Abstract Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α) and AMP-activated protein kinase (AMPK) are major factors regulating energy homeostasis. In this study, we aimed to investigate how energy flux affects several hepatic functions mediated by these factors. We define a novel role of PGC-1α and AMPK as modulators of the immune system in the liver. We show that PGC-1α is involved in the regulation of a cluster of genes related to the immune system, most importantly Interleukin 1 receptor antagonist (IL1Rn). Since PGC-1α is responsive to energetic stress associated with fasting or physical exercise, the same stimuli promote IL1Rn in hepatocytes. We identify AMPK as an independent inducer of IL1Rn and hypothesise that it could account for the anti-inflammatory effect of the antidiabetic drug metformin. We also demonstrate that metformin reduces expression of Sirtuin 3 (SIRT3) in hepatocytes and promotes acetylation of mitochondrial protein. We suggest that this mechanism, in spite of increased mitochondrial biogenesis, contributes to reduced ATP synthesis in metformin-treated samples. In addition, we demonstrate that Pregnane X receptor (PXR) is induced in the liver during fasting and by PGC-1α in hepatocytes. Furthermore, we describe a negative regulatory mechanism involving SIRT1, activated by pyruvate and interfering with PXR signaling. We show that SIRT1 attenuates PGC-1α-mediated co-activation of PXR and its target genes, i.e. Cyp3a11, with possible implications for drug and xenobiotic metabolism. In conclusion, we demonstrate how energetic stress affects various hepatic functions mediated by PGC-1α and AMPK. Moreover, we describe SIRT1 and metformin as factors capable of modulating this response. / Tiivistelmä Peroksisomiproliferaattori-aktivoituvan reseptori gamman koaktivaattori 1α (PGC-1α) ja AMP:n aktivoima proteiinikinaasi (AMPK) ovat keskeisiä energiametabolian säätelijöitä. Tässä tutkimuksessa oli tavoitteena selvittää kuinka energiataso vaikuttaa useisiin, näiden tekijöiden säätelemiin maksan toimintoihin. Osoitamme että PGC-1α ja AMPK tekijöillä on ennestään tuntematon merkitys immuunijärjestelmän säätelyssä maksassa. Näytämme myös, että PGC-1α säätelee joukkoa geenejä, joiden tehtävä liittyy immuunijärjestelmään, tärkeimpänä Interleukiini 1 reseptori antagonistia (IL1Rn). Paastoon ja fyysiseen aktiivisuuteen liittyvä energiastressi aktivoi PGC-1α:aa ja näiden samojen stimuluksien havaittiin lisäävän myös IL1Rn tasoa hepatosyyteissä. Havaitsimme AMPK:n olevan itsenäinen IL1Rn indusori ja hypoteesimme mukaan tämä voi välittää diabeteslääkkeenä käytettävän metformiinin anti-inflammatorisia vaikutuksia. Osoitamme myös, että metformiini alentaa Sirtuiini (SIRT) 3:n ekspressiota maksasoluissa ja lisää mitokondriaalisten proteiinien asetylaatiota. Uskomme tämän mekanismin, huolimatta lisääntyneestä mitokondrioiden biogeneesistä, myötävaikuttavan vähentyneeseen ATP synteesiin metformiinikäsitellyissä näytteissä. Lisäksi osoitamme, että paasto ja PGC-1α indusoivat Pregnaani X reseptorin (PXR) ilmentymistä maksasoluissa. Kuvaamme myös PXR signalointiin vaikuttavan ja pyruvaatin aktivoiman, SIRT1:n välitteisen, negatiivisen säätelymekanismin. SIRT1 estää PGC-1α välitteistä PXR koaktivaatiota ja kohdegeenien, kuten Cyp3a11, aktivaatiota, millä voidaan olettaa olevan merkitystä lääkeaineiden ja vierasaineiden metaboliaan. Yhteenvetona osoitamme, että energiastressi PGC-1α:n ja AMPK:n välittämänä vaikuttaa useisiin maksan toimintoihin. Lisäksi näytämme, että SIRT1 ja metformiini voivat moduloida näitä vaikutuksia.

Abstract Hematopoietic cells, i.e., erythrocytes, platelets and white blood cells, differentiate from hematopoietic stem cells in a process that is similar in vertebrates. Hematopoiesis is regulated by molecules expressed by both the hematopoietic stem and progenitor cells and the surrounding microenvironments. Knowledge of these molecules is important since many of the genes involved in normal hematopoiesis are mutated in leukemia. Furthermore, this information can be utilized in more efficient isolation and expansion of hematopoietic cells in vitro. However, these molecules are not yet sufficiently characterized. Transmembrane immunoglobulin and mucin domain (TIM) genes form a known family of immunoregulators. In mammals, TIM-4 is expressed by antigen presenting cells, while TIM-1, TIM-2 and TIM-3 are expressed by T cells, in which they regulate differentiation of TH cells. The role of TIM molecules in hematopoiesis has not yet been investigated. The aim of this thesis work was to identify and analyze novel molecules involved in embryonic hematopoiesis using chicken and mouse as model organisms. This was carried out by generating a cDNA library of hematopoietic stem and progenitor cells from embryonic chicken para-aortic region. Both previously known and novel candidate genes were identified from the library. Among them, we found homologs to tim genes. Their expression and role in hematopoiesis was studied further. TIM-2 expression was shown to be tightly governed during B cell development. It is expressed by common lymphoid progenitors and highly proliferative large-pro and large pre-B cells during both fetal liver and adult bone marrow hematopoiesis. In mouse, tim-4 expression was restricted to fetal liver CD45+F4/80+ cells. Furthermore, two distinct populations were identified: F4/80hiTIM-4hi and F4/80loTIM-4lo. The results suggest that the F4/80hiTIM-4hi cells are yolk sac-derived macrophages and the F4/80loTIM-4lo cells myeloid progenitors. This work shows for the first time that TIM family molecules are expressed during hematopoiesis. TIM-2- and TIM-4 are expressed by specific cell types during hematopoietic cell development, and in the future they may be utilized as markers in isolation of hematopoietic progenitor cells. / Tiivistelmä Verisolut eli punasolut, verihiutaleet ja immuunipuolustuksessa tärkeät valkosolut kehittyvät alkion veren kantasoluista prosessissa, joka on kaikissa selkärankaisissa samankaltainen. Veren kanta- ja esisolujen sekä ympäröivän mikroympäristön tuottamat molekyylit säätelevät hematopoieesia eli verisolujen kehitystä. Näiden molekyylien tunteminen on tärkeää, sillä useat normaalia verisolujen kehitystä säätelevät geenit ovat osallisena myös verisyöpien synnyssä. Lisäksi tätä tietoa on mahdollista hyödyntää verisolujen tehokkaammassa eristämisessä ja kasvattamisessa hoitoja varten. Immuunipuolustuksen solut, kuten syöjäsolut eli makrofagit ja T-solut, ilmentävät TIM-molekyylejä (Transmembrane Immunoglobulin and Mucin). Ne toimivat immunologisen vasteen säätelyssä sekä solusyönnissä, mutta niiden roolia verisolujen kehittymisessä ei ole selvitetty aikaisemmin. Tässä väitöstutkimuksessa etsittiin uusia hematopoieesiin vaikuttavia geenejä käyttäen mallieläiminä sekä kanaa että hiirtä. Tutkimuksessa luotiin geenikirjasto kanan alkion para-aortaalisen alueen veren kanta- ja esisoluista. Kirjastosta tunnistettiin useita ennalta tiedettyjä sekä uusia verisolujen kehitykseen vaikuttavia geenejä. Tutkimuksessa analysoitiin tarkemmin kirjastosta löytyneiden TIM-geeniperheen jäsenten ilmentymistä ja roolia verisolujen kehityksessä. Tutkimuksessa osoitettiin, että TIM-2 proteiinin ilmentymistä säädellään tarkasti B-solujen kehityksen aikana. Lymfosyyttien yhteiset esisolut sekä suuret pro-B- ja pre-B-solut ilmentävät TIM-2 proteiinia B-solukehityksen aikana sekä alkion maksassa että aikuisen luuytimessä. Hiiren alkiossa tim-4 geenin ilmentyminen oli rajoittunut maksaan, jossa erottui kaksi erillistä solupopulaatiota: F4/80hiTIM-4hi ja F4/80loTIM-4lo. Tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että maksan F4/80hiTIM-4hi solut ovat ruskuaispussista lähtöisin olevia syöjäsoluja ja F4/80loTIM-4lo solut myeloidisen linjan esisoluja. Tämä tutkimus on ensimmäinen osoitus TIM-molekyylien ilmentymisestä kehittyvissä verisoluissa. Havaitsimme, että TIM-2 ja TIM-4-molekyylejä ekspressoidaan tietyissä soluissa verisolujen erilaistumisen aikana, joten tulevaisuudessa niitä on mahdollista käyttää merkkiproteiineina hematopoieettisten solujen esiasteita eristettäessä.

Abstract The hepatic inducible Cytochrome P450s (CYPs) generally prime xenobiotics for elimination. Murine CYP2A5 and human CYP2A6 share similar xenobiotic substrates and some regulatory features. Recently, they were shown to oxidize bilirubin, a byproduct of heme catabolism and a dose-dependent anti- or pro-oxidant, to biliverdin. In this study, the putative role of the redox-sensitive, cytoprotective transcription factor Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) in the regulation of hepatic Cyp2a5 expression and induction under diverse hepatotoxic conditions and altered heme homeostasis was characterized. The coordination of Cyp2a5 and the Nrf2 target gene Heme oxygenase-1 (Hmox1), which determines bilirubin formation from heme, responses to heavy metals and modulators of heme homeostasis, was studied in cultured wildtype and Nrf2(-/-) mouse primary hepatocytes. Nrf2 was essential for the basal hepatic expression of CYP2A5 in the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria, as well as for its induction by cadmium, lead, methyl mercury and phenethyl isothiocyanate. A functional Nrf2 binding antioxidant response element (ARE) about -2.4 kilobases upstream of the Cyp2a5 transcriptional start site was identified. In contrast to Hmox1, a target of BTB and CNC homology 1 (Bach)-mediated repression via AREs, the regulation of Cyp2a5 did not clearly involve Bach1. Excessive heme induced mainly ER-localized CYP2A5 via Nrf2, which was limited by the Nrf2-independent HMOX1 induction. In heme synthesis blockades, CYP2A5 was enhanced via Nrf2 and additional factors, such as the peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α). The typical CYP2A5 inducers phenobarbital, dibutyryl-cyclic adenosine monophosphate (db-cAMP) and PGC-1α enhance heme synthesis; CYP2A5 was induced via Nrf2 in acute but not chronic phenobarbital exposure without a clear connection to heme, while the responses to db-cAMP and PGC-1α were sensitized in the absence of Nrf2. This suggests novel crosstalk between Nrf2 and PGC-1α. In this study, Cyp2a5 was identified as a sensitive indicator of hepatic Nrf2 pathway activation that could be used, e.g. for in vitro screening of drug candidate hepatotoxicity. The similar subcellular localization and coordination of CYP2A5 and HMOX1 expression in altered heme metabolism support the postulated role for CYP2A5 in bilirubin homeostasis. / Tiivistelmä Vierasaineet stimuloivat maksan Sytokromi P450 (CYP)-entsyymejä, mikä yleensä lisää niiden eliminaatiota. Hiiren CYP2A5 ja ihmisen CYP2A6 ovat lähisukua katalyyttisten ja osin säätelyllisten yhteneväisyyksiensä puolesta. Vastikään niiden osoitettiin katalysoivan hemin hajoamistuotteen, bilirubiinin hapettumista biliverdiiniksi, mikä saattaisi säädellä sen annosriippuvaisia vaikutuksia antioksidanttina ja oksidanttina. Työssä tutkittiin solustressiä aistivan, suojaavan transkriptiotekijän Nrf2 osuutta Cyp2a5-geenin aktivaatiossa maksatoksisissa olosuhteissa ja hemimetabolian muutoksissa. Cyp2a5:n ja bilirubiinin tuotosta vastaavan, Nrf2-säädellyn Hemioksigenaasi-1 (Hmox1):n vasteita verrattiin viljellyissä villityypin ja poistogeenisen Nrf2(-/-) hiiren primaarimaksasoluissa. Tulokset osoittavat, että Nrf2 ylläpitää CYP2A5:n ilmentymistä endoplasmisella kalvostolla (ER) ja mitokondrioissa sekä välittää sen stimulaation altisteilla kadmium, lyijy, metyylielohopea ja fenetyyli-isotiosyanaatti. Toimiva Nrf2-vasteinen antioksidanttivaste-elementti (ARE) tunnistettiin n. -2,4 kiloemäsparia Cyp2a5-geenin luennan aloituskohdasta ylävirtaan. BTB ja CNC homologia 1 (Bach1)-tekijä, joka on tärkeä Hmox1-säätelijä ja ARE-välitteinen transkription estäjä, ei selkeästi osallistu Cyp2a5:n säätelyyn. Hemin ylimäärä stimuloi CYP2A5:n määrää ER-kalvostolla, Nrf2-riippumattomasti stimuloituvan HMOX1 rajoittaessa Nrf2-reitin aktivaatiota. Hemisynteesin estyessä Nrf2 aktivoi Cyp2a5-geeniä muiden mekanismien kuten peroksisomiproliferaattori-aktivoituva reseptori gamman koaktivaattori-1α (PGC-1α) kanssa. Fenobarbitaali (PB), dibutyryyli-syklinen adenosiinimonofosfaatti (db-cAMP) ja PGC-1α lisäävät tunnetusti hemisynteesiä. Nrf2 havaittiin Cyp2a5:n aktivaatiolle välttämättömäksi akuutissa mutta ei kroonisessa PB-altistuksessa ilman selkeästi havaittua hemin osuutta. Cyp2a5-geenin db-cAMP- ja PGC-1α-vasteinen stimulaatio voimistui merkittävästi toimivan Nrf2-reitin puuttuessa, mikä osoittaa vuoropuhelua Nrf2 ja PGC-1α välillä. Väitöskirjatyössä Cyp2a5 tunnistettiin herkäksi Nrf2-reitin aktivaation maksamarkkeriksi, jota voitaisiin hyödyntää esim. lääkeainekandidaattien maksatoksisuuden seulonnassa soluviljelyssä. CYP2A5:n ja HMOX1:n solunsisäinen kohdentuminen ja ekspressio koordinoituvat hemimetabolian muutoksissa, mikä tukee teoriaa CYP2A5:n roolista bilirubiinin metaboliassa maksassa.