin profile of ripe bilberries. Especially lower temperatures affected more on the accumulation of the delphinidin-based anthocyanidins than on the cyanidin-based ones. However, the spectral light composition also played a role, as an increased proportion in blue wavelengths increased the delphinidin-based anthocyanins at ripe stage. The effect of light quality on other phenolic compounds and carotenoid accumulation was less pronounced. The present results can be applied to cultivation of Vaccinium species in order to produce berries with high nutritional value. / Tiivistelmä Vaccinium-suvun marjat sisältävät runsaasti antioksidatiivisiä yhdisteitä, kuten flavonoideja ja karotenoideja, joilla on viimeaikaisissa tutkimuksissa havaittu lukuisia terveysvaikutuksia. Tämän johdosta kiinnostus sekä viljeltyjä mustikoita että metsämustikoita kohtaan on kasvanut maailmanlaajuisesti. Flavonoidit ja karotenoidit ovat kasvien tuottamia sekundäärimetabolian yhdisteitä, joiden biosynteesin säätelyyn vaikuttavat sekä kasvin geneettinen tausta että ympäristötekijät. Hedelmissä ja marjoissa sekundääriyhdisteiden tuoton säätelyyn vaikuttaa huomattavasti myös kehityksellisten vaiheiden eteneminen. Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin marjan kehitykseen liittyvien tekijöiden sekä ympäristötekijöiden vaikutusta flavonoidien ja karotenoidien biosynteesiin sekä viljelyillä mustikoilla että metsämustikoilla. Metsämustikoista tunnistettiin kahdeksan erilaista karotenoidi-yhdistettä, joista luteiini ja β-karoteeni esiintyivät yleisimpinä ksantofyllin, antheraksantiinin, neoksantiinin, violaksantiinin ja zeaksantiinin ohella. Karotenoidien pitoisuudet olivat suurimmillaan marjankehityksen alkuvaiheessa ja laskivat kypsyvissä marjoissa. Vastaavasti karotenoideja pilkkovan VmCCD1 entsyymigeenin ilmeneminen lisääntyi kohosi marjan kypysymisen loppuvaiheessa. Antosyaanien ja myrisetiini-pohjaisten flavonolien pitoisuudet sen sijaan kohosivat kypsymisen aikana. Tässä tutkimuksessa ympäristötekijöillä osoitettiin olevan suuri vaikutus antosyaanien laadulliseen kertymiseen, sillä delfinidiini-tyypin antosyaanien pitoisuudet muuttuivat enemmän ympäristötekijöiden vaikutuksesta verrattuna syanidiini-tyypin antosyaaneihin. Alhaisempi lämpötila yhdessä spesifisten valo-olosuhteiden kanssa lisäsi eniten delfinidiini-tyypin antosyaanien tuottoa. Myös valon laadulla voitiin osoittaa olevan vaikutusta antosyaanien biosynteesiin. Sininen valo lisäsi erityisesti delfinidiini-tyypin antosyaanien tuottoa kypsissä marjoissa. Flavonolien ja karotenoidien tuottoon valon laadun vaikutus oli sen sijaan vähäisempää. Väitöskirjatyön tuloksia voidaan hyödyntää marjojen viljelyssä haluttaessa vaikuttaa marjojen ravitsemukselliseen koostumukseen.