Abstract Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies and causes of cancer deaths in Finland. Increased number of tumor-infiltrating immune cells has been associated with improved survival in CRC. However, accurate, reproducible analysis methods, as well as better understanding of the interrelationships between different inflammatory markers would be important in order to establish a valuable prognostic and potentially predictive tool. In these studies, a computer-assisted method for the analysis of the densities of tumor-infiltrating immune cells and a quantitative method for the evaluation of CRC-associated lymphoid reaction (CLR) were adopted and validated. Utilizing the new methods, the inflammatory cell infiltration was characterized in independent groups of 418 (Cohort 1) and 149 (Cohort 2) CRC patients. Serum matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) levels were measured in Cohort 2 and in a control group of 83 healthy age- and gender-matched controls. The automated cell counting method was found accurate and reproducible. In the tumor samples, there were high positive correlations between different types of immune cells, with the exception of mast cells and CD1a+ immature dendritic cells. High numbers of T cells predicted improved disease-free survival. High CLR density correlated with low tumor stage, but also with better survival regardless of stage. The median serum MMP-8 level of the patients was more than three times higher than that of the healthy controls. In conclusion, the present studies provide insight into the significance of various immune cell types and inflammatory markers in CRC and validate new methods for the analysis of immune cell infiltration in CRC. The results suggest that, especially, the densities of tumor-infiltrating T cells and CLR represent relevant prognostic indicators in CRC. Further studies are needed to evaluate the potential value of serum MMP-8 as an aid for CRC diagnostics, surveillance, or prognostication. / Tiivistelmä Kolorektaalisyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisista kasvaintaudeista ja syöpäkuolemien aiheuttajista Suomessa. Tulehdussolujen korkean määrän kasvainnäytteissä on havaittu olevan yhteydessä potilaiden parempaan ennusteeseen. Tarkat ja luotettavat analyysimenetelmät sekä tieto eri tulehdusmerkkiaineiden keskinäisistä yhteyksistä olisivat tärkeitä, jotta tulehdussolukon määritystä voitaisiin luotettavasti käyttää potilaiden ennusteen arviointiin. Tutkimuksessa otettiin käyttöön ja validoitiin uusi tietokonepohjainen menetelmä kasvaimen tulehdussolukon arviointiin sekä uusi menetelmä kolorektaalisyövän imukeräsreaktion arviointiin. Kasvainnäytteiden tulehdussolukon määrää ja laatua analysoitiin itsenäisissä 418 (Kohortti 1) ja 149 (Kohortti 2) kolorektaalisyöpäpotilaan aineistoissa uusia menetelmiä hyödyntäen. Lisäksi kohortilta 2 sekä 83 terveeltä ikä- ja sukupuolivalikoidulta verrokilta määritettiin seerumin matriksin metalloproteinaasi-8 (MMP-8) -taso. Tietokonepohjaisen kuva-analyysin tarkkuus ja toistettavuus todettiin erinomaiseksi. Kasvainnäytteistä analysoitujen tulehdussolutyyppien määrät olivat riippuvaisia toisistaan mast-soluja ja CD1a+ epäkypsiä dendriittisoluja lukuun ottamatta. T-solujen runsas määrä oli yhteydessä taudin vähäisempään uusiutumisriskiin. Korkea imukerästiheys kasvainnäytteissä oli yhteydessä matalaan levinneisyysasteeseen sekä potilaiden parempaan ennusteeseen levinneisyysasteesta riippumatta. Seerumin MMP-8-tason mediaani oli potilailla yli kolme kertaa korkeampi kuin terveillä verrokeilla. Tutkimus tuo lisätietoa eri tulehdussolutyyppien ja tulehdusmerkkiaineiden merkityksestä kolorektaalisyövässä, ja sen tuloksena validoitiin uusia tulehdussolukon analysointimenetelmiä. Tulosten perusteella erityisesti kasvaimen alueen T-solujen ja imukerästen tiheys tuovat hyödyllistä tietoa potilaiden ennusteesta. Lisätutkimuksia tarvitaan seerumin MMP-8:n mahdollisesta soveltuvuudesta kolorektaalisyövän diagnostiikan, seurannan tai ennusteen määrittämisen apuvälineeksi.

Abstract In the Western world, colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers and causes of cancer deaths. It is estimated that up to a third of CRCs represent a recently defined subtype, serrated adenocarcinoma (SAC), which develops via the serrated pathway and differs from conventional cancer by molecular, histological, and clinicopathological characteristics. The oncogenic mutation of BRAF V600E is characteristic to the serrated pathway lesions, and VE1 is a novel antibody that has been reported to recognize this mutated BRAF protein. In these studies, two independent cohorts of CRCs and a cohort of 922 colorectal polyps (545 patients) consecutively removed in Oulu University Hospital were utilized to study potential immunohistochemical markers (annexin A10 and VE1) as markers for the serrated pathway lesions, to investigate the presence of ectopic crypt foci (ECF) in different colorectal polyps and CRCs, and to study the network of determinants and the clinical impact of tumor necrosis with special regard to SAC. VE1 immunohistochemistry was found a sensitive and accurate method in the detection of BRAF V600E mutation with potential applications in the recognition of the BRAF V600E-mutated SACs. Annexin A10 immunohistochemistry was indicated to be a marker with high specificity for the serrated pathway lesions. ECF were found to be frequently encountered in addition to traditional serrated adenomas also in the tubular, tubulovillous and villous adenomas. Tumor necrosis in CRC was associated with high tumor stage and inversely associated with the serrated histology. High tumor necrosis percentage correlated with poor survival in CRC independently of other clinicopathological factors. In conclusion, these studies add to the knowledge of the molecular and histological features of SAC and its precursors. The results suggest that VE1 and ANXA10 immunohistochemistry may help in the recognition of the serrated pathway lesions. ECF can be found in other colorectal polyps in addition to traditional serrated adenomas. Tumor necrosis represents a relevant histomorphological prognostic indicator in CRC. / Tiivistelmä Paksu-peräsuolisyöpä on yksi yleisimmistä syövistä länsimaissa. Arviolta kolmasosaa kaikista paksu-peräsuolisyövistä edustava sahalaitainen adenokarsinooma eroaa tavallisesta adenokarsinoomasta molekulaaristen muutostensa sekä histologisten ja kliinispatologisten piirteidensä perusteella. BRAF-onkogeenin V600E-mutaatiota tavataan vain paksu-peräsuolisyövän sahalaitaisen kehittymisreitin muutoksissa ja VE1-immunohistokemian on todettu tunnistavan tämän mutatoituneen BRAF-proteiinin. Tutkimuksessa käytettiin kahta itsenäistä paksu-peräsuolisyöpäaineistoa sekä polyyppiaineistoa, joka käsitti 922 Oulun yliopistollisessa sairaalassa peräkkäisissä kolonoskopioissa poistettua paksu-peräsuolen polyyppia (545 potilasta). Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kahden immunohistokemiallisen merkkiaineen (VE1 ja annexin A10) spesifisyyttä sahalaitaiselle adenokarsinoomalle ja sen esiastemuutoksille, ektooppisten kryptafokusten esiintymistä paksu-peräsuolen polyypeissa sekä kasvaimen nekroosiin yhteydessä olevia tekijöitä ja nekroosin ennustevaikutusta. VE1-immunohistokemia oli sekä sensitiivinen että spesifinen BRAF V600E-mutaation toteamisessa, minkä vuoksi sitä voidaan käyttää BRAF V600E-mutatoituneiden sahalaitaisten adenokarsinoomien tunnistamisessa. Annexin A10-immunohistokemia osoittautui spesifiseksi sahalaitaisen kehittymisreitin muutosten toteamissa. Ektooppisia kryptafokuksia havaittiin traditionaalisen sahalaita-adenooman lisäksi myös tubulaarisissa, tubulovillooseissa ja villooseissa adenoomissa. Kasvaimen nekroosi oli vähäisempää sahalaitaisessa adenokarsinoomassa sekä matalan levinneisyysasteen kasvaimissa. Runsas nekroosin määrä oli kasvaimen levinneisyydestä riippumatta yhteydessä huonompaan ennusteeseen. Tutkimus lisää tietoa sahalaitaisesta adenokarsinoomasta ja sen esiastemuutoksista. Tulokset osoittavat, että VE1 ja annexin A10 -immuno¬histokemia auttaa sahalaitaisen kehittymisreitin muutosten tunnistamisessa; ektooppisia kryptafokuksia voidaan nähdä traditionaalisten sahalaita-adenoomien lisäksi myös muissa paksu-peräsuolen polyypeissa; lisäksi todettiin, että kasvaimen nekroosin määrällä on vaikutusta paksu-peräsuolisyövän ennusteen arvioinnissa.

Abstract Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer-associated death in women in Finland. Although ovarian cancer is relatively common, the precise mechanism of its development is still unknown. Additionally, it appears that the modes of pathogenesis differ depending on histotype. Although the initial response to platinum-based chemotherapy is usually good, the majority of ovarian cancer patients relapse and develop platinum resistance. This is a major problem in the treatment of ovarian cancer. Reactive oxygen species (ROS) are metabolites of oxygen. They are continuously formed in normal cells as a by-product of aerobic respiration and they play an important role in normal cell functions. Oxidative stress occurs when ROS formation overrides the antioxidative defence system. Oxidative stress is associated with carcinogenesis. A small proportion of cancer cells are stem cells that survive initial chemotherapy. These cells are suspected of being associated with the development of platinum resistance. To evaluate the significance of oxidative stress in ovarian cancer we examined ROS-derived damage and antioxidant regulators in benign and borderline ovarian tumours and ovarian cancer samples by immunohistochemistry and analysis of serum samples. The existence of cancer stem cell markers was also assessed in ovarian cancer samples. The expression levels of various markers were compared with clinicopathological parameters. Our results confirm that oxidative stress (8-hydroxydeoxyguanosine) exists in benign tumours and antioxidant enzymes, such as peroxiredoxins and thioredoxin are widely expressed in benign and borderline tumours. Oxidative stress was associated with poor survival, higher stage and platinum resistance in ovarian cancer. Oxidative stress markers were more strongly expressed in certain histotypes of ovarian cancer, such as serous and endometrioid type. Cancer stem cell markers were found in ovarian cancer and they were associated with the development of platinum resistance. These observations are beneficial in understanding the pathobiology of ovarian cancer and help in the design of new treatment options. / Tiivistelmä Munasarjasyöpä on yksi merkittävistä syöpäkuolleisuuden aiheuttajista naisilla Suomessa. Se on kohtalaisen yleinen, mutta sen perimmäinen syntymismekanismi on vielä epäselvä. Lisäksi näyttää siltä, että eri histologioilla syntymekanismit poikkeavat toisistaan. Vaikka yleensä platinapohjaisella solunsalpaajahoidolla saadaan hyvä vaste, suurimmalla osalla hoidetuista potilaista tauti uusii ja kehittyy vastustuskyky platinapohjaisille solunsalpaajille. Tämä on suuri ongelma munasarjasyövän hoidossa. Vapaat radikaalit ovat hapen johdannaisia. Niitä muodostuu jatkuvasti soluissa soluhengityksen sivutuotteena, ja niillä on tärkeä merkitys normaaleissa solun toiminnoissa. Jos vapaiden radikaalien tuotanto ylittää antioksidatiivisen puolustusjärjestelmän, syntyy oksidatiivinen stressitilanne. Oksidatiivisen stressin on todettu olevan yhteydessä useiden syöpien syntymiseen. Osaa syövän soluista kutsutaan kantasoluiksi. Nämä solut voivat selvitä solunsalpaajahoidoista ja niiden epäillään olevan yhteydessä vastustuskyvyn kehittymisessä platinapohjaisia sytostaatteja kohtaan. Tutkimuksessamme arvioimme oksidatiivisen stressin merkitystä munasarjakasvaimissa. Tutkimme vapaiden radikaalien aiheuttamia vaurioita ja antioksidatiivisia säätelijöitä hyvänlaatuisissa, rajalaatuisissa sekä munasarjasyöpä kasvaimissa immunohistokemiallisesti ja seeruminäytteistä. Lisäksi selvitimme syövän kantasolumerkkiaineiden esiintymistä munasarjasyövässä. Tutkittujen merkkiaineiden pitoisuuksia verrattiin kliinisiin potilastietoihin. Tutkimustuloksemme mukaan oksidatiivista stressiä (8-hydroxydeoxyguanosine) esiintyi jo hyvänlaatuisissa kasvaimissa. Myös antioksidatiiviset entsyymit, kuten peroksiredoksiinit ja tioredoksiini, esiintyivät jo hyvänlaatuisissa ja rajalaatuisissa kasvaimissa. Oksidatiivinen stressi oli yhteydessä huonompaan tautiennusteeseen ja platinakohtaisen vastustuskyvyn kehittymiseen. Oksidatiivista stressiä oli enemmän seroosissa ja endometrioidissa munasarjasyöpätyypissä. Syövän kantasolumerkkiaineita esiintyi munasarjasyövässä, ja ne olivat yhteydessä huonontuneeseen hoitovasteeseen platinapohjaisille solunsalpaajille. Tulokset auttavat ymmärtämään munasarjasyövän syntymekanismeja ja suunnittelemaan uusia hoitovaihtoehtoja erityyppisissä munasarjasyövissä.

Abstract Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and follicular lymphoma (FL) are two of the most common lymphomas in the Western world. DLBCL is an aggressive disease with a good response to treatment; about 75% of patients achieve permanent remission after first-line treatment. In patients with relapses or primary refractory disease, prognosis is dismal; only 10–20% of them can be cured, even with aggressive treatments. FL is an indolent lymphoma with a very good response to treatment and slow progression. Median survival with modern treatments is over 15 years. Nevertheless, some patients have short remissions and succumb to disease. Oxidative stress, TP53 mutations, and translocations of MYC, Bcl-2 and Bcl-6 have been linked in many neoplasms to aetiology and poor prognosis. This thesis concerns oxidative stress and redox-state-regulating enzymes in DLBCL and FL, and TP53 mutations and translocations of MYC, Bcl-2 and Bcl-6 in DLBCL. High expression levels of the antioxidant enzyme thioredoxin and a marker of oxidative stress, nitrotyrosine, were related to poor prognosis in DLBCL. In FL, high-level expression of peroxiredoxin was associated with good prognosis. TP53 mutations in specific regions LSH and L3 and concurrent translocation of Bcl-2 were associated with poor prognosis in DLBCL. Not all TP53 mutations predicted survival. High expression levels of Bcl-2 and MYC were associated with poor prognosis in DLBCL. Based on the results presented here, antioxidant function may have protective roles, but also may cause resistance to treatment. TP53 mutations have prognostic roles in DLBCL, but should be further defined. Novel therapies could be developed in connection with these mechanisms. / Tiivistelmä Diffuusi suurisoluinen B-solulymfooma (DLBCL) ja follikulaarinen lymfooma (FL) ovat kaksi yleisintä lymfoomaa länsimaissa. DLBCL on aggressiivinen syöpä, joka reagoi hyvin hoitoihin, jopa 75 % paranee. Kuitenkin potilailla, joilla syöpä uusiutuu hoitojen jälkeen tai etenee hoidon aikana, on erittäin huono ennuste, noin 10-20 % näistä potilaista voidaan parantaa. FL on hyväennusteinen lymfooma, joka yleensä reagoi hyvin hoitoihin. Mediaani elossaoloaika kaikilla FL potilailla on yli 15 vuotta taudin toteamisesta. Osalla potilaista FL kuitenkin on aggressiivisempo. Oksidatiivinen stressin, TP53- mutaatioiden, MYC, Bcl-2 ja Bcl-6 -translokaatioiden on todettu olevan huonoon ennusteeseen yhteydessä olevia tekijöitä monissa syövissä, kuten lymfoomissa. Tämä väitöskirja tutki oksidatiivisen stressin ja hapetus-pelkistys reaktioon liittyvien entsyymien osuutta R-CHOP-hoidetuissa DLBCL:ssa ja FL:ssa immunohistokemian (IHC) avulla. DLBCL:ssa tutkittiin lisäksi TP53 mutaatioita, MYC, Bcl-2 ja Bcl-6 translokaatioiden roolia taudin kulussa. Korkea ekspressio oksidatiivisen stressin merkkiainetta nitrotyrosiinia ja antioksidantti thioredoksiinia olivat yhteydessä huonoon ennusteeseen DLBCL:ssa. FL:ssa runsas ilmentyminen antioksidativiisiin entsyymeihin kuuluvia peroksiredoksiineja olivat yhteydessä hyvään ennusteeseen. TP53 mutaatiot LSH ja L3 alueella ja Bcl-2 -translokaatiot yhdessä olivat yhteydessä huonoon ennusteeseen DLBCL:ssa. Kaikki TP53-mutaatiot eivät olleet assosioituneet huonoon ennusteeseen. DLBCL:ssa Bcl-2 ja MYC –proteiinien runsas ilmentyminen IHC:llä arvioituna liittyi huonoon ennusteeseen. Tulosten perusteella solujen hapetus-pelkistystilaa säätelevillä entsyymeillä voi olla dualistinen rooli, osittain suojeleva ja osittain vahingoittava lymfoomissa. TP53 -mutaatioilla voi olla ennusteellista merkitystä, mutta tämä vaatii lisää tutkimuksia.

Abstract Oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) is the most common cancer of the oral cavity. The 5-year mortality of OTSCC remains at about 50%. The tumor microenvironment (TME) is now recognized as an important factor in cancer progression and metastasis, as well as a tool for prognostication. The aim of this study was to elucidate the roles of TME hypoxia and soluble factors on cancer cell migration and invasion, and the prognostic value of two extracellular matrix (ECM) molecules: tenascin-C (TNC) and fibronectin (FN). Hypoxia was studied using oral squamous cell carcinoma cells in migration and invasion assays. Invasion assays were carried out using a 3D-myoma invasion method. Similarly, the effect of soluble factors as well as ECM alterations were studied using the myoma model: the effect of soluble factors was studied by rinsing the myoma discs prior to experiments, and ECM alterations by lyophilizing and rehydrating. ECM was further studied by analyzing the prognostic value of TNC and FN from OTSCC samples. The effect of hypoxia was shown to be OTSCC cell line dependent: the effect of hypoxia on migration and invasion was increased in aggressive cell lines. Additionally, the response to hypoxia was altered in rinsed tissue. Tissue rinsing media were analyzed and factors affecting cell motility were found. The TME was found to be pivotal for cancer invasion: invasion was impaired in non-neoplastic tissue. Furthermore, changes in the ECM by lyophilization and rehydration led to a change in the invasion mechanism. High expression of stromal TNC and FN were excellent prognosticators in early-stage OTSCC. In conclusion, the present study highlighted the role of various TME components in cancer cell invasion as well as prognostication in OTSCC. Additionally, this study provided feasible tools for more precise diagnosis of early-stage OTSCC. / Tiivistelmä Liikkuvan kielen levyepiteelikarsinooma (OTSCC) on suuontelon yleisin syöpä. Viiden vuoden kuolleisuus OTSCC:an on edelleen noin 50 %. Kasvaimen mikroympäristön (TME) tiedetään nykyään olevan tärkeässä roolissa syövän kehityksessä ja etäpesäkkeiden muodostuksessa, sekä tarjoavan työkaluja ennusteiden laadintaan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää TME:n hypoksian ja liukoisten tekijöiden vaikutusta syöpäsolujen liikkumiseen ja invaasioon ympäröivään kudokseen, sekä tutkia kahden solunulkoisen matriksin (ECM) proteiinin, tenaskiini-C:n (TNC) ja fibronektiinin (FN), vaikutusta OTSCC:n ennusteeseen. Hypoksian vaikutusta tutkittiin käyttäen suun levyepiteelikarsinoomasoluja liikkuvuus- ja invaasiokokeissa. Invaasiokokeissa hyödynnettiin kolmiulotteista ihmisen myoomaan perustuvaa invaasiomallia. Myös liukoisten tekijöiden ja ECM:n muutosten vaikutusten tutkimisessa käytettiin myoomamallia: liukoisten tekijöiden vaikutusta tutkittiin huuhtomalla myoomakiekot ennen niiden käyttämistä, ja ECM:n muutosten vaikutusta kylmäkuivaamalla ja uudelleen nesteyttämällä myoomakiekot. ECM:ia tutkittiin myös analysoimalla TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden merkitystä OTSCC:n ennusteessa. Hypoksian vaikutus osoittautui solulinjariippuvaiseksi: hypoksia lisäsi kielisyöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasiota eniten aggressiivisimmilla solulinjoilla. Lisäksi solujen vaste hypoksialle oli erilainen huuhdotussa kudoksessa. Huuhteluliuos analysoitiin ja siitä löydettiin solujen liikkumiseen vaikuttavia tekijöitä. TME:n havaittiin olevan ratkaisevassa roolissa syöpäsolujen invaasiossa: syöpäsolut eivät kyenneet invasoitumaan lainkaan ei-neoplastiseen kudokseen. Lisäksi muutosten ECM:ssä havaittiin johtavan muutoksiin solujen käyttämässä invaasion mekanismissa. Strooman TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden todettiin olevan erinomaisia ennustekijöitä aikaisen vaiheen OTSCC:ssa. Tiivistettynä voidaan todeta, että tämä tutkimus alleviivasi useiden TME:n komponenttien vaikutusta syövän invaasiolle ja ennusteelle OTSCC:ssä. Lisäksi se tarjoaa käyttökelpoiset työkalut (TNC ja FN) tarkemmalle diagnostiikalle aikaisen vaiheen OTSCC:ssä.

Abstract Lymphomas are a group of more than 70 different malignancies arising from lymphoid tissues and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common subtype of lymphoma. More than 70% of DLBCL patients can be cured with modern therapy, but some patients still die of the disease. The recognition of patients with adverse prognosis, justifying deviation from standard treatment and risking severe side effects, is problematic. The aim of this study was to identify potential biological factors for the prediction of poor treatment response and central nervous system (CNS) relapse in DLBCL patients. The study included 263 lymphoma patients. 205 patients had a DLBCL, and 37 of these represented primary CNS lymphoma (PCNSL). Immunohistochemistry was used to determine the expression of oxidative stress markers 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) and nitrotyrosine, as well as antioxidant enzymes manganese superoxide dismutase (MnSOD), thioredoxin (Trx) and gamma cysteine ligase (GCL) from samples representing reactive lymphoid tissue and B-cell derived lymphomas. From DLBCL samples staining was also conducted for cell cycle regulating proteins p16, p53, p21 and p27 and chemokine receptors CXCR4, CXCR5 and CCR7. Immunoelectron microscopy (IEM) for CXCR4 and CXCR5, and their ligands CXCL12 and CXCL13 was performed on additional samples from reactive lymphoid tissue, nodal DLBCL, secondary CNS lymphoma and PCNSL. Factors associated with adverse prognosis included expression of nitrotyrosine, Trx and GCL. A prognostic score reflecting the degree of cell cycle dysregulation within each patient’s tumour identified 3 distinct prognostic groups among DLBCL patients. High cytoplasmic CXCR5 expression was associated with CNS involvement, whereas nuclear CXCR4 expression correlated with nodal disease. These results demonstrate the considerable biological heterogeneity seen within DLBCL, but further research is needed to confirm them. High antioxidant activity and the accumulation of damage to cell cycle regulating pathways separated patient groups with a poor prognosis that might benefit from new types of treatment. Chemokine receptor expression seems to play a role in the CNS tropism of DLBCL, and, if confirmed, could in the future contribute to more effective targeting of CNS prophylactic therapies. / Tiivistelmä Lymfoomat ovat yli 70 erilaisen maligniteetin muodostama ryhmä imukudoksen syöpiä, ja diffuusi suurisoluinen B-solulymfooma (engl. DLBCL) on yleisin lymfoomatyyppi. Yli 70 prosenttia DLBCL-potilaista pystytään parantamaan nykyaikaisilla hoidoilla, mutta osa potilaista kuolee edelleen tautiin. Nämä potilaat tarvitsisivat tehokkaampia hoitoja vakavien haittavaikutusten riskistä huolimatta, mutta huonon ennusteen potilaiden tunnistaminen etukäteen on vaikeaa. Tutkimuksen tavoitteena oli löytää biologisia tekijöitä DLBCL-potilaiden hoitovasteen ja taudin keskushermostossa (engl. CNS) uusiutumisen ennustamiseen. Aineisto sisältää 263 lymfoomapotilasta. 205 potilaalla on DLBCL, ja 37:llä näistä primaari aivolymfooma (PCNSL). Immunohistokemiallisilla värjäyksillä määritettiin oksidatiivisen stressin markkereiden 8-hydroksideoksiguanosiinin (8-OHdG) ja nitrotyrosiinin, sekä antioksidanttientsyymien mangaanisuperoksidi-dismutaasin (MnSOD), tioredoksiinin (Trx) ja gammakysteiiniligaasin (GCL) ilmentyminen reaktiivista imukudosta sekä B-soluperäisiä lymfoomia edustavissa näytteissä. DLBCL-näytteistä määritettiin lisäksi solusykliä säätelevien proteiinien p16, p53, p21 ja p27 sekä kemokiinireseptorien CXCR4, CXCR5 ja CCR7 ilmentyminen. Lisäksi reaktiivista imukudosta, imusolmuke-DLBCL:aa, sekundaarista CNS-lymfoomaa ja PCNSL:aa edustavista näytteistä määritettiin immunoelektronimikroskooppisesti reseptorien CXCR4 ja CXCR5 sekä ligandien CXCL12 ja CXCL13 ilmentyminen. Tulosten mukaan voimakas nitrotyrosiini-, Trx- ja GCL-positiivisuus ovat yhteydessä huonoon ennusteeseen. Solusyklin säätelyhäiriön vaikeusastetta kuvaava ennusteellinen pisteytys jaotteli DLBCL-potilaat kolmeen ennusteelliseen ryhmään. Runsas sytoplasminen CXCR5-positiivisuus oli yhteydessä CNS-tautiin, kun taas tumapositiivisuus CXCR4:lle korreloi imusolmuketautiin. Tutkimustulokset kuvaavat DLBCL:n merkittävää biologista heterogeenisyyttä, mutta tulosten varmistamiseksi tarvitaan lisää tutkimuksia. Korkea antioksidanttiaktiivisuus ja solusyklin säätelyhäiriöiden kasautuminen erottivat huonoennusteisia potilasryhmiä, jotka voisivat hyötyä uudenlaisista hoidoista. Kemokiinireseptorien ilmentyminen vaikuttaisi olevan yhteydessä DLBCL:n CNS-hakuisuuteen, ja tulosten varmistuessa ekspressioprofiilien analysointia voitaisiin tulevaisuudessa hyödyntää ennaltaehkäisevien hoitojen tehokkaammassa kohdentamisessa.

Abstract Colorectal cancer is the third most common cancer in the developed countries. Originally, development of CRC was thought to proceed by a sequence of steps known as an adenoma-carcinoma sequence. At present CRC is recognized as a disease developing through diverse pathways. Serrated adenocarcinoma represents an endpoint of tumors developing from serrated pathway. This thesis focuses on studying the molecular alterations in serrated adenocarcinoma. Microsatellite instability, hypermethylation of promoter region in DNA repair genes hMLH1 and MGMT, frequency of KRAS and BRAF mutations and mutation spectrum of PTCH1 was determined in serrated adenocarcinomas (n=42) and compared to non-serrated adenocarcinomas (n=75). MSI, particularly low level of MSI (p=0.02) and methylation of both hMLH1 and MGMT promoters (p=0.004, p=0.026) were found to be more prevalent for serrated CRC. BRAF mutation was frequent and specific to serrated adenocarcinomas (p&lt;0.001) and KRAS mutations were more frequent in serrated adenocarcinomas than in non-serrated cancers (p=0.002). A significant association between BRAF mutation, hMLH1 and MGMT methylation and MSI-H phenotype was found in serrated carcinomas. KRAS mutation was seen in association with MSS/MSI-L phenotype; in fact, if serrated adenocarcinoma presents with MSI-L there always seems to be a KRAS mutation as well. Negative immunohistochemical staining of the hMLH1 enzyme was in association with methylation of the gene and proved reliable in the detection of MSI-H phenotype (p&lt;0.0001). Sequencing analysis of the whole coding regions of the PTCH1 gene did not reveal any truncating mutation to explain the previously detected downregulation of the gene in serrated CRCs. In conclusion, serrated adenocarcinomas proved to be an independent, but heterogeneous subtype of CRCs. High combined mutation rate (79–82%) of KRAS and <I>BRAF</I> in serrated adenomas and adenocarcinomas indicates that MAPK activation is a crucial part of the serrated pathway. BRAF mutations are specific for serrated adenocarcinoma, and identify a subset of serrated adenocarcinomas with gene methylation and a tendency for MSI-H. High frequency of KRAS mutations in serrated adenocarcinomas suggests that a significant proportion of KRAS-mutated CRCs originate from serrated precursors. / Tiivistelmä Paksu- ja peräsuolisyöpä eli kolorektaalisyöpä on Suomessa kolmanneksi yleisin syöpätyyppi. Syöpää edeltävien muutosten tunnistaminen on tärkeää, jotta sen ehkäisy ja seuranta olisi tehokasta. Tavallisia adenoomapolyyppeja on pidetty tärkeimpinä kolorektaalisyövän esiastemuutoksina. 2000-luvulla on havaittu, että nk. sahalaitapolyypit edustavat tärkeää osaa esiastemuutoksista, ja näistä kehittyvää syöpää kutsutaan sahalaitaiseksi syöväksi. Sahalaitaisen syövän kehittymismekanismit eroavat huomattavasti tavallisesta kolorektaalisyövästä. Tässä väitöskirjassa keskityttiin tutkimaan sahalaitaiselle syövälle tyypillisiä morfologisia piirteitä sekä geneettisiä muutoksia. Työssä selvitettiin DNA mikrosatelliitti-instabiliteetin sekä DNA korjausgeenien hMLH1 ja MGMT promoottorialueiden hypermetylaation esiintyminen, nk. MAPK –signaalinsiirtoreitin komponenttien, KRAS ja BRAF -geenien, mutaatioiden yleisyys sekä PTCH1 geenin mutaatiokirjo sahalaitaisissa (n=42) ja tavallisissa kolorektaalisyövissä (n=75). DNA:n mikrosatelliitti-instabiliteetti, erityisesti matala-asteisena (MSI-L) (p=0.02) sekä <I>MLH1</I> ja hMGMT -geenien metylaatio (p=0.004, p=0.026) olivat yleisempiä sahalaitaisissa syövissä. <I>BRAF</I> mutaatio oli yleinen sekä spesifinen sahalaitasyöville (p&lt;0.001). Myös KRAS -mutaatiot olivat yleisempiä sahalaitaisissa syövissä (p=0.002). BRAF mutaatio, hMLH1 sekä MGMT metylaatio ja korkea-asteinen mikrosatelliitti-instabiliteetti (MSI-H) esiintyivät hyvin usein yhdessä sahalaitaisissa syövissä. Sahalaitaisissa syövissä KRAS –mutaatiot liittyivät MSI-L fenotyyppiin. hMLH1 geenin ilmentyminen tutkittiin myös immunohistokemiallisesti. Sahalaitaisissa syövissä MLH1 –proteiinin häviäiminen oli yhteydessä metylaatioon ja liittyi spesifisesti MSI-H:n esiintymiseen (p &lt; 0.0001). PTCH1 geenin sekvensointi ei paljastanut proteiinin toimintaa vahingoittavia muutoksia, eikä tuloksen perusteella pystytä selittämään aikaisemmin havaittua geenin ilmentymisen häviämistä sahalaitaisessa syövässä. Tulosten perusteella sahalaitainen syöpä on oma, mutta heterogeeninen kolorektaalisyövän alatyyppi. KRAS ja BRAF –geenien aktivoivien mutaatioiden yleisyys (79–82%) osoittaa, että MAPK -reitin aktivaatio on tärkeää sahalaitaisen syövän kehityksessä. BRAF -mutaatiot ovat spesifisiä sahalaitaisille syöville, ja yhdessä metylaation sekä MSI-H:n kanssa identifioi osan sahalaitasyövistä omaksi ryhmäkseen. <I>KRAS</I> –mutaatioiden yleisyys sahalaitaisissa syövissä antaa aiheen epäillä, että merkittävä osa KRAS –mutaation sisältävistä kolorektaalisyövistä kehittyy sahalaitapolyypeista.

Abstract The function of the transmembrane protein FasL is to complex with the Fas receptor in a target cell and induce target cell apoptosis. Fas/FasL-mediated apoptosis plays important role in immunoregulation. FasL expression is mostly seen in activated lymphocytes. We have characterized endothelial FasL expression in different functional compartments of lymph nodes and gut-associated lymphoid tissue. Furthermore, we have explored the functional role of endothelial FasL expression by analyzing correlation with apoptosis of lymphocyte subpopulations in lymph nodes and by assessing endothelial expression under different conditions by activation of immune functions in gastrointestinal mucosa. Immunohistochemical stainings (Fas, FasL, CD3, CD20, CD19, CD23, CD56, FVIII) were performed on 20 reactive lymph node tissues (I and II), 60 pediatric endoscopy biopsy samples (III) or 60 samples from gut resections (IV). A double-staining method combining apoptosis detection with the TUNEL-method and lymphocyte classification with FasL, Fas and cell lineage markers was optimized. Patient groups included non-pathological lymph nodes, pediatric cow’s milk-sensitive enteropathy, pediatric celiac disease, appendicitis, ulcerative colitis and Crohn’s disease. Control groups included normal biopsy samples from pediatric patients and non-pathological resecate samples from the appendix, colon or ileum to correspond to patient groups. Quantitative analysis (positive vessels or cells per mm2) was performed thoroughly for each anatomical region. In a subset of patients, soluble FasL in the serum was quantified with standard enzyme-linked immunosorbent assay. In reactive lymph nodes FasL expression was predominantly present in high endothelial venules located in the paracortical area, where apoptotic T and B lymphocytes, some expressing Fas, were subsequently found. In the gut wall vascular FasL expression was seen in high endothelial vessels near lymphoid follicles. Serum FasL was elevated in children with an abundance of mucosal lymphoid follicles. In IBD, vascular FasL was upregulated in ulcers and in the submucosa of colons affected by Crohn’s disease. The results indicate that endothelial FasL is characteristically present in high endothelial venules of lymphoid tissues. Detection of apoptotic Fas expressing lymphocytes adjacent to such vessels supports the idea that endothelial FasL functions as a selective gatekeeper by inducing apoptosis of Fas+ lymphocytes entering from the blood stream. / Tiivistelmä Solukalvon läpäisevän proteiinin, FasL:n, tehtävä on sitoutua kohdesolun Fas-reseptoriin ja indusoida kohdesolun apoptoosi. Fas/FasL-välitteinen apoptoosi on merkittävä tekijä immunologisessa säätelyssä. FasL ilmentyy pääsääntöisesti aktivoituneissa lymfosyyteissä. Olemme kuvanneet tutkimuksessamme FasL:n endoteelistä ilmentymistä imukudoksen eri toiminnallisissa alueissa ja suoliston lymfaattisessa kudoksessa. Lisäksi kartoitimme endoteelin FasL:n toiminnallista merkitystä analysoimalla sen yhteyttä lymfosyyttien alaryhmien apoptoosiin imusolmukkeissa ja arvioimalla FasL:n endoteelistä ilmentymistä suoliston limakalvon immunologisesti erilaisissa sairauksissa. Teimme immunohistokemiallisia värjäyksiä (Fas, FasL, CD3, CD20, CD19, CD23, CD56 ja FVIII) 20 reaktiiviselle imusolmukkeelle (I ja II), 60 lapsen endoskooppiselle biopsianäytteelle (III) sekä 60 suoliresekaattinäytteelle (IV). Optimoimme kaksoisvärjäysmenetelmän, missä yhdistettiin apoptoosin havainnointimenetelmä TUNEL ja FasL-, Fas- tai solulinjamarkkeri. Potilasryhmiin kuului potilaita, joilla oli normaalit imusolmukkeet, sekä potilaita, jotka sairastivat lasten viivästynyttä lehmänmaitoallergiaa, lasten keliakiaa, umpilisäketulehdusta, haavaista paksusuolitulehdusta tai Crohnin tautia. Verrokkiryhmiin kuului normaaleja biopsianäytteitä lapsipotilailta sekä terveitä resekaattinäytteitä umpilisäkkeestä sekä paksu- tai sykkyräsuolesta potilasryhmien mukaisesti. Jokaiselle anatomiselle alueelle suoritimme perusteellisen määrällisen analyysin (positiivista suonta tai solua per mm2). Osalle ryhmistä suoritimme seerumin liukoisen FasL:n määrityksen entsyymivälitteisellä immunosorbenttimäärityksellä. Reaktiivisissa imusolmukkeissa FasL:n ilmentyminen näkyi pääsääntöisesti parakortikaalialueen korkeaendoteelisissä venuleissa, missä myös apoptoottiset T- ja B-lymfosyytit (joista osa ilmensi Fasia) sittemmin näkyivät. Suoliston seinämässä havaitsimme verisuoniperäistä FasL:n ilmentymistä korkeaendoteelisissä suonissa lymfaattisten itukeskusten lähettyvillä. Niillä lapsipotilailla, joilla havaitsimme limakalvon lymfaattisten itukeskuksien lisääntymistä, oli myös seerumin FasL-pitoisuus koholla. Tulehduksellisissa suolistosairauksissa verisuoniperäinen FasL oli lisääntynyt limakalvon haavaumissa sekä Crohnin tautia sairastavien potilaiden submukoosassa. Tulokset osoittavat verisuoniperäisen FasL:n tyypillisesti ilmentyvän imukudoksen korkeaendoteelisissa suonissa. Apoptoosin havaitseminen Fasia ilmentävissä lymfosyyteissä näiden suonien läheisyydessä tukee ajatusta siitä, kuinka verisuoniperäinen FasL toimii valikoivana portinvartijana ja aiheuttaa Fas-positiivisten lymfosyyttien apoptoosin estämällä niiden pääsyn verenkierrosta.

Abstract Endometrial carcinoma is the most common gynegologic malignancy in developed countries. Due to early symptoms, including abnormal uterine bleeding, endometrial cancer is often diagnosed at an early stage and in that case usually has a good prognosis and high cure rates. However, the nature of the disease is heterogeneous. During the last decades, the improvement in survival rates among endometrial cancer patients has not been significant, suggesting that the traditional clinicopathological factors may be inadequate to identify patients with high-risk disease. Furthermore, aggressive adjuvant treatments can be costly and very toxic. Therefore, better prognostic markers associated with biological aggressiveness of endometrial carcinoma are needed to identify the patients with high-risk disease, and to be able to select the treatment more individually. Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) and their tissue inhibitors (TIMP-1 and TIMP-2) have been found to play a role in tumor progression. In the present work, the expression and prognostic value of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 were assessed in endometrial carcinoma. The patient material consisted of a total of 266 women diagnosed with primary endometrial carcinoma. The tissue expression of immunoreactive proteins was examined in paraffin-embedded tumor sections by immunohistochemical staining using specific antibodies, and the pretreatment serum levels of the proteins were quantitatively measured by ELISA. Tissue MMP-2 expression associated with a worsened prognosis, whereas tissue TIMP-2 overexpression was an indicator of a favorable outcome. Furthermore, we observed a combination of strong MMP-2 and weak TIMP-2 tissue expression to identify a group of women at high risk of adverse outcome in endometrial carcinoma. Patients with negative MMP-2 immunostaining had the best prognosis, regardless of TIMP-2 staining result. In serum measurements, high preoperative TIMP-1 concentration was a prognostic indicator of unfavorable outcome. These results indicate that tissue MMP-2 and TIMP-2 as well as circulating TIMP-1 may be prognostic markers in endometrial carcinoma. Of these, tissue MMP-2 seems to be the most potent prognostic marker. Studies with larger patient materials are needed to further explore the value of these enzymes in clinical practice in endometrial cancer. / Tiivistelmä Kohdunrungon syöpä on yleisin gynekologinen maligniteetti kehittyneissä maissa. Varhaisten oireiden, kuten poikkeavan verisen vuodon, vuoksi kohdunrungon syöpä havaitaan usein varhaisessa vaiheessa, jolloin sen ennuste on hyvä. Taudin käyttäytyminen voi kuitenkin olla moninaista. Viime vuosikymmenten aikana kohdunrungon syöpään sairastuneiden ennuste ei ole merkittävästi parantunut. Vaikuttaisi siltä, että perinteiset ennustetekijät eivät ole riittävän tarkkoja ennustamaan syövän taudinkulkua. Lisäksi liitännäishoidot voivat olla kalliita, ja niihin voi liittyä vakavia haittavaikutuksia. Uusien biologisten ennustetekijöiden löytäminen olisi tärkeää, jotta aggressiivista syöpätyyppiä sairastavat potilaat pystyttäisiin tunnistamaan entistä paremmin, ja hoito kyettäisiin räätälöimään yksilöllisemmin taudinkuvaa vastaavasti. Gelatinaasien (MMP-2 ja MMP-9) sekä niiden kudosinhibiittoreiden (TIMP-1 ja TIMP-2) on havaittu osallistuvan syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin MMP-2:n ja MMP-9:n sekä niiden kudosinhibiittoreiden TIMP-1:n ja TIMP-2:n ilmentymistä ja ennusteellista merkitystä kohdunrungon syövässä. Aineisto käsitti yhteensä 266 primaariseen kohdunrungon syöpään sairastunutta naista. Määritysmenetelminä käytettiin sekä immunohistokemiallista värjäystä parafiiniin valettujen kudosnäytteiden osalta että ELISA-määrityksiä ennen hoitoa otettujen seeruminäytteiden osalta. Syöpäkudoksen runsas MMP-2 -proteiinin ilmentyminen liittyi epäsuotuisaan ennusteeseen, kun taas kasvainkudoksen voimakas TIMP-2 -proteiinin ilmentyminen oli hyvän ennusteen merkki. Lisäksi kasvainkudoksen voimakkaan MMP-2- ja heikon TIMP-2 -proteiinien ilmentymisen yhdistelmän havaittiin liittyvän suurempaan syövästä johtuvaan kuolleisuuteen. MMP-2 -negatiivisten potilaiden eloonjäämisennuste oli paras, TIMP-2 -värjäystuloksesta riippumatta. Seerumin korkea TIMP-1 -pitoisuus oli merkittävä huonontuneen ennusteen merkki. Tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että kasvainkudoksessa esiintyvät MMP-2- ja TIMP-2 -proteiinit samoin kuin seerumin TIMP-1 -pitoisuus voivat ennustaa kohdunrungon syövän kliinistä käyttäytymistä. Kasvainkudoksessa esiintyvä MMP-2 -proteiini vaikuttaisi olevan merkittävin ennusteellinen tekijä, mutta tulosten varmistamiseksi tarvitaan lisää tutkimuksia suuremmilla potilasaineistoilla.

Abstract Oral lichen planus (OLP) is a chronic immune-mediated mucosal disease with unknown etiology. According to the current view, the pathogenesis of OLP involves activation of T-cell mediated immunity against the epithelial keratinocytes. A proportion of OLP patients are affected by painful symptoms, and the risk of oral cancer is increased in OLP. There is no curative treatment for OLP. Topical corticosteroids are used most commonly in the management of OLP. However, the evidence base for the effectiveness of any therapy is weak. The objective of this thesis was to study novel aspects of OLP etiopathogenesis and management. An epidemiologic, retrospective case-control study was conducted to determine whether systemic diseases, in particular thyroid diseases, are associated with OLP. In addition, a randomized controlled trial comparing the effectiveness of topical tacrolimus, triamcinolone acetonide and placebo in symptomatic OLP was carried out. Furthermore, immunohistochemical expression of toll-like receptors 4 and 9, hyaluronan and its principal receptor CD44 antigen, hyaluronan synthases 1-3, hyaluronidases 1-2 and cathepsin K was studied in OLP tissue samples and in healthy oral mucosa. The effect of topical tacrolimus on the expression of these molecules in OLP was also studied. The results of the present study showed that a history of hypothyroidism was associated with an approximately twofold risk of having OLP. Furthermore, both tacrolimus and triamcinolone acetonide were more efficient than placebo in reducing the signs and symptoms of OLP. No statistically significant differences were noted in the efficacy between tacrolimus and triamcinolone acetonide. In addition, the expression of the studied molecules was altered in the epithelium or stroma in OLP compared to healthy oral mucosa. Tacrolimus treatment decreased the expression of CD44 antigen in the stroma and the expression of cathepsin K in the epithelium in OLP. In conclusion, the present study extends our knowledge about systemic associated factors and management of OLP. In addition, the results improve our understanding of molecular level changes that occur in OLP. / Tiivistelmä Suun punajäkälä on krooninen immuunivälitteinen limakalvotauti, jonka etiologia on tuntematon. Taudin syntymekanismiin liittyy tämän hetkisen näkemyksen mukaan T-soluvälitteisen immuniteetin aktivoituminen epiteelin keratinosyyttejä vastaan. Suun punajäkälä aiheuttaa osalle potilaista kivuliaita oireita ja lisää suusyövän riskiä. Parantavaa hoitoa tautiin ei ole. Yleisimmin suun punajäkälän oireiden hoidossa käytetään paikallisia kortikosteroidivalmisteita. Kuitenkin eri hoitomuotojen tehosta on vain heikkoa näyttöä. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia uusia näkökohtia liittyen suun punajäkälän etiopatogeneesiin ja hoitoon. Epidemiologisessa tapaus-verrokkitutkimuksessa selvitettiin, liittyvätkö yleissairaudet, erityisesti kilpirauhassairaudet, suun punajäkälään. Lisäksi satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksessa verrattiin paikallisen takrolimuusin, triamsinoloniasetonidin ja lumelääkkeen tehoa oireisesta suun punajäkälästä kärsivillä potilailla. Tutkimuksessa selvitettiin myös tollin kaltaisten reseptorien 4 ja 9, hyaluronaanin ja sen pääasiallisen reseptorin CD44-antigeenin, hyaluronaanisyntaasien 1–3, hyaluronidaasien 1–2 sekä katepsiini K:n immunohistokemiallista ilmentymistä suun punajäkälänäytteissä ja terveessä suun limakalvossa. Lisäksi tutkittiin takrolimuusihoidon vaikutusta näiden molekyylien ilmentymiseen suun punajäkälässä. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että kilpirauhasen vajaatoimintaan liittyi noin kaksinkertainen riski sairastaa suun punajäkälää. Lisäksi havaittiin, että suun punajäkälässä sekä takrolimuusi että triamsinoloniasetonidi ovat tehokkaampia kuin lumelääke oireiden ja kliinisen taudinkuvan lievittämisessä. Takrolimuusin ja triamsinoloniasetonidin tehossa ei todettu tilastollisesti merkitseviä eroja. Lisäksi suun punajäkälänäytteissä tutkittujen molekyylien ilmentyminen oli muuttunut joko epiteelissä tai stroomassa verrattuna terveeseen limakalvoon. Takrolimuusihoito vähensi CD44-antigeenin ilmentymistä stroomassa ja katepsiini K:n ilmentymistä epiteelissä suun punajäkälässä. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus lisää tietoa suun punajäkälään liittyvistä systeemisistä tekijöistä ja suun punajäkälän hoidosta. Lisäksi löydökset lisäävät ymmärtämystä suun punajäkälässä tapahtuvista molekyylitason muutoksista.