Abstract Liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS) is a powerful tool for qualitative and quantitative analytics of organic molecules from various matrices, and the use of this hyphenated technique is very common in bioanalytical laboratories. In this study, LC/MS methods and the required sample preparation applications were developed for plant flavonoid and drug metabolism studies. The main focus was in developing methods to be used during cytochrome P450 (CYP) -specific drug interaction studies. Traditional high performance liquid chromatography (HPLC) and new, more efficient and faster ultra-performance liquid chromatography (UPLC) were utilized together with time-of-flight (TOF) and triple quadrupole (QqQ) mass spectrometry. In the flavonoid study, collision-induced radical cleavage of flavonoid glycosides was tested and observed to be a suitable tool for the structure elucidation of the 15 flavonol glycosides extracted from the medicinal plant Rhodiola rosea. Ten of these glycosides were previously unreported in the plant. Several unreported in vivo bupropion metabolites were identified from human urine when developing the method for the new and more extensive in vitro and in vivo N-in-one interaction cocktail assays. The qualified analysis methods developed here enable faster analysis for the N-in-one cocktail assays, in turn enabling a more efficient screening of drugs that affect CYP-enzyme activities. In the case of the human in vitro cocktail assay, fourteen compounds were analyzed using a single LC/MS/MS run. The method has proven to be very reliable and has been used in several interaction studies utilizing different sample matrices. The in vivo cocktail assay that was developed enables totally non-invasive sample collection from the patients, the urine sample being sufficient for the UPLC/MS/MS analysis of all target compounds. The last part of the study consisted of developing a specific and very sensitive UPLC/MS/MS method for the analysis of one of the in vivo cocktail analytes, the antidiabetic drug repaglinide, from human placenta perfusates. / Tiivistelmä Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on tehokas työväline kvalitatiivisessa ja kvantitatiivisessa analytiikassa, ja tätä tekniikkaa käytetään erityisesti bioalan laboratorioissa. Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin ja sovellettiin LC/MS- ja näytteenkäsittelymenetelmiä kasvien flavonoidimetabolian ja lääkeaineiden metaboliatuotteiden tutkimukseen keskittyen erityisesti sytokromi P450 (CYP) -entsyymispesifisten lääkeaineiden interaktiotutkimuksiin tarvittaviin menetelmiin. Työssä hyödynnettiin perinteistä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) ja uutta, suorituskyvyltään vielä tehokkaampaa ja nopeampaa nestekromatografiaa (UPLC) yhdessä lentoaika- (TOF) ja kolmoiskvadrupolimassaspektrometrian (QqQ) kanssa. Tutkimustyön flavonoidimetaboliaan keskittyneessä osuudessa havaittiin törmäyksen aiheuttaman (CID) radikaalipilkkoutumisen soveltuvan lääkinnällisenä kasvina käytetystä ruusujuuresta (Rhodiola rosea) uutettujen viidentoista flavonoliglykosidin rakennemääritykseen. Kymmentä näistä löydetyistä glykosideista ei oltu aiemmin raportoitu ruusujuuresta. Tutkimustyön keskeisimpänä tavoitteena kehitettiin kvalifioidut LC/MS -analyysimenetelmät käytettäväksi aikaisempaa kattavampien in vitro ja in vivo -olosuhteiden N-in-one -tyyppisten CYP-entsyymi-interaktiotutkimusten analyyttisenä työkaluna. Näitä analyysimenetelmiä kehitettäessä löydettiin ja tunnistettiin ihmisen virtsasta aiemmin raportoimattomia metaboliitteja CYP2B6 -entsyymin malliaineena käytetyn bupropionin annostelun jälkeen. Kyseisten kehitettyjen analyysimenetelmien avulla CYP-entsyymien toimintaan vaikuttavien lääkeaineiden tutkiminen on aiempaa nopeampaa ja antaa yhdellä kertaa samasta tutkimuksesta entistä laaja-alaisempaa tietoa. In vitro -tutkimusta varten kehitetty LC/MS/MS -analyysimenetelmä on osoittautunut erittäin käyttökelpoiseksi lukuisissa interaktiotutkimuksissa, ja in vivo -tutkimusta varten kehitetty UPLC/MS/MS -analyysimenetelmä mahdollistaa täysin ei-invasiivisen näytteenoton potilaista. Tutkimustyön viimeisessä vaiheessa kehitettiin erittäin herkkä ja spesifinen UPLC/MS/MS -analyysimenetelmä CYP2C8-entsyymin toiminnan malliaineena käytetyn repaglinidin analysoimiseksi koejärjestelystä, jossa tutkitaan yhdisteiden kulkeutumista raskausaikana äidin ja sikiön verenkierron välillä istukan kautta.

Abstract Liquid chromatography (LC) combined with mass spectrometry (MS) is one of the most widely used techniques in modern analytical laboratories. Remarkable developments during the two previous decades in both techniques has made LC-MS the method of choice in various environmental, pharmaceutical and biochemical laboratories due to selectivity, sensitivity and versatility. The main focuses in this study were to develop new LC-MS methods to identify and quantify phenolic secondary metabolites in bilberry, lingonberry and hybrid bilberry, to study the biosynthesis of the main secondary metabolites (hypericin and hyperforin and their derivatives) in St John’s wort (SJW) both in vitro and in vivo (in plant), to identify in vitro metabolites of hyperforin in human liver microsomes and to identify the cytochrome P450 (CYP) enzymes responsible for their formation. Both high-performance liquid chromatography (HPLC) and ultra high-performance liquid chromatography (U-HPLC) in combination with time-of-flight (TOF) and triple quadrupole (QqQ) mass spectrometry were used in this study. Identification of 52 phenolic compounds from the leaves of bilberry, lingonberry and hybrid bilberry was accomplished. In total, seven of the identified compounds were reported for the first time in Vaccinium plants and several other compounds were reported for the first time in the studied plants. Incorporation of valine and isoleucine into acyl side chains of phloroglucinols (hyperforin and adhyperforin) via biosynthesis in shoot cultures of SJW was confirmed by using isotopically labeled amino acids and HPLC-MS/MS. Also, 29 biosynthetic in vitro products for HpPKS2 enzyme originating from SJW were identified based on accurate mass data. The metabolism of hyperforin was studied in human liver microsomes (HLM) for the first time. 57 metabolites for hyperforin were identified in the incubations with HLMs, using a substrate concentration of 1 μM. The phase I metabolism of hyperforin was suggested to rely mainly on CYP3A4 and on CYP2C family. / Tiivistelmä Nestekromatografia (LC) yhdistettynä massaspektrometriaan (MS) on yksi eniten käytetyistä analyysimenetelmistä nykyaikaisissa analytiikkalaboratorioissa. Viimeisten parin vuosikymmenen aikana LC-MS -laitteet ovat kehittyneet merkittävästi, ja nykyään LC-MS onkin paras menetelmä moniin ympäristö-, lääkeaine- ja biokemiallisiin laboratorioihin sen selektiivisyyden, herkkyyden ja monipuolisuuden vuoksi. Tässä väitöskirjassa kehitettiin uusia LC-MS –menetelmiä mustikan, puolukan ja mustikkapuolukan fenolisten sekundäärimetaboliittien tunnistamiseksi ja kvantitoimiseksi, mäkikuisman pääasiallisten sekundäärimetaboliittien (hyperisiini, hyperforiini ja niiden johdannaiset) tutkimiseksi in vitro- ja kasvinäytteistä sekä hyperforiinin aineenvaihduntatuotteiden tunnistamiseksi ja niitä muodostavien sytokromi P450 (CYP) entsyymien tunnistamiseksi ihmisen maksamikrosomeissa in vitro -menetelmin. Tässä työssä käytettiin sekä korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) että ultra-korkean erotuskyvyn nestekromatografia (U-HPLC) yhdistettynä lentoaikamassaspektrometriin (TOF-MS) ja kolmoiskvadrupolimassaspektrometriin (QqQ-MS). Mustikan, puolukan ja mustikkapuolukan lehdistä tunnistettiin yhteensä 52 fenolista yhdistettä. Seitsemää näistä tunnistetuista yhdisteistä ei oltu aiemmin löydetty Vaccinium -suvun kasveista ja useat muut yhdisteistä löydettiin ensimmäistä kertaa nyt tutkituista kasveista. Valiinin ja isoleusiinin liittyminen floroglusinolien (hyperforiini ja adhyperforiini) asyylisivuketjuihin biosynteesin välityksellä varmistettiin isotoppileimattujen aminohappojen ja HPLC-MS/MS –mittausten avulla. Tässä työssä tunnistettiin myös 29 mäkikuismasta peräisin olevan HpPKS2 -entsyymin in vitro biosynteesituotetta tarkan massan mittausten avulla. Hyperforiinin metaboliaa tutkittiin ensimmäistä kertaa ihmisen maksamikrosomeissa (HLM). Hyperforiinille tunnistettiin yhteensä 57 aineenvaihduntatuotetta ihmisen maksamikrosomi-inkubaatioissa, kun hyperforiinin alkukonsentraatio oli 1 μM. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella hyperforiinin faasi I metabolia tapahtuu pääasiassa CYP3A4:n ja CYP2C-perheen välityksellä.

Abstract The hepatic inducible Cytochrome P450s (CYPs) generally prime xenobiotics for elimination. Murine CYP2A5 and human CYP2A6 share similar xenobiotic substrates and some regulatory features. Recently, they were shown to oxidize bilirubin, a byproduct of heme catabolism and a dose-dependent anti- or pro-oxidant, to biliverdin. In this study, the putative role of the redox-sensitive, cytoprotective transcription factor Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) in the regulation of hepatic Cyp2a5 expression and induction under diverse hepatotoxic conditions and altered heme homeostasis was characterized. The coordination of Cyp2a5 and the Nrf2 target gene Heme oxygenase-1 (Hmox1), which determines bilirubin formation from heme, responses to heavy metals and modulators of heme homeostasis, was studied in cultured wildtype and Nrf2(-/-) mouse primary hepatocytes. Nrf2 was essential for the basal hepatic expression of CYP2A5 in the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria, as well as for its induction by cadmium, lead, methyl mercury and phenethyl isothiocyanate. A functional Nrf2 binding antioxidant response element (ARE) about -2.4 kilobases upstream of the Cyp2a5 transcriptional start site was identified. In contrast to Hmox1, a target of BTB and CNC homology 1 (Bach)-mediated repression via AREs, the regulation of Cyp2a5 did not clearly involve Bach1. Excessive heme induced mainly ER-localized CYP2A5 via Nrf2, which was limited by the Nrf2-independent HMOX1 induction. In heme synthesis blockades, CYP2A5 was enhanced via Nrf2 and additional factors, such as the peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α). The typical CYP2A5 inducers phenobarbital, dibutyryl-cyclic adenosine monophosphate (db-cAMP) and PGC-1α enhance heme synthesis; CYP2A5 was induced via Nrf2 in acute but not chronic phenobarbital exposure without a clear connection to heme, while the responses to db-cAMP and PGC-1α were sensitized in the absence of Nrf2. This suggests novel crosstalk between Nrf2 and PGC-1α. In this study, Cyp2a5 was identified as a sensitive indicator of hepatic Nrf2 pathway activation that could be used, e.g. for in vitro screening of drug candidate hepatotoxicity. The similar subcellular localization and coordination of CYP2A5 and HMOX1 expression in altered heme metabolism support the postulated role for CYP2A5 in bilirubin homeostasis. / Tiivistelmä Vierasaineet stimuloivat maksan Sytokromi P450 (CYP)-entsyymejä, mikä yleensä lisää niiden eliminaatiota. Hiiren CYP2A5 ja ihmisen CYP2A6 ovat lähisukua katalyyttisten ja osin säätelyllisten yhteneväisyyksiensä puolesta. Vastikään niiden osoitettiin katalysoivan hemin hajoamistuotteen, bilirubiinin hapettumista biliverdiiniksi, mikä saattaisi säädellä sen annosriippuvaisia vaikutuksia antioksidanttina ja oksidanttina. Työssä tutkittiin solustressiä aistivan, suojaavan transkriptiotekijän Nrf2 osuutta Cyp2a5-geenin aktivaatiossa maksatoksisissa olosuhteissa ja hemimetabolian muutoksissa. Cyp2a5:n ja bilirubiinin tuotosta vastaavan, Nrf2-säädellyn Hemioksigenaasi-1 (Hmox1):n vasteita verrattiin viljellyissä villityypin ja poistogeenisen Nrf2(-/-) hiiren primaarimaksasoluissa. Tulokset osoittavat, että Nrf2 ylläpitää CYP2A5:n ilmentymistä endoplasmisella kalvostolla (ER) ja mitokondrioissa sekä välittää sen stimulaation altisteilla kadmium, lyijy, metyylielohopea ja fenetyyli-isotiosyanaatti. Toimiva Nrf2-vasteinen antioksidanttivaste-elementti (ARE) tunnistettiin n. -2,4 kiloemäsparia Cyp2a5-geenin luennan aloituskohdasta ylävirtaan. BTB ja CNC homologia 1 (Bach1)-tekijä, joka on tärkeä Hmox1-säätelijä ja ARE-välitteinen transkription estäjä, ei selkeästi osallistu Cyp2a5:n säätelyyn. Hemin ylimäärä stimuloi CYP2A5:n määrää ER-kalvostolla, Nrf2-riippumattomasti stimuloituvan HMOX1 rajoittaessa Nrf2-reitin aktivaatiota. Hemisynteesin estyessä Nrf2 aktivoi Cyp2a5-geeniä muiden mekanismien kuten peroksisomiproliferaattori-aktivoituva reseptori gamman koaktivaattori-1α (PGC-1α) kanssa. Fenobarbitaali (PB), dibutyryyli-syklinen adenosiinimonofosfaatti (db-cAMP) ja PGC-1α lisäävät tunnetusti hemisynteesiä. Nrf2 havaittiin Cyp2a5:n aktivaatiolle välttämättömäksi akuutissa mutta ei kroonisessa PB-altistuksessa ilman selkeästi havaittua hemin osuutta. Cyp2a5-geenin db-cAMP- ja PGC-1α-vasteinen stimulaatio voimistui merkittävästi toimivan Nrf2-reitin puuttuessa, mikä osoittaa vuoropuhelua Nrf2 ja PGC-1α välillä. Väitöskirjatyössä Cyp2a5 tunnistettiin herkäksi Nrf2-reitin aktivaation maksamarkkeriksi, jota voitaisiin hyödyntää esim. lääkeainekandidaattien maksatoksisuuden seulonnassa soluviljelyssä. CYP2A5:n ja HMOX1:n solunsisäinen kohdentuminen ja ekspressio koordinoituvat hemimetabolian muutoksissa, mikä tukee teoriaa CYP2A5:n roolista bilirubiinin metaboliassa maksassa.