Abstract The hepatic inducible Cytochrome P450s (CYPs) generally prime xenobiotics for elimination. Murine CYP2A5 and human CYP2A6 share similar xenobiotic substrates and some regulatory features. Recently, they were shown to oxidize bilirubin, a byproduct of heme catabolism and a dose-dependent anti- or pro-oxidant, to biliverdin. In this study, the putative role of the redox-sensitive, cytoprotective transcription factor Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) in the regulation of hepatic Cyp2a5 expression and induction under diverse hepatotoxic conditions and altered heme homeostasis was characterized. The coordination of Cyp2a5 and the Nrf2 target gene Heme oxygenase-1 (Hmox1), which determines bilirubin formation from heme, responses to heavy metals and modulators of heme homeostasis, was studied in cultured wildtype and Nrf2(-/-) mouse primary hepatocytes. Nrf2 was essential for the basal hepatic expression of CYP2A5 in the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria, as well as for its induction by cadmium, lead, methyl mercury and phenethyl isothiocyanate. A functional Nrf2 binding antioxidant response element (ARE) about -2.4 kilobases upstream of the Cyp2a5 transcriptional start site was identified. In contrast to Hmox1, a target of BTB and CNC homology 1 (Bach)-mediated repression via AREs, the regulation of Cyp2a5 did not clearly involve Bach1. Excessive heme induced mainly ER-localized CYP2A5 via Nrf2, which was limited by the Nrf2-independent HMOX1 induction. In heme synthesis blockades, CYP2A5 was enhanced via Nrf2 and additional factors, such as the peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α). The typical CYP2A5 inducers phenobarbital, dibutyryl-cyclic adenosine monophosphate (db-cAMP) and PGC-1α enhance heme synthesis; CYP2A5 was induced via Nrf2 in acute but not chronic phenobarbital exposure without a clear connection to heme, while the responses to db-cAMP and PGC-1α were sensitized in the absence of Nrf2. This suggests novel crosstalk between Nrf2 and PGC-1α. In this study, Cyp2a5 was identified as a sensitive indicator of hepatic Nrf2 pathway activation that could be used, e.g. for in vitro screening of drug candidate hepatotoxicity. The similar subcellular localization and coordination of CYP2A5 and HMOX1 expression in altered heme metabolism support the postulated role for CYP2A5 in bilirubin homeostasis. / Tiivistelmä Vierasaineet stimuloivat maksan Sytokromi P450 (CYP)-entsyymejä, mikä yleensä lisää niiden eliminaatiota. Hiiren CYP2A5 ja ihmisen CYP2A6 ovat lähisukua katalyyttisten ja osin säätelyllisten yhteneväisyyksiensä puolesta. Vastikään niiden osoitettiin katalysoivan hemin hajoamistuotteen, bilirubiinin hapettumista biliverdiiniksi, mikä saattaisi säädellä sen annosriippuvaisia vaikutuksia antioksidanttina ja oksidanttina. Työssä tutkittiin solustressiä aistivan, suojaavan transkriptiotekijän Nrf2 osuutta Cyp2a5-geenin aktivaatiossa maksatoksisissa olosuhteissa ja hemimetabolian muutoksissa. Cyp2a5:n ja bilirubiinin tuotosta vastaavan, Nrf2-säädellyn Hemioksigenaasi-1 (Hmox1):n vasteita verrattiin viljellyissä villityypin ja poistogeenisen Nrf2(-/-) hiiren primaarimaksasoluissa. Tulokset osoittavat, että Nrf2 ylläpitää CYP2A5:n ilmentymistä endoplasmisella kalvostolla (ER) ja mitokondrioissa sekä välittää sen stimulaation altisteilla kadmium, lyijy, metyylielohopea ja fenetyyli-isotiosyanaatti. Toimiva Nrf2-vasteinen antioksidanttivaste-elementti (ARE) tunnistettiin n. -2,4 kiloemäsparia Cyp2a5-geenin luennan aloituskohdasta ylävirtaan. BTB ja CNC homologia 1 (Bach1)-tekijä, joka on tärkeä Hmox1-säätelijä ja ARE-välitteinen transkription estäjä, ei selkeästi osallistu Cyp2a5:n säätelyyn. Hemin ylimäärä stimuloi CYP2A5:n määrää ER-kalvostolla, Nrf2-riippumattomasti stimuloituvan HMOX1 rajoittaessa Nrf2-reitin aktivaatiota. Hemisynteesin estyessä Nrf2 aktivoi Cyp2a5-geeniä muiden mekanismien kuten peroksisomiproliferaattori-aktivoituva reseptori gamman koaktivaattori-1α (PGC-1α) kanssa. Fenobarbitaali (PB), dibutyryyli-syklinen adenosiinimonofosfaatti (db-cAMP) ja PGC-1α lisäävät tunnetusti hemisynteesiä. Nrf2 havaittiin Cyp2a5:n aktivaatiolle välttämättömäksi akuutissa mutta ei kroonisessa PB-altistuksessa ilman selkeästi havaittua hemin osuutta. Cyp2a5-geenin db-cAMP- ja PGC-1α-vasteinen stimulaatio voimistui merkittävästi toimivan Nrf2-reitin puuttuessa, mikä osoittaa vuoropuhelua Nrf2 ja PGC-1α välillä. Väitöskirjatyössä Cyp2a5 tunnistettiin herkäksi Nrf2-reitin aktivaation maksamarkkeriksi, jota voitaisiin hyödyntää esim. lääkeainekandidaattien maksatoksisuuden seulonnassa soluviljelyssä. CYP2A5:n ja HMOX1:n solunsisäinen kohdentuminen ja ekspressio koordinoituvat hemimetabolian muutoksissa, mikä tukee teoriaa CYP2A5:n roolista bilirubiinin metaboliassa maksassa.

Abstract In this thesis oxidation of a pure and alloyed Cu surface was studied using density functional theory based calculations. The mechanism and energetics behind experimentally observed missing row reconstruction on a pure Cu(100) surface were studied. Examination of the formation of the missing row was approached by studying the profitableness of vacancy formation to the surface at oxygen coverages below and equal to 0.5 ML. However, an ideal surface was in all cases more favourable in energy than vacancy included structures. Therefore an additional Cu atom was added to the simulation cell to promote vacancy formation. A consequence of this on-surface Cu addition was the identifying of a new energetically favoured Cu-O-Cu chain formation. This newly identified structure is a possible transition state in the path from an ideal surface to a reconstructed one. Copper(I)oxide formation through sub-surface adsorption was examined on a reconstructed Cu(100) surface. At low O coverage on-surface adsorption was found to be much more favoured than adsorption on sub-surface sites. However, when coverage increased to 0.75 ML structures with both on-surface and sub-surface adsorbates possessed the lowest energy. Furthermore, the diffusion barriers to the sub-surface adsorption sites were low. Both these facts support the conclusion that the transition from the reconstructed missing row structure to the copper(I)oxide takes place without any large energy effort. The adsorption induced segregation of copper on a Ag/Cu(100) surface was studied by calculating the surface energies of slabs where the silver layer was positioned at different depths with varying O coverage. In addition, the segregation energies were also calculated with two Ag compositions. It was discovered that without oxygen adsorbates silver atoms lying on top of the surface were favoured but the surface segregation probability of Cu increases with increasing O coverage. The same calculation procedure was expanded to study the segregation probability of five additional alloy metals with a Cu surface. Without oxygen present Mg, Al and Zn possess a weak tendency to segregate to the surface, however, V and Cr prefer to stay in the bulk. The addition of oxygen adsorbates on the surface causes the segregation of all the dopants to the top of the surface. With the Al dopant the effect of the surface orientation and the oxygen coverage were also studied. The bonds between adsorbates and the surface were strongest with the densest surface, (111), and weakest with the most opened surface, (110). Furthermore, the enrichment probability was largest in the case of the (111) surface and lowest with the (110) surface. Probability increased with increasing oxygen coverage. / Tiivistelmä Tässä väitöstyössä on tutkittu puhtaan ja seostetun kuparipinnan hapettumista tiheysfunktionaaliteoriaan perustuvilla laskuilla. Kokeellisesti Cu(100) pinnan on havaittu rekonstruoituvan hapen vaikutuksesta. Rekonstruoitumisen aikana ideaalisesta pinnasta irtoaa joka neljäs pintakuparirivi ja muodostuu niin kutsuttu missing row- rakenne. Tämän rakenteen muodostumismekanismia ja muodostumiseen kuluvaa energiaa tutkittiin vertaamalla pintavakansillisten rakenteiden pintaenergioita vastaaviin ideaalipinnan arvoihin vaihtelevalla happipeitolla. Koska ideaalipinta oli kaikilla peittoasteilla energeettisesti suotuisampi kuin vakanssirakenne, yksittäisiä kupariatomeja lisättiin pinnalle stabiloimaan vakanssirakenteita. Kuparilisäyksen seurauksena löydettiin uusi energeettisesti edullinen Cu-O-Cu ketjurakenne. Tämä rakenne on mahdollinen ideaalisen ja rekonstruoituneen pinnan välinen siirtymätila. Kupari(I)oksidin muodostumista pinnanalaisen happiadsorption kautta tutkittiin rekonstruoituneella Cu(100) pinnalla. Pienillä happi-peittoasteilla pinnanpäällisen adsorption havaittiin olevan huomattavasti suotuisampaa kuin pinnanalaisen adsorption. Kuitenkin happi peiton kasvaessa 0,75 ML:iin rakenteet, joissa oli adsorbaatteja sekä pinnan alla että päällä, tulivat muita suotuisimmiksi. Myös lasketut energiavallit hapen diffuusiolle pinnalta pinnan alle olivat hyvin pieniä. Kaikki tulokset viittaavat siihen, että rekonstruoitunut Cu(100) pinta hapettuu helposti kupari(I)oksidiksi. Happiadsorption aikaansaamaa kuparin rikastumista (segregaatio) hopeakupariseosmetallin pinnalle tutkittiin laskemalla vaihtelevilla happipeitoilla pintaenergiat kuparipinnoille, joissa ensimmäinen, toinen ja kolmas kuparikerros oli korvattu hopealla. Myös segregaatioenergiat laskettiin kahdella eri seoskoostumuksella. Saatujen tulosten mukaan ilman happiadsoptiota hopea segregoituu pinnalle, kun taas hapen peittoasteen kasvaessa kupari rikastuu pinnalle. Samaa tutkimustapaa käytettiin myös tarkasteltaessa viiden muun seosmetallin segregaatiotodennäköisyyttä kuparipinnalla. Ilman pintahappea magnesiumilla, alumiinilla ja sinkillä oli heikko taipumus rikastua pinnalle, kun taas vanadium ja kromi pysyivät syvemmällä metallissa. Sen sijaan happea lisättäessä kaikki tutkitut seosmetallit pyrkivät siirtymään kohti pintaa. Myös hapen peiton sekä pintaorientaation vaikutusta segregaatioon tutkittiin hopeakuparipinnalla. Sekä happiadsorbaattien ja pinnan välinen sidos että segregaatiotodennäköisyys oli sitä voimakkaampaa, mitä tiheämmästä pinnasta oli kyse. Segregaatiotodennäköisyys kasvoi pinta-adsorption lisääntyessä.