Abstract Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and follicular lymphoma (FL) are two of the most common lymphomas in the Western world. DLBCL is an aggressive disease with a good response to treatment; about 75% of patients achieve permanent remission after first-line treatment. In patients with relapses or primary refractory disease, prognosis is dismal; only 10–20% of them can be cured, even with aggressive treatments. FL is an indolent lymphoma with a very good response to treatment and slow progression. Median survival with modern treatments is over 15 years. Nevertheless, some patients have short remissions and succumb to disease. Oxidative stress, TP53 mutations, and translocations of MYC, Bcl-2 and Bcl-6 have been linked in many neoplasms to aetiology and poor prognosis. This thesis concerns oxidative stress and redox-state-regulating enzymes in DLBCL and FL, and TP53 mutations and translocations of MYC, Bcl-2 and Bcl-6 in DLBCL. High expression levels of the antioxidant enzyme thioredoxin and a marker of oxidative stress, nitrotyrosine, were related to poor prognosis in DLBCL. In FL, high-level expression of peroxiredoxin was associated with good prognosis. TP53 mutations in specific regions LSH and L3 and concurrent translocation of Bcl-2 were associated with poor prognosis in DLBCL. Not all TP53 mutations predicted survival. High expression levels of Bcl-2 and MYC were associated with poor prognosis in DLBCL. Based on the results presented here, antioxidant function may have protective roles, but also may cause resistance to treatment. TP53 mutations have prognostic roles in DLBCL, but should be further defined. Novel therapies could be developed in connection with these mechanisms. / Tiivistelmä Diffuusi suurisoluinen B-solulymfooma (DLBCL) ja follikulaarinen lymfooma (FL) ovat kaksi yleisintä lymfoomaa länsimaissa. DLBCL on aggressiivinen syöpä, joka reagoi hyvin hoitoihin, jopa 75 % paranee. Kuitenkin potilailla, joilla syöpä uusiutuu hoitojen jälkeen tai etenee hoidon aikana, on erittäin huono ennuste, noin 10-20 % näistä potilaista voidaan parantaa. FL on hyväennusteinen lymfooma, joka yleensä reagoi hyvin hoitoihin. Mediaani elossaoloaika kaikilla FL potilailla on yli 15 vuotta taudin toteamisesta. Osalla potilaista FL kuitenkin on aggressiivisempo. Oksidatiivinen stressin, TP53- mutaatioiden, MYC, Bcl-2 ja Bcl-6 -translokaatioiden on todettu olevan huonoon ennusteeseen yhteydessä olevia tekijöitä monissa syövissä, kuten lymfoomissa. Tämä väitöskirja tutki oksidatiivisen stressin ja hapetus-pelkistys reaktioon liittyvien entsyymien osuutta R-CHOP-hoidetuissa DLBCL:ssa ja FL:ssa immunohistokemian (IHC) avulla. DLBCL:ssa tutkittiin lisäksi TP53 mutaatioita, MYC, Bcl-2 ja Bcl-6 translokaatioiden roolia taudin kulussa. Korkea ekspressio oksidatiivisen stressin merkkiainetta nitrotyrosiinia ja antioksidantti thioredoksiinia olivat yhteydessä huonoon ennusteeseen DLBCL:ssa. FL:ssa runsas ilmentyminen antioksidativiisiin entsyymeihin kuuluvia peroksiredoksiineja olivat yhteydessä hyvään ennusteeseen. TP53 mutaatiot LSH ja L3 alueella ja Bcl-2 -translokaatiot yhdessä olivat yhteydessä huonoon ennusteeseen DLBCL:ssa. Kaikki TP53-mutaatiot eivät olleet assosioituneet huonoon ennusteeseen. DLBCL:ssa Bcl-2 ja MYC –proteiinien runsas ilmentyminen IHC:llä arvioituna liittyi huonoon ennusteeseen. Tulosten perusteella solujen hapetus-pelkistystilaa säätelevillä entsyymeillä voi olla dualistinen rooli, osittain suojeleva ja osittain vahingoittava lymfoomissa. TP53 -mutaatioilla voi olla ennusteellista merkitystä, mutta tämä vaatii lisää tutkimuksia.

Abstract Hodgkin lymphoma (HL) is among a heterogeneous group of lymphomas. Over 80% of all patients can be cured with chemo- and radiotherapy. HL has become a model to study long-term effects of radio- and chemotherapy, because of the excellent prognosis. There are a significant number of patients who suffer or die because of the treatment-related long-term toxicity. The aim of this work was to discover new possible biological factors to predict poor prognosis and offer new aspects to individualize patient treatment in a convenient manner in HL. The retrospective study involved HL patients uniformly treated in 1997–2015. Immunohistochemistry was used to determine the expression of various biological markers, including oxidative stress markers 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) and nitrotyrosine and the antioxidant enzymes manganese superoxide dismutase (MnSOD) as well as peroxiredoxins (Prx II, Prx III, Prx V, Prx VI) in HL patient samples. Using immunohistochemistry, we also evaluated expression of hypoxia-inducible factors (HIF-1α, HIF-2α), prolyl hydroxylase domain enzymes (PHD1, PHD2, PHD3), the epigenetic regulator lysine (K)-specific demethylase 4 (KDM4A, KDM4B, KDM4D) as well as sirtuins (SIRT1, SIRT4, SIRT6), the DNA-repair proteins Human Rap1 interacting factor 1 (Rif1) and O6-alkylguanine DNA alkyltransferase (MGMT) from representative classical Hodgkin lymphoma (cHL) patient samples. Low-level expression of 8-OHdG was associated with poorer relapse-free survival (RFS) in advanced-stage HL and a high extent of MnSOD predicted early relapse in the whole HL cohort. Strong expression of PHD1, KDM4B and KDM4D predicted dismal RFS in radiotherapy-treated cHL patients. The results also showed that strong expression of HIF-1α, SIRT6 and Rif1, and SIRT6 together with Rif1, were associated with prolonged RFS, especially in advanced-stage radiotherapy-treated cHL patients. In multivariate analysis, PHD1, MnSOD, 8-OHdG and Rif1 separately and together with SIRT6 were statistically significant predictors of RFS. The results reflect the significance of the studied biomarkers in HL, especially in radiotherapy-treated patients. This might be beneficial when individualizing treatment strategies, avoiding overtreatment and controlling long-term treatment-related toxicity. Further research, however, is needed to confirm these preliminary findings. / Tiivistelmä Hodgkinin lymfooma (engl. HL) kuuluu heterogeeniseen imukudossyöpien eli lymfoomen ryhmään. Yli 80 % lymfoomapotilaista voidaan parantaa solunsalpaaja- ja sädehoidon avulla. Hyvän ennusteen takia HL- tutkimuksen tärkeä painopiste on säde- ja solunsalpaajahoidon pitkän ajan haittavaikutukset. Huomattava määrä potilaista kärsii tai jopa kuolee hoitoon liittyvistä pitkäaikaishaitoista johtuen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli löytää uusia mahdollisia biologisia tekijöitä, jotka ennakoisivat taudin huonoa ennustetta ja samalla antaa uusia näkökulmia HL potilaiden hoidon yksilöllistämiseen. Tämä retrospektiivinen tutkimus käsitti vuosina 1997-2015 samanlaisesti hoidettuja Hodgkinin lymfooma -potilaita. Immunohistokemiallisilla värjäyksillä määritettiin biologisten merkkiaineiden, mukaan lukien oksidatiivisen stressin markkereiden 8- hydroksideoksiguanosiinin (8-OHdG) ja nitrotyrosiinin, sekä antioksidanttientsyymien mangaanisuperoksidi-dismutaasin (MnSOD) sekä peroksiredoksiinien (Prx II, Prx III, Prx V, Prx VI) ilmentymistä HL -potilasnäytteissä. Määrittelimme myös immunohistokemiallisilla värjäyksillä epigeneettisten säätelijöiden lysiinin spesifisen demetylaasientsyymin 4 (KDM4A, KDM4B, KDM4D) sekä sirtuiinien (SIRT1, SIRT4, SIRT6), hypoksiaa indusoivien tekijöiden (HIF-1α, HIF-2α), prolyylihydroksylaasientsyymien (PHD1, PHD2, PHD3) ja DNA:ta korjaavien proteiinien Rap1 vaikuttuvan tekijä 1 (Rif1) ja O6-metyyliguaniini-DNA metyylitransferaasin (MGMT) ilmentymistä edustavissa klassista Hodgkinin lymfoomaa sairastavien potilaiden (engl. cHL) näytteissä. Heikko 8-OHdG värjäytyminen ennusti ennenaikaista taudin uusiutumaa levinneessä HL:ssa ja korkea MnSOD ilmaantuvuus ennusti ennenaikaista taudin uusiutumaa koko HL -ryhmässä. Sädehoidetuilla cHL potilailla voimakas PHD1, KDM4B ja KDM4D värjäytyminen ennusti ennenaikaista taudin uusiutumaa. Tulokset osoittivat myös, että erityisesti sädehoidetuilla levinneen taudin cHL potilailla voimakas HIF-1α, SIRT6, Rif1 ja SIRT6 yhdessä Rif1:n kanssa oli yhteydessä pidentyneeseen uusiutumavapaaseen aikaan. Monimuuttuja-analyysissä PHD1, MnSOD, 8-OHdG ja Rif1 itsenäisenä ja yhdessä SIRT6 kanssa ennustivat tilastollisesti merkitsevästi taudin ennenaikaista uusiutumaa. Tulokset osoittavat näiden eri biomarkkereiden merkittävyyden HL:ssä, erityisesti sädehoitoa saaneilla potilailla. Tuloksista voi olla hyötyä, kun hoitokäytäntöjä yksilöidään, mikä voisi helpottaa välttämään liiallista hoitoa ja hallitsemaan pitkäaikaisiin hoitoihin liittyviä haittoja. Näiden alustavien havaintojen vahvistamiseksi tarvitaan kuitenkin lisätutkimuksia.

Abstract In the present study, some of the difficulties in the treatment of the most common malignant lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), were evaluated. Some patients develop local or central nervous system (CNS) relapse after first-line treatment. The treatment of relapsed disease is challenging and despite all efforts, some patients die of the disease. Chemoresistant disease also remains challenging because some patients suffer from refractory disease of a progressive nature. The antioxidant enzymes peroxiredoxins (Prxs) and thioredoxin-1 (Trx) were evaluated as prognostic and predictive markers of DLBCL. High cytoplasmic expression of Prx VI was found to correlate with poor prognosis in patients with DLBCL. Trx knockdown in lymphoma cell culture revealed a possible predictive role of Trx. Trx knockdown sensitized cells to doxorubicin, a widely used chemotherapeutic agent in treatment schemas of DLBCL. Etoposide, another widely used chemotherapeutic agent, on the other hand, killed more native DLBCL cells than did doxorubicin. Patients with high Trx expression at the diagnostic stage of the disease benefitted from etoposide-containing high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation and did not develop post-transplantation relapses which Trx-negative patients did. Antithrombin III (AT III) in cerebrospinal fluid has been suggested to be a biomarker in previous studies of CNS lymphoma. In the present study, AT III was evaluated in patients with CNS lymphoma and with neurological diseases. High concentrations of AT III in cerebrospinal fluid reflected the magnitude of blood-brain barrier leakage and because of this, AT III should not be used as a biomarker in clinical practice. / Tiivistelmä Tutkimuksessa arvioitiin osaa yleisimmän pahanlaatuisen imukudossyövän eli lymfooman, diffuusin suurisoluisen B-solulymfooman, hoidon haasteista. Osa potilaista saa ensilinjan hoidon jälkeen joko paikallisen tai aivoston alueen taudin uusiutuman. Uusiutuneen taudin hoito on haasteellista, ja hoitoyrityksistä huolimatta osa potilaista kuolee tautiinsa. Solunsalpaajille resistentti tauti on myös yksi haastavista hoitotilanteista, ja osa potilaista kärsiikin hoitojen läpi etenevästä taudista. Antioksidatiivisia entsyymejä, kuten peroksiredoksiineja ja tioredoksiinia, arvioitiin ennusteellisina ja ennakoivina merkkiaineina diffuusissa suurisoluisessa B-solulymfoomassa. Peroksiredoksiini VI:n korkea sytosolinen ilmaantuvuus korreloi tavallista huonompaan diffuusin suurisoluisen B-solulymfooman ennusteeseen. Tioredoksiinin hiljentäminen lymfoomasoluviljelyssä paljasti sen mahdollisen ennakoivan merkityksen hoitoon liittyvässä päätöksenteossa. Solut herkistyivät tiodredoksiinin hiljentämisen vuoksi doksorubisiinille, jota käytetään laajalti diffuusin suurisoluisen B-solulymfooman solunsalpaajahoidoissa. Etoposidi, joka on huomattavasti myrkyllisempi solunsalpaaja, päinvastoin tappoi enemmän tavallisia diffuusia suurisoluisia B-solulymfoomaa edustavia soluja kuin doksorubisiini. Potilaat, joilla oli korkea tioredoksiinin määrä taudin diagnostisessa vaiheessa, hyötyivät etoposidia sisältävästä korkea-annoshoidosta sekä autologisesta kantasolusiirrosta. Näille potilaille ei kehittynyt kantasolusiirron jälkeisiä taudin uusiutumia kuin taas niitä kehittyi potilaille, joilla oli tioredoksiini negatiivinen. Antitrombiini III:a on ehdotettu soveltuvaksi aikaisempien tutkimusten perusteella aivoston lymfooman merkkiaineeksi aivo-selkäydinnesteestä. Tässä tutkimuksessa antitrombiini III:n määrää mitattiin potilailta, joilla oli aivoston lymfooma tai neurologinen sairaus. Korkeat konsentraatiot antitrombiini III:a aivo-selkäydinnesteessä kuitenkin vain heijastivat veri-aivoesteen vuotamisen määrää, ja näin ollen antitrombiini III:a ei tulisi käyttää kliinisessä käytössä.