Abstract Erythropoiesis is the process of red blood cell production. The main regulator is the erythropoietin (EPO) hormone, which is strongly upregulated in low oxygen concentration (hypoxia) in cells via the hypoxia-inducible transcription factor HIF. The stability of HIF is regulated in an oxygen-dependent manner by three HIF prolyl 4-hydroxylases, all of which are known to participate in the regulation of erythropoiesis. A role in erythropoiesis of a fourth prolyl 4-hydroxylase, P4H-TM, which possesses a transmembrane domain, is not known, but it is able to hydroxylate HIF at least in vitro and in cellulo. The role of P4H-TM in erythropoiesis was studied by administering a HIF-P4H inhibitor, FG-4497, to P4h-tm null, Hif-p4h-3 null, and Hif-p4h-2 hypomorph mouse lines. The current study suggests that P4H-TM is involved in the regulation of EPO production, hepcidin expression and erythropoiesis. P4H-TM can thus be a new target for inhibition when designing novel pharmacological treatment strategies for anemia. LOX is required for crosslink formation between lysine residues in fibrillar collagens and elastin. These crosslinks enhance the tensile strength of collagen fibers and provide elasticity to elastic fibers and thus generate important structural support for tissues. LOX is required for normal embryonic development of the cardiovascular and pulmonary systems, and its depletion leads to a generalized elastinopathy and collagenolysis leading to perinatal death of Lox null mice. The development of muscles is a delicate process, which requires coordinated signaling and a homeostatic balance between the muscle and muscle connective tissue. Based on the drastic defects that were found in the present study in the skeletal muscle of Lox null mice, lack of LOX clearly disturbs this balance and increases transforming growth factor β (TGF-β) signaling, which leads to defects in the skeletal muscles. The impaired balance can cause muscle disorders, such as Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). Despite the clinical significance, very little is known about the mechanisms controlling this homeostatic balance. The discovery of LOX as a regulating factor during skeletal muscle development will help to clarify the role of extracellular matrix (ECM) in muscle development and in muscle related congenital diseases. / Tiivistelmä Erytropoieesi on fysiologinen prosessi, jossa tuotetaan veren punasoluja ja jonka pääsäätelijänä toimii erytropoietiini (EPO) hormoni. EPO:n geeni ilmentyy voimakkaasti alhaisessa happipitoisuudessa (hypoksia) hypoksia-indusoituvan transkriptiotekijän (HIF) toimesta. HIF-tekijän stabiilisuutta säätelee kolme HIF-prolyyli-4-hydroksylaasientsyymiä (HIF-P4H) hapesta riippuvaisesti, ja niiden tiedetään siten osallistuvan myös erytropoieesin säätelyyn, HIF-P4H-2:n toimiessa pääsäätelijänä. Neljännen transmembraanisen prolyyli-4-hydroksylaasin (P4H-TM) roolia erytropoieesissa ei vielä tiedetä, mutta sen tiedetään säätelevän HIF-tekijää. Työssä käytettiin Hif-p4h-2, Hif-p4h-3 ja P4h-tm muuntogeenisiä hiirilinjoja, joiden entsymaattinen aktiivisuus on alentunut tai poistettu. P4H-TM:n osallisuutta erytropoieesin säätelyyn tutkittiin antamalla hiirilinjoille HIF-P4H-entsyymejä inhiboivaa lääkettä. Tutkimuksen tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa P4H-TM:n säätelevän EPO-geenin ilmentymistä ja siten erytropoieesia. Ennestään tiedettyjen HIF-P4H entsyymien inhiboinnin lisäksi P4H-TM:n inhibointia voidaan pitää uutena kohteena uusien farmakologisten hoitokeinojen kehityksessä. Lysyylioksidaasi (LOX) katalysoi säikeisten kollageenien välisten sekä elastisten säikeiden välisten poikkisidosten muodostumista. Pokkisidokset antavat vetolujuutta kollageeneille ja joustavuutta elastisille säikeille ja ovat siten tärkeitä kudoksen rakenteelle. LOX:ia tarvitaan sikiön kehityksen aikana mm. hengitys-, sydän- ja verisuonielimistöjen kehityksessä. LOX:in puutos hiirillä aiheuttaa viallisia elastisia- ja kollageenisäikeitä, johtaen poikasten kuolemaan synnytyksen yhteydessä. Lihasten kehitys on tarkoin säädelty prosessi, jossa lihas ja lihaksen sidekudos säätelevät toisiansa. LOX:n suhteen poistogeenisissä Lox-/- sikiöissä löydettiin selviä ongelmia luurankolihasten kehityksessä. LOX:n puutoksen osoitettiin lisäävän transformoivan kasvutekijä beetan (TGF-β) määrää, joka estää luustolihaksia kehittymästä normaalisti. LOX kykenee sitoutumaan TGF-β:aan ja inhiboimaan sen aktiivisuutta ja LOX:n puuttuessa inhibointia ei tapahdu. Tutkimus osoittaa LOX:n olevan keskeinen tekijä lihaksen kehityksessä ja siten auttaa ymmärtämään sidekudoksen merkitystä luurankolihasten kehityksessä ja siihen liittyvissä sairauksissa.

Abstract Hodgkin lymphoma (HL) is among a heterogeneous group of lymphomas. Over 80% of all patients can be cured with chemo- and radiotherapy. HL has become a model to study long-term effects of radio- and chemotherapy, because of the excellent prognosis. There are a significant number of patients who suffer or die because of the treatment-related long-term toxicity. The aim of this work was to discover new possible biological factors to predict poor prognosis and offer new aspects to individualize patient treatment in a convenient manner in HL. The retrospective study involved HL patients uniformly treated in 1997–2015. Immunohistochemistry was used to determine the expression of various biological markers, including oxidative stress markers 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) and nitrotyrosine and the antioxidant enzymes manganese superoxide dismutase (MnSOD) as well as peroxiredoxins (Prx II, Prx III, Prx V, Prx VI) in HL patient samples. Using immunohistochemistry, we also evaluated expression of hypoxia-inducible factors (HIF-1α, HIF-2α), prolyl hydroxylase domain enzymes (PHD1, PHD2, PHD3), the epigenetic regulator lysine (K)-specific demethylase 4 (KDM4A, KDM4B, KDM4D) as well as sirtuins (SIRT1, SIRT4, SIRT6), the DNA-repair proteins Human Rap1 interacting factor 1 (Rif1) and O6-alkylguanine DNA alkyltransferase (MGMT) from representative classical Hodgkin lymphoma (cHL) patient samples. Low-level expression of 8-OHdG was associated with poorer relapse-free survival (RFS) in advanced-stage HL and a high extent of MnSOD predicted early relapse in the whole HL cohort. Strong expression of PHD1, KDM4B and KDM4D predicted dismal RFS in radiotherapy-treated cHL patients. The results also showed that strong expression of HIF-1α, SIRT6 and Rif1, and SIRT6 together with Rif1, were associated with prolonged RFS, especially in advanced-stage radiotherapy-treated cHL patients. In multivariate analysis, PHD1, MnSOD, 8-OHdG and Rif1 separately and together with SIRT6 were statistically significant predictors of RFS. The results reflect the significance of the studied biomarkers in HL, especially in radiotherapy-treated patients. This might be beneficial when individualizing treatment strategies, avoiding overtreatment and controlling long-term treatment-related toxicity. Further research, however, is needed to confirm these preliminary findings. / Tiivistelmä Hodgkinin lymfooma (engl. HL) kuuluu heterogeeniseen imukudossyöpien eli lymfoomen ryhmään. Yli 80 % lymfoomapotilaista voidaan parantaa solunsalpaaja- ja sädehoidon avulla. Hyvän ennusteen takia HL- tutkimuksen tärkeä painopiste on säde- ja solunsalpaajahoidon pitkän ajan haittavaikutukset. Huomattava määrä potilaista kärsii tai jopa kuolee hoitoon liittyvistä pitkäaikaishaitoista johtuen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli löytää uusia mahdollisia biologisia tekijöitä, jotka ennakoisivat taudin huonoa ennustetta ja samalla antaa uusia näkökulmia HL potilaiden hoidon yksilöllistämiseen. Tämä retrospektiivinen tutkimus käsitti vuosina 1997-2015 samanlaisesti hoidettuja Hodgkinin lymfooma -potilaita. Immunohistokemiallisilla värjäyksillä määritettiin biologisten merkkiaineiden, mukaan lukien oksidatiivisen stressin markkereiden 8- hydroksideoksiguanosiinin (8-OHdG) ja nitrotyrosiinin, sekä antioksidanttientsyymien mangaanisuperoksidi-dismutaasin (MnSOD) sekä peroksiredoksiinien (Prx II, Prx III, Prx V, Prx VI) ilmentymistä HL -potilasnäytteissä. Määrittelimme myös immunohistokemiallisilla värjäyksillä epigeneettisten säätelijöiden lysiinin spesifisen demetylaasientsyymin 4 (KDM4A, KDM4B, KDM4D) sekä sirtuiinien (SIRT1, SIRT4, SIRT6), hypoksiaa indusoivien tekijöiden (HIF-1α, HIF-2α), prolyylihydroksylaasientsyymien (PHD1, PHD2, PHD3) ja DNA:ta korjaavien proteiinien Rap1 vaikuttuvan tekijä 1 (Rif1) ja O6-metyyliguaniini-DNA metyylitransferaasin (MGMT) ilmentymistä edustavissa klassista Hodgkinin lymfoomaa sairastavien potilaiden (engl. cHL) näytteissä. Heikko 8-OHdG värjäytyminen ennusti ennenaikaista taudin uusiutumaa levinneessä HL:ssa ja korkea MnSOD ilmaantuvuus ennusti ennenaikaista taudin uusiutumaa koko HL -ryhmässä. Sädehoidetuilla cHL potilailla voimakas PHD1, KDM4B ja KDM4D värjäytyminen ennusti ennenaikaista taudin uusiutumaa. Tulokset osoittivat myös, että erityisesti sädehoidetuilla levinneen taudin cHL potilailla voimakas HIF-1α, SIRT6, Rif1 ja SIRT6 yhdessä Rif1:n kanssa oli yhteydessä pidentyneeseen uusiutumavapaaseen aikaan. Monimuuttuja-analyysissä PHD1, MnSOD, 8-OHdG ja Rif1 itsenäisenä ja yhdessä SIRT6 kanssa ennustivat tilastollisesti merkitsevästi taudin ennenaikaista uusiutumaa. Tulokset osoittavat näiden eri biomarkkereiden merkittävyyden HL:ssä, erityisesti sädehoitoa saaneilla potilailla. Tuloksista voi olla hyötyä, kun hoitokäytäntöjä yksilöidään, mikä voisi helpottaa välttämään liiallista hoitoa ja hallitsemaan pitkäaikaisiin hoitoihin liittyviä haittoja. Näiden alustavien havaintojen vahvistamiseksi tarvitaan kuitenkin lisätutkimuksia.

Abstract Oxygen is vital for human survival. To ensure its sufficient supply, the body has an intricate system, which involves the circulatory, respiratory and neuroendocrine systems. When oxygen is lacking, a state of hypoxia occurs, and adaptive changes in gene expression increase oxygen delivery to promote survival. The key regulator of the transcriptional hypoxia response is hypoxia-inducible factor (HIF) which targets over 1000 genes. The HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) govern the stability of HIF in an oxygen-dependent fashion. In our studies we investigated whether activation of the hypoxia response through inhibition of either of two distinct HIF-P4Hs, HIF-P4H-2 or P4H-TM would reduce atherosclerosis in mice. We found that inhibition of HIF-P4H-2 led to reductions in numbers of atherosclerotic plaques, and levels of serum cholesterol and inflammation in white adipose tissue and aortic plaques. In addition, HIF-P4H-2 deficient mice had elevated levels of modified LDL-targeting, atheroprotective circulating autoantibodies. The P4H-TM knockout mice also had reduced numbers of atherosclerotic plaques and increased levels of atheroprotective autoantibodies in their sera, but in contrast to the HIF-P4H-2 deficient mice, they also showed a reduction in serum triglyceride levels. To determine how hypoxia alters maternal glucose and lipid metabolism in pregnancy, we studied pregnant mice that were predisposed to a hypoxic condition (15% ambient O2). We found that they had enhanced glucose metabolism due to reduced insulin resistance and an increased flux of glucose to maternal tissues. The hypoxic dams also failed to gain weight and store adipose tissue in the anabolic phase to the same extent as normoxic control dams. These results implicate HIF-P4H inhibition as a novel therapeutic mechanism for atherosclerosis, and suggest that the small molecule HIF-P4H inhibitors currently in clinical trials for renal anemia may have further possible therapeutic applications. In addition, greater understanding of the changes in maternal metabolism that underly reduced fetal growth in hypoxic conditions, and the development of targeted interventions may allow the preservation of fetal growth in cases of maternal hypoxia. / Tiivistelmä Happi on ihmiselle elintärkeää. Tämän vuoksi meille on kehittynyt pitkälle jalostunut verenkierto-, hengitys- ja neuroendokriininen järjestelmä sekä sellaisten geenien ilmentymisen muutoksia, jotka joko lisäävät hapen kuljetusta tai auttavat selviytymään hypoksisissa oloissa, jotta taataan riittävä hapen saanti. Hapen puutteessa hypoksiavaste, jonka tärkein säätelijä on hypoksiassa indusoituva transkriptiotekijä (HIF), aktivoituu. HIF:lla on yli 1000 kohdegeeniä joiden kautta sen vaikutukset välittyvät. HIF-prolyyli-4-hydroksylaasit (HIF-P4H:t) säätelevät HIF:n stabiilisuutta hapesta riippuvaisesti. Tutkimuksessamme selvitimme, vähentääkö hypoksiavasteen aktivointi HIF-P4H-2:n tai P4H-TM:n inhibition kautta ateroskleroosia hiirillä. Tuloksena oli, että HIF-P4H-2:n inhibitio vähensi ateroskleroottisia plakkeja, seerumin kolesterolia ja inflammaatiota valkoisessa rasvakudoksessa sekä plakeissa. Lisäksi hiirillä, joilta puuttui HIF-P4H-2, oli lisääntynyt määrä ateroskleroosilta suojaavia muokattua LDL:ää sitovia autovasta-aineita seerumissa. P4H-TM-poistogeenisillä hiirillä todettiin vastaavasti vähemmän ateroskleroottisia plakkeja ja lisääntynyt määrä ateroskleroosilta suojaavia autovasta-aineita seerumissa. Poiketen HIF-P4H-2-puutteisista hiiristä, niillä oli matalammat seerumin triglyseridi-tasot. Tutkimme raskaina olevia hiiriä, jotka altistimme hypoksisille olosuhteille (15% O2), jotta pystyisimme määrittämään, kuinka hypoksia vaikuttaa äidin sokeri- ja rasva-aineenvaihduntaan. Hypoksiassa raskaana olevilla hiirillä todettiin tehostunut sokeriaineenvaihdunta, joka oli seurausta alentuneesta insuliiniresistenssistä sekä lisääntyneestä sokerin sisäänotosta äidin kudoksiin. Hypoksiassa eivät raskaana olevien hiirten paino eivätkä rasvavarastot lisääntyneet samassa suhteessa normoksiassa raskaana olevien hiirten kanssa. Nämä tulokset tarjoavat uusia mahdollisuuksia HIF-P4H-inhibition käyttämiseen terapeuttisena vaihtoehtona ateroskleroosin hoidossa ja ehkäisemisessä. Kliinisissä kokeissa munuaisperäisen anemian hoidossa olevat HIF-P4H-estäjät voisivat näin ollen saada lisää indikaatioita. Lisäksi korkean ilmanalan aiheuttaman pienipainoisuuden takana olevien aineenvaihdunnan muutoksien ymmärtäminen voi mahdollistaa sikiön kasvun turvaamisen spesifein interventioin.

Abstract Pancreatic cancer remains one of the deadliest malignancies, with dismal prognosis. Pancreatic cancer arises from precursor lesions called pancreatic intraepithelial neoplasia. Toll-like receptors (TLR) are receptors of the innate immunity responsible for initiating immune responses against invading pathogens. Their involvement in cancer progression is becoming evident. Hypoxia is a typical characteristic of pancreatic cancer and linked to poor prognosis. Typically, pancreatic cancer has an abundant desmoplastic stroma that contributes to the hypoxia and poor delivery of anti-tumor drugs to the cancer cells. Tenascin-C and fibronectin are proteins of the extracellular matrix. They are involved in normal organ development, but in recent years, their involvement in various cancers has become evident. This thesis examined the involvement of Toll-like receptors, hypoxia markers HIF-1alpha and Carbonic anhydrase 9 (CAIX) as well as stromal markers tenascin-C and fibronectin in pancreatic cancer. Furthermore, the prognostic effect of each protein was evaluated. The material consisted of whole section tissue samples of surgically treated patients with pancreatic ductal adenocarcinoma. The expression of the proteins was evaluated using immunohistochemical stainings. TLR, HIF-1alpha, CAIX, tenascin-C and fibronectin were all abundantly expressed in pancreatic cancer. High TLR9 associated with improved prognosis while weak HIF-1alpha indicated poor prognosis. In a subgroup analysis consisting of only T1 and T2 tumors, high tenascin-C associated with poor prognosis. There was no significant correlation between TLR and hypoxia marker expression. Based on these results, TLR2, TLR4 and TLR9 are expressed in pancreatic cancer, and high TLR9 associates with improved survival of the patients. Weak HIF-1alpha associated with poor prognosis, suggesting that other factors than hypoxia might be involved in the regulation of HIF-1alpha expression. Tenascin-C and fibronectin are not associated with patient prognosis in pancreatic cancer. / Tiivistelmä Haimasyövällä on kaikista syövistä yksi huonoimmista ennusteista. Haimasyöpä kehittyy tiehyidensisäisistä muutoksista, joita kutsutaan englanninkielisellä nimellä pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN). Tollin kaltaiset reseptorit (TLR) ovat luontaisen immuniteetin reseptoreja, ja niiden tehtävä on aloittaa elimistön puolustusvaste tunkeutuvia taudinaiheuttajia vastaan. Tollin kaltaisten reseptorien osuus on osoitettu eri syövissä. Hypoksia on tyypillistä haimasyövälle, ja se on yleensä yhteydessä huonontuneeseen ennusteen. Tyypillisesti haimasyövällä on voimakas sidekudosreaktio, joka osaltaan lisää kasvaimen hapenpuutetta ja vaikeuttaa sytostaattien kulkeutumista syöpäsoluihin. Tenaskiini ja fibronektiini ovat solunulkoisen tilan proteiineja, jotka osallistuvat normaaliin elimistön kehitykseen. Viime aikoina niillä on huomattu olevan osuutta myös erilaisten syöpien kehittymiseen. Tässä väitöskirjassa on tutkittu Tollin kaltaisten reseptorien, hypoksiamerkkiaineiden HIF-1alpha ja hiilihappoanhydraasi 9 (CAIX) sekä sidekudosmerkkiaineiden tenaskiini ja fibronektiini ilmentymistä haimasyövässä. Lisäksi tutkimuksessa selvitettiin näiden proteiinien osuutta haimasyövän ennusteeseen. Tutkimuksen materiaali koostuu haimasyöpäpotilaiden syöpäkudosnäytteistä. Näytteinä käytettiin kokoleikenäytteitä. Näytteille tehtiin immunohistokemialliset värjäykset, joista eri proteiinien ilmentymistä arvioitiin. Tollin kaltaiset reseptorit, HIF-1alpha, CAIX, tenaskiini ja fibronektiini ilmenivät kaikki haimasyövässä. Korkea TLR9 oli yhteydessä parantuneeseen ennusteeseen, kun taas heikko HIF-1alpha oli yhteydessä huonontuneeseen ennusteeseen. Huomioitaessa vain T1- ja T2-kasvaimet korkea tenaskiini oli yhteydessä huonontuneeseen ennusteeseen. Tollin kaltaisten reseptorien ja hypoksiamerkkiaineiden välillä ei ollut merkittävää yhteyttä. Tulosten perusteella haimasyövässä on runsaasti Tollin kaltaisia reseptoreita, ja korkea TLR9 on yhteydessä parantuneeseen ennusteeseen. Matala HIF-1alpha on yhteydessä huonoon ennusteeseen. Tenaskiinilla ja fibronektiinilla ei ole vaikutusta potilaiden ennusteeseen.

Abstract Adequate oxygen supply is necessary for aerobic cell survival. Cellular oxygen deprivation, also known as hypoxia, leads to various responses that aim to increase cellular oxygen delivery and reduce oxygen consumption. Oxygen homeostasis is mainly regulated by the hypoxia-inducible factor (HIF), which regulates the expression of over 300 genes in response to hypoxia. The stability of HIF is regulated by the HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs), enzymes that catalyze the hydroxylation of proline residues in HIFα subunits and target them towards proteasomal degradation. HIF-P4Hs require oxygen as a cosubstrate for the reaction, allowing for hypoxic HIF stabilization and target gene induction at low oxygen concentrations. In this study we investigated the role of HIF-P4H-2 in the regulation of red blood cell production, erythropoiesis. We showed that Tibetans living at high altitude have genetically adapted to their hypoxic environment via mutations in the gene encoding for HIF-P4H-2. The Tibetan HIF-P4H-2 D4E,C127S variant showed enhanced hydroxylation of HIFα at low oxygen concentrations, resulting in reduced HIFα protein stabilization under hypoxia. In other studies we used a genetically modified HIF-P4H-2 hypomorphic mouse line which expresses a reduced amount of wild-type Hif-p4h-2 mRNA in tissues. We showed that these mice develop mild age-dependent erythrocytosis due to splenic extramedullary erythropoiesis, which is independent of serum erythropoietin concentration. In addition, these mice were protected against inflammation-induced anemia, a condition commonly seen in patients with inflammatory diseases. The HIF-P4H-2 hypomorphic mice also had altered basal metabolism in their skeletal muscles, which, together with an increase in mean capillary area, reduced their infarct size after skeletal muscle ischemia-reperfusion injury. These studies suggest that pharmacological HIF-P4H-2 inhibition may provide a novel treatment for EPO-resistant anemias and peripheral artery disease. / Tiivistelmä Riittävä hapensaanti on välttämätöntä aerobisten solujen selviytymiselle. Solun alentunut hapen määrä, toiselta nimeltään hypoksia, johtaa useisiin vasteisiin joiden tarkoituksena on turvata solun hapensaanti ja vähentää hapenkulutusta. Happitasapainoa säätelee hypoksiassa indusoituva tekijä (HIF), joka aktivoi yli 300 geenin luentaa hypoksisissa oloissa. HIFα:n määrää soluissa säätelevät HIF prolyyli-4-hydroksylaasientsyymit (HIF-P4H:t), jotka hydroksyloivat proliini-aminohappotähteitä HIFα-alayksiköissä ja ohjaavat ne proteasomaaliseen hajotukseen. HIF-P4H:t tarvitsevat reaktiossa happea mahdollistaen HIF:n stabilisaation ja kohdegeenien lisääntyneen luennan matalassa hapen osapaineessa. Tässä tutkimuksessa selvitimme HIF-P4H-2-entsyymin roolia punasolujen muodostuksen eli erytropoieesin säätelyssä. Osoitimme, että korkealla vuoristossa asuvat tiibetiläiset ovat geneettisesti sopeutuneet hypoksiseen elinympäristöönsä johtuen HIF-P4H-2-entsyymiä tuottavan geenin mutaatiosta. Tiibetiläisiltä löytynyt HIF-P4H-2D4E,C127S variantti hydroksyloi tehokkaammin HIFα-alayksiköitä matalassa hapen osapaineessa johtaen vähäisempään HIFα-alayksiköiden stabiloitumiseen hypoksiassa. Muissa tutkimuksissamme käytimme geneettisesti muunneltua HIF-P4H-2-hiirikantaa, joka tuottaa alentunutta määrää villityypin Hif-p4h-2 lähetti-RNA:ta kudoksissaan. Näille hiirille kehittyi ikäriippuvaisesti lievä punasoluylimäärä eli erytrosytoosi johtuen pernan kiihtyneestä punasolutuotannosta riippumatta seerumin erytropoietiinikonsentraatiosta. Lisäksi nämä hiiret olivat suojassa tulehduksen aiheuttamalta anemialta, joka on yleinen ilmiö tulehduksellisista sairauksista kärsivillä potilailla. HIF-P4H-2-muuntogeenisten hiirten lihasten energia-aineenvaihdunta oli muuttunut siten, että se yhdessä suurentuneen keskimääräisen kapillaaripinta-alan kanssa pienensi vaurioituneen kudoksen pinta-alaa alaraajaiskemia-altistuksen jälkeen. Nämä tutkimukset osoittavat, että lääkkeellinen HIF-P4H-2-entsyymin estäminen on mahdollinen uusi hoitomuoto erytropoietiinille resistenteissä anemioissa sekä alaraajojen valtimoahtaumataudissa.

Abstract Oxygen is essential for aerobic organisms, as shortage of oxygen (hypoxia) can induce cellular dysfunctions and even cell death, leading to tissue damage and decreased viability of the organism. Oxygen homeostasis is regulated delicately by several mechanisms, the major one being the hypoxia-inducible factor (HIF) pathway that is evolutionarily conserved. HIFα subunits are regulated in an oxygen-dependent manner via three HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs). In the presence of oxygen HIF-P4Hs modify HIFα, which leads to its degradation, whereas in hypoxia the HIF-P4H enzymes cannot function and HIFα is stabilized. HIF regulates more than 300 genes that enhance oxygen delivery from the lungs to tissues and reduce oxygen consumption in tissues, such as those for erythropoietin and vascular endothelial growth factor. When a tissue suffers from hypoxia caused by a circulatory restriction, the situation is called ischemia. In this study we used a genetically modified HIF-P4H-2 hypomorph mouse line that expresses 8% of the wild-type Hif-p4h-2 mRNA in the heart and 19% in skeletal muscle, and has HIFα stabilization in both tissues. We showed that chronic HIF-P4H-2 deficiency leads to protection against acute ischemic injury both in the heart and in skeletal muscle. The protection was mainly due to enlarged capillaries and better perfusion in both tissues. Hypoxia is known to decrease body weight. The observation of the HIF-P4H-2 deficient mice being leaner than their wild-type littermates led us to study their body constitution, metabolism and adipose tissue in detail. We discovered that chronic HIF-P4H-2 deficiency protects against obesity and several metabolic dysfunctions including diabetes and metabolic syndrome. These beneficial outcomes were mimicked when a pharmacological pan-HIF-P4H inhibitor was administered to wild-type mice. In these studies we showed that pharmacological HIF-P4H-2 inhibition may provide a novel treatment for diseases such as acute myocardial infarction, peripheral artery disease and metabolic disorders. / Tiivistelmä Happi on edellytys aerobisen eliön, kuten ihmisen, elämälle; hapen niukkuus (hypoksia) voi johtaa monenlaisiin solun toimintahäiriöihin, jotka voivat edelleen aiheuttaa solun kuoleman, kyseisen kudoksen vaurion, ja lopulta eliön elinkyvyn heikkenemisen. Happitasapainoa säädellään monilla menetelmillä, joista merkittävin on hypoksiassa indusoituvasta tekijästä (HIF) riippuvainen reitti, joka on evoluutiossa säilynyt. HIFα alayksiköitä säätelee hapesta riippuvaisesti kolme HIF prolyyli 4-hydroksylaasia (HIF-P4Ht). Hapen läsnä ollessa HIF-P4H on aktiivinen ja johtaa HIFα:n hajottamiseen, kun taas hypoksiassa HIF-P4H entsyymit eivät voi toimia ja siten HIFα stabiloituu. HIF säätelee yli 300 geeniä, jotka edistävät hapen kuljetusta ja pääsyä keuhkoista kudoksiin sekä vähentävät hapenkulutusta. Näitä geenejä ovat mm. erytropoietiini sekä vaskulaarinen endoteelikasvutekijä. Kudoksen heikentyneestä verenkierrosta johtuvaa hapenpuutetta kutsutaan iskemiaksi. Tässä tutkimuksessa käytimme geneettisesti muunneltua HIF-P4H-2 hypomorfi-hiirikantaa, joka tuottaa Hif-p4h-2 lähetti-RNA:ta sydämessä vain 8 % ja luurankolihaksessa 19 % villityypin määrästä, ja jolla on HIFα stabiloituneena molemmissa kudoksissa. Osoitimme, että krooninen HIF-P4H-2:n puute suojaa sekä sydäntä että luurankolihasta akuutissa iskemiassa. Vaikutus johtui pääasiassa suuremmista kapillaareista ja paremmasta perfuusiosta molemmissa kudoksissa. Aikaisempien tutkimusten perusteella tiedetään, että hypoksia alentaa painoa. Huomio siitä, että HIF-P4H-2 puutteiset hiiret ovat hoikempia kuin villityypin sisaruksensa, johti meidät tutkimaan hiirten kehon koostumusta, aineenvaihduntaa ja rasvakudosta tarkemmin. Tutkimuksissamme selvisi, että krooninen HIF-P4H-2:n puute suojaa lihavuudelta ja monelta aineenvaihdunnan häiriöltä kuten sokeritaudilta ja metaboliselta oireyhtymältä. Nämä edulliset vaikutukset toistuivat, kun annoimme villityypin hiirille pan-HIF-P4H inhibiittoria. Kaiken kaikkiaan, näissä tutkimuksissa osoitimme, että lääkkeellinen HIF-P4H-2:n estäminen voi tarjota uuden keinon sydäninfarktin, luurankolihasiskemian ja aineenvaihdunnan häiriöiden hoitoon.

Abstract 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases (2-OGDDs) are an enzyme family that contains many enzymes that modify chromatin in extensive ways. These enzymes include several histone lysine demethylases (KDMs) and TET enzymes that convert methylated cytosine (5-mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) ultimately leading to DNA demethylation. Disturbed DNA and histone methylation are found in many cancers. However, the role of KDMs and TETs behind these oncogenic changes has so far not been fully investigated. This study focused on the role of these chromatin-modifying enzymes in cancers with special emphasis on enzyme kinetic studies. Cancers with inactivating fumarate hydratase (FH), succinate dehydrogenase (SDH) and isocitrate dehydrogenase (IDH) mutations accumulate fumarate, succinate and R-2-hydroxyglutarate, respectively. In this study we showed how these cancer-associated 2-oxoglutarate (2-OG) analogues can inhibit the TET enzymes and many of the KDMs leading to lower 5-hmC levels and increased H3K27 and H3K9 methylation on chromatin, respectively. We also characterized kinetic properties of acute myeloid leukaemia (AML)-associated TET2 mutants and found that their ability to bind 2-OG or iron was impaired leading to diminished catalytic activity. Tumours are often hypoxic due to inadequate vasculature and blood supply. The TET enzymes and KDMs require oxygen for the reactions they catalyse. We determined the oxygen affinity of TETs and many KDMs and found that a H3K27 demethylase KDM6A has a remarkably low affinity for oxygen indicating that it is inactivated in hypoxic tumours and tissues. H3K27 methylation was found to be increased in hypoxic cells and this blocked cell differentiation. Altogether, these studies shed light on the mechanisms behind the altered DNA and histone methylation found in several cancers with hypoxic conditions or FH, SDH and IDH mutations. Altered DNA and histone methylation has previously been associated with progression of cancer, such as epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We now linked catalytic inhibition of 2-OGDDs to disturbed DNA and histone methylation that can account for altered cell differentiation, EMT and increased aggressiveness and invasiveness of cancers. / Tiivistelmä 2-oksoglutaraatista riippuvaiset dioksygenaasit ovat entsyymiperhe, johon kuuluu useita entsyymejä, jotka muokkaavat kromatiinin epigeneettisiä merkkejä monin tavoin. Näitä entsyymejä ovat mm. DNA:n demetylaatioon vaikuttavat TET-entsyymit sekä useat histonidemetylaasit. Vaikka muutoksia DNA:n ja histonien metylaatiotasoissa on havaittu useissa syövissä, ei näiden entsyymien roolia muutosten taustalla ole vielä tutkittu. Tämä tutkimus kohdistui näiden epigenetiikkaan vaikuttavien entsyymien roolin ymmärtämiseen syövissä keskittyen erityisesti kyseisten entsyymien kinetiikkaan. Useissa syövissä on havaittu fumaraattihydrataasin, sukkinaattidehydrogenaasin ja isositraattidehydrogenaasien aktiivisuuteen vaikuttavia mutaatioita, jotka johtavat fumaraatin, sukkinaatin ja R-2-hydroksiglutaraatin kertymiseen syöpäsoluihin. Tässä tutkimuksessa osoitimme, kuinka nämä karsinogeeniset 2-oksoglutaraattianalogit voivat inhiboida TET-entsyymejä ja histonidemetylaaseja, mikä alentaa 5-hydroksimetyylisytosiinitasoja ja lisää histonien metylaatiota. Näytämme myös, kuinka tietyillä akuutissa myelooisessa leukemiassa esiintyvillä TET2-mutanteilla on heikentynyt kyky sitoa 2-oksoglutaraattia tai rautaa, mikä johtaa entsyymien aktiivisuuden laskuun. Kasvainkudoksissa happipitoisuudet ovat usein matalia nopean kasvun ja puutteellisen verisuonituksen vuoksi. TET-entsyymit ja histonidemetylaasit vaativat happea katalysoimissaan reaktioissa. Määritimme TET-entsyymien ja monien histonidemetylaasien riippuvuutta hapesta ja osoitimme, että H3K27-histonidemetylaasi KDM6A on erittäin riippuvainen hapesta, mikä osoittaa, ettei se pysty toimimaan kasvaimissa ja kudoksissa, joissa happipitoisuudet ovat matalia. Huomasimme, että vähähappisissa olosuhteissa solujen H3K27 metylaatio on lisääntynyt, mikä johti erilaistumisen estymiseen soluissa. Tämä tutkimus paljasti uusia mekanismeja useista syövistä löytyneiden muuntuneiden DNA:n ja histonien metylaatiotasojen taustalla. Häiriintynyt DNA:n ja histonien metylaatio on aiemmin yhdistetty syöpien etenemiseen, erityisesti solujen erilaistumisen häiriintymisen kannalta. Tässä tutkimuksessa yhdistimme 2-oksoglutaraatista riippuvaisten entsyymien inhibition häiriintyneeseen DNA:n ja histonien metylaatioon, joka voi johtaa muuntuneeseen solujen erilaistumiseen ja lopulta lisääntyneeseen syöpien aggressiivisuuteen ja invasiivisuuteen.

Abstract Oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) is the most common cancer of the oral cavity. The 5-year mortality of OTSCC remains at about 50%. The tumor microenvironment (TME) is now recognized as an important factor in cancer progression and metastasis, as well as a tool for prognostication. The aim of this study was to elucidate the roles of TME hypoxia and soluble factors on cancer cell migration and invasion, and the prognostic value of two extracellular matrix (ECM) molecules: tenascin-C (TNC) and fibronectin (FN). Hypoxia was studied using oral squamous cell carcinoma cells in migration and invasion assays. Invasion assays were carried out using a 3D-myoma invasion method. Similarly, the effect of soluble factors as well as ECM alterations were studied using the myoma model: the effect of soluble factors was studied by rinsing the myoma discs prior to experiments, and ECM alterations by lyophilizing and rehydrating. ECM was further studied by analyzing the prognostic value of TNC and FN from OTSCC samples. The effect of hypoxia was shown to be OTSCC cell line dependent: the effect of hypoxia on migration and invasion was increased in aggressive cell lines. Additionally, the response to hypoxia was altered in rinsed tissue. Tissue rinsing media were analyzed and factors affecting cell motility were found. The TME was found to be pivotal for cancer invasion: invasion was impaired in non-neoplastic tissue. Furthermore, changes in the ECM by lyophilization and rehydration led to a change in the invasion mechanism. High expression of stromal TNC and FN were excellent prognosticators in early-stage OTSCC. In conclusion, the present study highlighted the role of various TME components in cancer cell invasion as well as prognostication in OTSCC. Additionally, this study provided feasible tools for more precise diagnosis of early-stage OTSCC. / Tiivistelmä Liikkuvan kielen levyepiteelikarsinooma (OTSCC) on suuontelon yleisin syöpä. Viiden vuoden kuolleisuus OTSCC:an on edelleen noin 50 %. Kasvaimen mikroympäristön (TME) tiedetään nykyään olevan tärkeässä roolissa syövän kehityksessä ja etäpesäkkeiden muodostuksessa, sekä tarjoavan työkaluja ennusteiden laadintaan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää TME:n hypoksian ja liukoisten tekijöiden vaikutusta syöpäsolujen liikkumiseen ja invaasioon ympäröivään kudokseen, sekä tutkia kahden solunulkoisen matriksin (ECM) proteiinin, tenaskiini-C:n (TNC) ja fibronektiinin (FN), vaikutusta OTSCC:n ennusteeseen. Hypoksian vaikutusta tutkittiin käyttäen suun levyepiteelikarsinoomasoluja liikkuvuus- ja invaasiokokeissa. Invaasiokokeissa hyödynnettiin kolmiulotteista ihmisen myoomaan perustuvaa invaasiomallia. Myös liukoisten tekijöiden ja ECM:n muutosten vaikutusten tutkimisessa käytettiin myoomamallia: liukoisten tekijöiden vaikutusta tutkittiin huuhtomalla myoomakiekot ennen niiden käyttämistä, ja ECM:n muutosten vaikutusta kylmäkuivaamalla ja uudelleen nesteyttämällä myoomakiekot. ECM:ia tutkittiin myös analysoimalla TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden merkitystä OTSCC:n ennusteessa. Hypoksian vaikutus osoittautui solulinjariippuvaiseksi: hypoksia lisäsi kielisyöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasiota eniten aggressiivisimmilla solulinjoilla. Lisäksi solujen vaste hypoksialle oli erilainen huuhdotussa kudoksessa. Huuhteluliuos analysoitiin ja siitä löydettiin solujen liikkumiseen vaikuttavia tekijöitä. TME:n havaittiin olevan ratkaisevassa roolissa syöpäsolujen invaasiossa: syöpäsolut eivät kyenneet invasoitumaan lainkaan ei-neoplastiseen kudokseen. Lisäksi muutosten ECM:ssä havaittiin johtavan muutoksiin solujen käyttämässä invaasion mekanismissa. Strooman TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden todettiin olevan erinomaisia ennustekijöitä aikaisen vaiheen OTSCC:ssa. Tiivistettynä voidaan todeta, että tämä tutkimus alleviivasi useiden TME:n komponenttien vaikutusta syövän invaasiolle ja ennusteelle OTSCC:ssä. Lisäksi se tarjoaa käyttökelpoiset työkalut (TNC ja FN) tarkemmalle diagnostiikalle aikaisen vaiheen OTSCC:ssä.

Abstract Mediators of epithelial permeability, angiogenesis and invasion may serve as prognostic indicators and targets for therapies in esophageal cancer (EC). The expressions of claudins, hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor-A (VEGF), nitric oxide synthases (iNOS, eNOS, nNOS) and toll-like receptor 9 (TLR9) were evaluated by immunohistochemistry in EC. The results were compared with clinicopathological variables, tumor proliferation and apoptosis. All of the claudins were expressed in most of the cancers. Esophageal adenocarcinomas (EAC) displayed more often increased claudin 3 and 5 expression than esophageal squamous cell carcinomas (ESCC). Loss of claudin 3 expression associated with distant metastases in EC and a tendency in this direction was also observed for claudin 4. Cancers with stronger claudin 4 expression showed increased apoptosis in both EAC and ESCC. HIF-1α was present in most of the ECs and like iNOS more often in ESCC than in EAC. Strong HIF-1α expression tended to associate with positive VEGF immunostaining. In ESCC, both strong HIF-1α expression and VEGF positivity tended to associate with increased microvessel density (MVD). In EAC, tumors showing VEGF positivity associated with increased MVD outside the tumor. Patients with strong HIF-1α expression had more often distant metastases than other patients in EC. There was no VEGF expression in normal esophageal mucosa and T3-4 tumors tended to be more often VEGF positive than T1-2 tumors. The expression of TLR9 was more intensive in dysplasia than in normal epithelium and ESCC and abundant TLR9 expression could serve as a marker of squamous cell high grade dysplasia. Intensive TLR9 expression was associated with higher grade tumors and the presence of nodal and distant metastases in ESCC. EC and its progression may be related to increased angiogenesis regulated by VEGF and HIF-1α. In EC, claudin expression varies along with the histology of the tumor. Claudin expression may be associated with apoptosis or proliferation and contribute to tumor behavior. An association was detected between moderate to strong expression of claudin 3 and a high TLR9 histoscore in ESCC. Altered expression of claudin 3 may result to upregulation of endosomal TLR9. TLR9 may serve as a marker for squamous cell dysplasia and ESCC progression. / Tiivistelmä Solukerrosten läpäisevyyttä, verisuonten uudismuodostusta ja kasvainsolujen liikkuvuutta säätelevät tekijät voivat toimia ruokatorvisyövän ennustetekijöinä ja hoidon kohteina. Tässä tutkimuksessa selvitettiin klaudiinien, hypoksia-indusoituvan tekijän 1α (HIF-1α), verisuonen endoteelin kasvutekijän A (VEGF), kolmen typpioksidisyntaasin (iNOS, eNOS ja nNOS) sekä tollin kaltaisen reseptorin 9 (TLR9) ilmentymistä ja merkitystä ruokatorvisyövässä immunohistokemiallisin menetelmin. Tuloksia arvioitiin suhteessa proliferaatioon ja apoptoosiin. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät jokaista tutkittua klaudiinia. Ruokatorven rauhassyövässä ilmeni levyepiteelisyöpää useammin klaudiineja 3 ja 5. Klaudiinin 3 vähäinen ilmentyminen oli yhteydessä etäpesäkkeiseen tautiin. Sama suuntaus näkyi klaudiinin 4 kohdalla. Apoptoosia todettiin enemmän kasvaimissa, jotka ilmensivät muita enemmän klaudiini 4:ä. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät HIF-1α:a. Sekä iNOS että HIF-1α ilmentyivät runsaammin levyepiteeli- kuin rauhassyövässä. Tutkimus viittasi yhteyteen voimakkaan HIF-1α:n ilmentymisen ja VEGF:n ilmentymisen välillä. Voimakas HIF-1α:n ilmentyminen ja VEGF:n ilmentyminen vaikuttivat liittyvän ruokatorven levyepiteelisyövän uudissuonituksen lisääntymiseen. Rauhassyövän lisääntynyt uudissuonitus kasvaimen ulkopuolella saattaa liittyä VEGF:n ilmentymiseen. Potilailla, joiden kasvaimissa HIF-1α:n ilmentyminen oli voimakasta, todettiin etäpesäkkeitä muita useammin. VEGF:a ei todettu normaalissa limakalvossa, ja sen ilmentyminen vaikutti olevan yleisempää syvälle kasvavissa kuin pinnallisissa syövissä. TLR9 ilmentyi voimakkaammin levyepiteelin dysplasiassa kuin normaalissa tai kasvainepiteelissä. Huonosti erilaistuvissa ja levinneissä kasvaimissa TLR9 ilmentyi voimakkaammin kuin muissa kasvaimissa. Ruokatorvisyövän synty ja eteneminen voivat liittyä HIF:n ja VEGF:n säätelemään verisuonten uudismuodostukseen. Klaudiinit saattavat vaikuttaa syövän käyttäytymiseen myös apoptoosin ja proliferaation kautta. Tutkimuksessa todettiin yhteys lisääntyneen klaudiinin 3 ilmentymisen ja voimakkaasti ilmentyvän TLR9:n välillä. Muutos klaudiinin 3 ilmentymisessä saattaa lisätä levyepiteelin läpäisevyyttä johtaen TLR9:n aktivoitumiseen. TLR9 voi vaikuttaa ruokatorven levyepiteelin dysplasian ja syövän syntyyn sekä toimia vaikean dysplasian ja aggressiivisen levyepiteelisyövän merkkiaineena.