Diss. -- Espoo -- Teknillinen korkeakoulu. / Myös verkkojulkaisuna. Also available on the World Wide Web.

Abstract Enzymes are potentially superior as catalysts for many industrial chemical processes because of their high specificity, selectivity, minimum energy requirement and environmental friendliness. However, many challenges remain in order to exploit fully the potential of industrial enzymes. The qualities which are needed are catalytic proficiency, availability in high quantities, low price, low product inhibition, and high activity and stability under process conditions. Directed evolution and rational design are the most common strategies to produce enzymes with the desired properties. The TIM barrel is the most frequent and most versatile fold among naturally occurring enzymes. In all known TIM barrel enzymes, the catalytically active residues are located at one end of the barrel structure, while residues maintaining the stability of the fold are found on the opposite end of the barrel. This special architecture of the TIM barrel proteins makes it possible to change catalytic activity of the protein without compromising its stability, which is a perfect start for protein engineering studies. In this research project, a monomeric triosephosphate isomerase (TIM) variant with an engineered binding groove (A-TIM) was created by using a rational design approach. The major aims of this work were (i) to find novel binders and (ii) characterize the new, bigger binding groove using X-ray crystallographic methods. These studies have discovered that monomeric A-TIM can bind compounds completely different from the natural substrate. Studies on three different classes of binder molecules are reported: (i) true substrate analogues of wild type TIM, (ii) substrate analogues that have an extended hydrophobic tail, and (iii) more extended, phosphate containing substrate analogues. In addition to this, the A-TIM active site was shown to be competent. In general these studies illustrate the importance of protein crystallography for characterizing the binding properties of enzyme variants being studied in enzyme discovery projects. / Tiivistelmä Entsyymit voivat toimia ylivoimaisina katalyytteinä monissa kemianteollisuuden prosesseissa johtuen niiden hyvästä spesifisyydestä, valikoimiskyvystä, alhaisesta energiantarpeesta ja ympäristöystävällisyydestä. Näistä ominaisuuksista huolimatta entsyymien kaikkien mahdollisuuksien hyödyntämisen esteenä on monia haasteita. Tarvittavia ominaisuuksia ovat katalyyttinen tehokkuus, saatavuus suurina määrinä, alhainen hinta, alhainen tuoteinhibitio sekä korkea aktiivisuus ja stabiilisuus prosessiolosuhteissa. TIM-tynnyrirakenne on yleisin ja monipuolisin proteiinien laskostumisrakenne luonnossa esiintyvissä entsyymeissä. Tässä rakenteessa katalyyttisesti aktiiviset aminohappotähteet ovat sijoittuneet tynnyrirakenteen toiselle puolelle, kun taas stabiilisuuden kannalta tärkeät aminohappotähteet ovat sijoittuneet kokonaan toiselle puolelle. Tämä erityinen rakenne antaa mahdollisuuden muokata proteiinin katalyyttistä aktiivisuutta vaikuttamatta haitallisesti sen stabiilisuuteen. Tämä on täydellinen lähtökohta proteiininmuokkaukselle. Tässä tutkimusprojektissa käytettiin ns. järkiperäistä suunnittelua monomeerisen trioosifosfaatti-isomeraasivariantin (A-TIM) luomisessa. Tämän tutkimustyön pääasialliset tavoitteet olivat (i) uusien sitoutujien löytäminen ja (ii) uuden, suuremman sitoutumistaskun ominaisuuksien määrittäminen röntgenkristallografisilla menetelmillä. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että A-TIM kykenee sitomaan yhdisteitä, jotka ovat täysin erilaisia luonnolliseen substraattiin verrattuna. Tässä tutkimuksessa kuvaillaan kolmenlaisia sitoutujia: (i) todelliset villityypin entsyymin substraattianalogit, (ii) substraattianalogit, joihin on liitetty hydrofobinen hiilivetyketju ja (iii) villityypin substraattia suuremmat sokerifosfaatit. Tämän lisäksi A-TIM:n aktiivisen keskuksen todistettiin olevan toimintakykyinen. Yleisellä tasolla tämä tutkimus osoittaa röntgenkristallografisten menetelmien tärkeyden entsyymienmuokkausprojekteissa, joissa entsyymivarianttien ominaisuuksien määritys on tärkeää.

Abstract Grazing by reindeer (Rangifer tarandus L.) affects vegetation and soil microbial processes in tundra ecosystems. It is considered that grazing can induce two alternative vegetation states that differ in plant species composition and the rate of nutrient cycling. I hypothesised that these alternative vegetation states differ in ecosystem responses to climate warming. I tested the hypothesis using a factorial warming and fertilisation experiment on long-term lightly grazed (LG) and heavily grazed (HG) tundra. The reindeer grazing induced vegetation shift from dwarf shrubs to graminoids increased microbial activities for SOM decomposition. The grazer-induced shifts in vegetation and microbial activities in combination with the fertilisation via urine and faeces had important consequences on soil N availability and soil C quality that determined the ecosystem-level consequences of climate warming. Due to higher soil N availability, warming increased plant productivity (GEP) on HG but not on LG tundra, where N limitation prevented the warming-increased plant production. The varying effects of warming on GEP at different grazing intensities determined the effects of warming on ecosystem net C sink, which was unaffected by warming on HG but decreased on LG tundra. Reindeer grazing reduced the soil C quality, as soils under LG stored a higher proportion of carbohydrates vulnerable to microbial decomposition than soils under HG. According to laboratory soil incubations, the grazer-induced reduction in soil C quality mitigated the responses of soil microbial activity to prolonged warming. Warming caused a stronger decrease in concentrations of phenolics, an important means of plant defence against biotic and abiotic stresses, in Empetrum nigrum ssp. hermaphroditum under HG than LG. Grazing history by reindeer, with the associated vegetation shift from dwarf shrubs to graminoids, can significantly alter the ecosystem-level consequences of climate warming. Overall, this thesis highlights that the effects of reindeer grazing on soil properties, soil N availability and C quality, are important determinants of the ecosystem responses to climate warming. Therefore, future research on climate warming should take into account herbivores and aim towards a more holistic approach that includes both aboveground and belowground components of the ecosystem. / Tiivistelmä Tundralla porolaidunnus vaikuttaa kasvillisuuteen ja maaperän mikrobien toimintaan. Porolaidunnus voi aikaansaada kaksi vaihtoehtoista kasvillisuuden tilaa, jotka eroavat toisistaan paitsi kasvilajiston myös ravinnekierron suhteen. Esitin hypoteesin, jonka mukaan ilmaston lämpenemisen vaikutukset eroavat tundratyypeillä, jotka edustavat vaihtoehtoisia kasvillisuustiloja. Testasin hypoteesia faktoriaalisen lämmitys- ja lannoituskokeen avulla tundra-alueilla, joilla poron laidunnuspaine on ollut pitkäaikaisesti joko kevyttä tai voimakasta. Poron aiheuttama kasvillisuusmuutos varpuvaltaisesta heinävaltaiseksi lisäsi maaperän mikrobien hajotusaktiivisuutta. Poron aiheuttamat erot kasvillisuudessa ja mikrobiaktiivisuuksissa yhdessä virtsan ja papanoiden lannoittavan vaikutuksen kanssa muuttivat maaperän typen saatavuutta sekä hiilen laatua. Erot maaperän ominaisuuksissa puolestaan ohjasivat ilmaston lämpenemisen ekosysteemitason vaikutuksia. Lämmitys kasvatti ekosysteemituotantoa ravinteikkaalla voimakkaasti laidunnetulla tundralla mutta ei kevyesti laidunnetulla tundralla, joka oli typpirajoitteinen. Lämmityksen erilaiset vaikutukset ekosysteemituotantoon eri laidunpaineissa määrittivät lämmityksen vaikutuksen ekosysteemin hiilinieluun, joka pysyi muuttumattomana voimakkaasti laidunnetulla tundralla mutta pieneni kevyesti laidunnetulla tundralla. Porolaidunnus alensi maaperän hiilen laatua, ja kevyesti laidunnetulla tundralla maaperässä oli enemmän mikrobien hajotukselle alttiita hiilihydraatteja kuin voimakkaasti laidunnetulla tundralla. Laboratoriossa suoritetun inkubaatiokokeen perusteella maaperän hiilen alhaisempi laatu lievensi mikrobien hajotusaktiivisuuden vastetta pitkäaikaiseen lämmitykseen. Lämmitys vähensi pohjanvariksenmarjan fenoliyhdisteiden, jotka ovat tärkeä osa kasvien puolustusta bioottisia ja abioottisia stressitekijöitä vastaan, pitoisuuksia enemmän voimakkaasti kuin kevyesti laidunnetulla tundralla. Poron laidunnushistoria yhdessä kasvillisuusmuutoksen kanssa voi merkittävästi vaikuttaa ilmaston lämpenemisen ekosysteemitason seurauksiin. Tämän väitöstyön tulokset osoittavat, että poron vaikutukset maaperän typpeen ja hiileen määrittävät lämpenemisen vaikutukset ekosysteemissä. Tulevaisuudessa ilmastonmuutostutkimuksen pitäisikin kokonaisvaltaisemmin huomioida sekä herbivorian että ekosysteemin eri osien merkitys.

Abstract Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer-associated death in women in Finland. Although ovarian cancer is relatively common, the precise mechanism of its development is still unknown. Additionally, it appears that the modes of pathogenesis differ depending on histotype. Although the initial response to platinum-based chemotherapy is usually good, the majority of ovarian cancer patients relapse and develop platinum resistance. This is a major problem in the treatment of ovarian cancer. Reactive oxygen species (ROS) are metabolites of oxygen. They are continuously formed in normal cells as a by-product of aerobic respiration and they play an important role in normal cell functions. Oxidative stress occurs when ROS formation overrides the antioxidative defence system. Oxidative stress is associated with carcinogenesis. A small proportion of cancer cells are stem cells that survive initial chemotherapy. These cells are suspected of being associated with the development of platinum resistance. To evaluate the significance of oxidative stress in ovarian cancer we examined ROS-derived damage and antioxidant regulators in benign and borderline ovarian tumours and ovarian cancer samples by immunohistochemistry and analysis of serum samples. The existence of cancer stem cell markers was also assessed in ovarian cancer samples. The expression levels of various markers were compared with clinicopathological parameters. Our results confirm that oxidative stress (8-hydroxydeoxyguanosine) exists in benign tumours and antioxidant enzymes, such as peroxiredoxins and thioredoxin are widely expressed in benign and borderline tumours. Oxidative stress was associated with poor survival, higher stage and platinum resistance in ovarian cancer. Oxidative stress markers were more strongly expressed in certain histotypes of ovarian cancer, such as serous and endometrioid type. Cancer stem cell markers were found in ovarian cancer and they were associated with the development of platinum resistance. These observations are beneficial in understanding the pathobiology of ovarian cancer and help in the design of new treatment options. / Tiivistelmä Munasarjasyöpä on yksi merkittävistä syöpäkuolleisuuden aiheuttajista naisilla Suomessa. Se on kohtalaisen yleinen, mutta sen perimmäinen syntymismekanismi on vielä epäselvä. Lisäksi näyttää siltä, että eri histologioilla syntymekanismit poikkeavat toisistaan. Vaikka yleensä platinapohjaisella solunsalpaajahoidolla saadaan hyvä vaste, suurimmalla osalla hoidetuista potilaista tauti uusii ja kehittyy vastustuskyky platinapohjaisille solunsalpaajille. Tämä on suuri ongelma munasarjasyövän hoidossa. Vapaat radikaalit ovat hapen johdannaisia. Niitä muodostuu jatkuvasti soluissa soluhengityksen sivutuotteena, ja niillä on tärkeä merkitys normaaleissa solun toiminnoissa. Jos vapaiden radikaalien tuotanto ylittää antioksidatiivisen puolustusjärjestelmän, syntyy oksidatiivinen stressitilanne. Oksidatiivisen stressin on todettu olevan yhteydessä useiden syöpien syntymiseen. Osaa syövän soluista kutsutaan kantasoluiksi. Nämä solut voivat selvitä solunsalpaajahoidoista ja niiden epäillään olevan yhteydessä vastustuskyvyn kehittymisessä platinapohjaisia sytostaatteja kohtaan. Tutkimuksessamme arvioimme oksidatiivisen stressin merkitystä munasarjakasvaimissa. Tutkimme vapaiden radikaalien aiheuttamia vaurioita ja antioksidatiivisia säätelijöitä hyvänlaatuisissa, rajalaatuisissa sekä munasarjasyöpä kasvaimissa immunohistokemiallisesti ja seeruminäytteistä. Lisäksi selvitimme syövän kantasolumerkkiaineiden esiintymistä munasarjasyövässä. Tutkittujen merkkiaineiden pitoisuuksia verrattiin kliinisiin potilastietoihin. Tutkimustuloksemme mukaan oksidatiivista stressiä (8-hydroxydeoxyguanosine) esiintyi jo hyvänlaatuisissa kasvaimissa. Myös antioksidatiiviset entsyymit, kuten peroksiredoksiinit ja tioredoksiini, esiintyivät jo hyvänlaatuisissa ja rajalaatuisissa kasvaimissa. Oksidatiivinen stressi oli yhteydessä huonompaan tautiennusteeseen ja platinakohtaisen vastustuskyvyn kehittymiseen. Oksidatiivista stressiä oli enemmän seroosissa ja endometrioidissa munasarjasyöpätyypissä. Syövän kantasolumerkkiaineita esiintyi munasarjasyövässä, ja ne olivat yhteydessä huonontuneeseen hoitovasteeseen platinapohjaisille solunsalpaajille. Tulokset auttavat ymmärtämään munasarjasyövän syntymekanismeja ja suunnittelemaan uusia hoitovaihtoehtoja erityyppisissä munasarjasyövissä.

Abstract 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases (2-OGDDs) are an enzyme family that contains many enzymes that modify chromatin in extensive ways. These enzymes include several histone lysine demethylases (KDMs) and TET enzymes that convert methylated cytosine (5-mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) ultimately leading to DNA demethylation. Disturbed DNA and histone methylation are found in many cancers. However, the role of KDMs and TETs behind these oncogenic changes has so far not been fully investigated. This study focused on the role of these chromatin-modifying enzymes in cancers with special emphasis on enzyme kinetic studies. Cancers with inactivating fumarate hydratase (FH), succinate dehydrogenase (SDH) and isocitrate dehydrogenase (IDH) mutations accumulate fumarate, succinate and R-2-hydroxyglutarate, respectively. In this study we showed how these cancer-associated 2-oxoglutarate (2-OG) analogues can inhibit the TET enzymes and many of the KDMs leading to lower 5-hmC levels and increased H3K27 and H3K9 methylation on chromatin, respectively. We also characterized kinetic properties of acute myeloid leukaemia (AML)-associated TET2 mutants and found that their ability to bind 2-OG or iron was impaired leading to diminished catalytic activity. Tumours are often hypoxic due to inadequate vasculature and blood supply. The TET enzymes and KDMs require oxygen for the reactions they catalyse. We determined the oxygen affinity of TETs and many KDMs and found that a H3K27 demethylase KDM6A has a remarkably low affinity for oxygen indicating that it is inactivated in hypoxic tumours and tissues. H3K27 methylation was found to be increased in hypoxic cells and this blocked cell differentiation. Altogether, these studies shed light on the mechanisms behind the altered DNA and histone methylation found in several cancers with hypoxic conditions or FH, SDH and IDH mutations. Altered DNA and histone methylation has previously been associated with progression of cancer, such as epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We now linked catalytic inhibition of 2-OGDDs to disturbed DNA and histone methylation that can account for altered cell differentiation, EMT and increased aggressiveness and invasiveness of cancers. / Tiivistelmä 2-oksoglutaraatista riippuvaiset dioksygenaasit ovat entsyymiperhe, johon kuuluu useita entsyymejä, jotka muokkaavat kromatiinin epigeneettisiä merkkejä monin tavoin. Näitä entsyymejä ovat mm. DNA:n demetylaatioon vaikuttavat TET-entsyymit sekä useat histonidemetylaasit. Vaikka muutoksia DNA:n ja histonien metylaatiotasoissa on havaittu useissa syövissä, ei näiden entsyymien roolia muutosten taustalla ole vielä tutkittu. Tämä tutkimus kohdistui näiden epigenetiikkaan vaikuttavien entsyymien roolin ymmärtämiseen syövissä keskittyen erityisesti kyseisten entsyymien kinetiikkaan. Useissa syövissä on havaittu fumaraattihydrataasin, sukkinaattidehydrogenaasin ja isositraattidehydrogenaasien aktiivisuuteen vaikuttavia mutaatioita, jotka johtavat fumaraatin, sukkinaatin ja R-2-hydroksiglutaraatin kertymiseen syöpäsoluihin. Tässä tutkimuksessa osoitimme, kuinka nämä karsinogeeniset 2-oksoglutaraattianalogit voivat inhiboida TET-entsyymejä ja histonidemetylaaseja, mikä alentaa 5-hydroksimetyylisytosiinitasoja ja lisää histonien metylaatiota. Näytämme myös, kuinka tietyillä akuutissa myelooisessa leukemiassa esiintyvillä TET2-mutanteilla on heikentynyt kyky sitoa 2-oksoglutaraattia tai rautaa, mikä johtaa entsyymien aktiivisuuden laskuun. Kasvainkudoksissa happipitoisuudet ovat usein matalia nopean kasvun ja puutteellisen verisuonituksen vuoksi. TET-entsyymit ja histonidemetylaasit vaativat happea katalysoimissaan reaktioissa. Määritimme TET-entsyymien ja monien histonidemetylaasien riippuvuutta hapesta ja osoitimme, että H3K27-histonidemetylaasi KDM6A on erittäin riippuvainen hapesta, mikä osoittaa, ettei se pysty toimimaan kasvaimissa ja kudoksissa, joissa happipitoisuudet ovat matalia. Huomasimme, että vähähappisissa olosuhteissa solujen H3K27 metylaatio on lisääntynyt, mikä johti erilaistumisen estymiseen soluissa. Tämä tutkimus paljasti uusia mekanismeja useista syövistä löytyneiden muuntuneiden DNA:n ja histonien metylaatiotasojen taustalla. Häiriintynyt DNA:n ja histonien metylaatio on aiemmin yhdistetty syöpien etenemiseen, erityisesti solujen erilaistumisen häiriintymisen kannalta. Tässä tutkimuksessa yhdistimme 2-oksoglutaraatista riippuvaisten entsyymien inhibition häiriintyneeseen DNA:n ja histonien metylaatioon, joka voi johtaa muuntuneeseen solujen erilaistumiseen ja lopulta lisääntyneeseen syöpien aggressiivisuuteen ja invasiivisuuteen.

Abstract Cancer is the leading cause of death worldwide. Despite the significant research effort, underlying mechanisms of carcinogenic processes are still poorly understood. In recent decades, a group of extremely reactive oxygen metabolites, reactive oxygen species (ROS), have been linked closely to carcinogenesis. Levels of ROS are constantly controlled by antioxidants to ensure stable redox balance in our cells. An aberrant cellular redox balance is thought to be connected to carcinogenesis by inflicting damage to cellular macromolecules and disturbing normal cellular signalling. In this work, the role of ROS in carcinogenesis was studied by observing the ROS-derived DNA damage marker 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in breast cancer and endometriosis-associated ovarian cancer. This marker was also measured in connection with endometriosis and PCOS to study the early stages of the carcinogenic process. In addition, peroxiredoxin antioxidant enzymes were studied in endometriosis-associated ovarian cancer to explore their impact on the carcinogenic process and relationship with ROS-derived DNA damage. There seems to be a decreasing trend in the expression of 8-OHdG in the development of breast cancer and endometriosis-associated ovarian cancer. In breast cancer, low levels of 8-OHdG in serum and in tumour tissue were found to be associated with more aggressive disease. In endometriosis-associated ovarian cancer, 8-OHdG and Prx II expressions in tissue decreased with malignant transformation from benign endometriosis tissue to ovarian cancer. Patients with PCOS were found to have lower levels of 8-OHdG in serum compared with healthy controls and metformin treatment further decreased 8-OHdG levels in obese patients. These results, together with observations is previous studies indicate that in breast cancer and endometriosis-associated ovarian cancer, a high level of ROS-derived DNA damage could be significant factor in the initiation stage of carcinogenesis, whereas in later stages carcinomas benefit from lower ROS levels that support tumour growth and survival via cellular signalling. In endometriosis, there seem to be high amounts of ROS-derived DNA damage, which could explain the increased ovarian cancer risk, while in PCOS, aberrant ROS levels could contribute to the pathogenesis of the disease itself and also to possible cancer incidence by inducing abnormal cellular signalling. / Tiivistelmä Syöpä on nykyisin maailman yleisin kuolinsyy. Vaikka syöpätutkimukseen kohdistetaan maailmanlaajuisesti huomattavia resursseja, syövän kehittymisen perimmäinen syy on edelleen heikosti tunnettu. Yhä kasvavan todistusaineiston perusteella happiradikaalien epäillään liittyvän läheisesti syövän kehittymiseen. Nämä erittäin reaktiiviset hapen aineenvaihduntatuotteet ovat välttämättömiä solujemme normaalille toiminnalle, mutta liian suurina määrinä ne voivat vaurioittaa solun rakenteita ja häiritä solun normaalia viestintää. Solut sisältävät useita antioksidantteja, joiden tärkeimpänä tehtävänä on kontrolloida happiradikaalien määrää ja näin ylläpitää solun hapetus-pelkistys -tasapaino. Tässä väitöskirjatutkimuksessa tutkittiin happiradikaalien yhteyttä syövän kehittymiseen tarkastelemalla niiden aiheuttaman DNA-vaurion merkkiainetta, 8-hydroksideoksiguanosiinia (8-OHdG), rintasyövässä ja endometrioosiin liittyvässä munasarjasyövässä sekä peroksiredoksiiniperheen antioksidanttientsyymejä endometrioosiin liittyvässä munasarjasyövässä. 8-OHdG:n avulla selvitettiin myös munasarjojen monirakkulaoireyhtymän (PCOS) ja endometrioosin yhteyttä syövän kehittymiseen. Lisäksi tutkittiin metformiinin vaikutusta happiradikaalien aiheuttamaan DNA-vaurioon. Väitöskirjatutkimuksen tulosten perusteella 8-OHdG:n määrä vähentyy rintasyövän edetessä ja endometrioosiin liittyvän munasarjasyövän kehittyessä. Matalat 8-OHdG -tasot syöpäkudoksessa ja verinäytteissä ovat yhteydessä aggressiivisempaan taudinkuvaan rintasyövässä. Endometrioosiin liittyvässä munasarjasyövässä kudoksen ilmentämä 8-OHdG ja Prx II vähentyi asteittain siirryttäessä hyvänlaatuisesta endometrioosista munasarjasyöpään. Munasarjojen monirakkulaoireyhtymässä potilaiden verinäytteiden 8-OHdG -tasot olivat merkittävästi matalammat terveisiin verrokkeihin verrattuna. Korkeilla happiradikaalipitoisuuksilla ja niistä aiheutuvalla DNA-vauriolla on väitöskirjatutkimuksen tulosten perusteella tärkeä rooli syövän syntyvaiheessa, kun taas syövän myöhemmissä kehitysvaiheissa matalat happiradikaalipitoisuudet tukevat syövän kasvua ja selviytymistä soluviestinnän avulla. Endometrioosipotilaiden kohonnut munasarjasyöpäriski vaikuttaisi olevan seurausta runsaasta happiradikaalien aiheuttamasta DNA-vauriosta endometrioosikudoksessa. Munasarjojen monirakkulaoireyhtymässä poikkeavien happiradikaalitasojen aiheuttama puutteellinen soluviestintä liittyy mahdollisesti taudin patogeneesiin ja syöpäriskiin.

Abstract The hepatic inducible Cytochrome P450s (CYPs) generally prime xenobiotics for elimination. Murine CYP2A5 and human CYP2A6 share similar xenobiotic substrates and some regulatory features. Recently, they were shown to oxidize bilirubin, a byproduct of heme catabolism and a dose-dependent anti- or pro-oxidant, to biliverdin. In this study, the putative role of the redox-sensitive, cytoprotective transcription factor Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) in the regulation of hepatic Cyp2a5 expression and induction under diverse hepatotoxic conditions and altered heme homeostasis was characterized. The coordination of Cyp2a5 and the Nrf2 target gene Heme oxygenase-1 (Hmox1), which determines bilirubin formation from heme, responses to heavy metals and modulators of heme homeostasis, was studied in cultured wildtype and Nrf2(-/-) mouse primary hepatocytes. Nrf2 was essential for the basal hepatic expression of CYP2A5 in the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria, as well as for its induction by cadmium, lead, methyl mercury and phenethyl isothiocyanate. A functional Nrf2 binding antioxidant response element (ARE) about -2.4 kilobases upstream of the Cyp2a5 transcriptional start site was identified. In contrast to Hmox1, a target of BTB and CNC homology 1 (Bach)-mediated repression via AREs, the regulation of Cyp2a5 did not clearly involve Bach1. Excessive heme induced mainly ER-localized CYP2A5 via Nrf2, which was limited by the Nrf2-independent HMOX1 induction. In heme synthesis blockades, CYP2A5 was enhanced via Nrf2 and additional factors, such as the peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α). The typical CYP2A5 inducers phenobarbital, dibutyryl-cyclic adenosine monophosphate (db-cAMP) and PGC-1α enhance heme synthesis; CYP2A5 was induced via Nrf2 in acute but not chronic phenobarbital exposure without a clear connection to heme, while the responses to db-cAMP and PGC-1α were sensitized in the absence of Nrf2. This suggests novel crosstalk between Nrf2 and PGC-1α. In this study, Cyp2a5 was identified as a sensitive indicator of hepatic Nrf2 pathway activation that could be used, e.g. for in vitro screening of drug candidate hepatotoxicity. The similar subcellular localization and coordination of CYP2A5 and HMOX1 expression in altered heme metabolism support the postulated role for CYP2A5 in bilirubin homeostasis. / Tiivistelmä Vierasaineet stimuloivat maksan Sytokromi P450 (CYP)-entsyymejä, mikä yleensä lisää niiden eliminaatiota. Hiiren CYP2A5 ja ihmisen CYP2A6 ovat lähisukua katalyyttisten ja osin säätelyllisten yhteneväisyyksiensä puolesta. Vastikään niiden osoitettiin katalysoivan hemin hajoamistuotteen, bilirubiinin hapettumista biliverdiiniksi, mikä saattaisi säädellä sen annosriippuvaisia vaikutuksia antioksidanttina ja oksidanttina. Työssä tutkittiin solustressiä aistivan, suojaavan transkriptiotekijän Nrf2 osuutta Cyp2a5-geenin aktivaatiossa maksatoksisissa olosuhteissa ja hemimetabolian muutoksissa. Cyp2a5:n ja bilirubiinin tuotosta vastaavan, Nrf2-säädellyn Hemioksigenaasi-1 (Hmox1):n vasteita verrattiin viljellyissä villityypin ja poistogeenisen Nrf2(-/-) hiiren primaarimaksasoluissa. Tulokset osoittavat, että Nrf2 ylläpitää CYP2A5:n ilmentymistä endoplasmisella kalvostolla (ER) ja mitokondrioissa sekä välittää sen stimulaation altisteilla kadmium, lyijy, metyylielohopea ja fenetyyli-isotiosyanaatti. Toimiva Nrf2-vasteinen antioksidanttivaste-elementti (ARE) tunnistettiin n. -2,4 kiloemäsparia Cyp2a5-geenin luennan aloituskohdasta ylävirtaan. BTB ja CNC homologia 1 (Bach1)-tekijä, joka on tärkeä Hmox1-säätelijä ja ARE-välitteinen transkription estäjä, ei selkeästi osallistu Cyp2a5:n säätelyyn. Hemin ylimäärä stimuloi CYP2A5:n määrää ER-kalvostolla, Nrf2-riippumattomasti stimuloituvan HMOX1 rajoittaessa Nrf2-reitin aktivaatiota. Hemisynteesin estyessä Nrf2 aktivoi Cyp2a5-geeniä muiden mekanismien kuten peroksisomiproliferaattori-aktivoituva reseptori gamman koaktivaattori-1α (PGC-1α) kanssa. Fenobarbitaali (PB), dibutyryyli-syklinen adenosiinimonofosfaatti (db-cAMP) ja PGC-1α lisäävät tunnetusti hemisynteesiä. Nrf2 havaittiin Cyp2a5:n aktivaatiolle välttämättömäksi akuutissa mutta ei kroonisessa PB-altistuksessa ilman selkeästi havaittua hemin osuutta. Cyp2a5-geenin db-cAMP- ja PGC-1α-vasteinen stimulaatio voimistui merkittävästi toimivan Nrf2-reitin puuttuessa, mikä osoittaa vuoropuhelua Nrf2 ja PGC-1α välillä. Väitöskirjatyössä Cyp2a5 tunnistettiin herkäksi Nrf2-reitin aktivaation maksamarkkeriksi, jota voitaisiin hyödyntää esim. lääkeainekandidaattien maksatoksisuuden seulonnassa soluviljelyssä. CYP2A5:n ja HMOX1:n solunsisäinen kohdentuminen ja ekspressio koordinoituvat hemimetabolian muutoksissa, mikä tukee teoriaa CYP2A5:n roolista bilirubiinin metaboliassa maksassa.