Abstract Pancreatic cancer remains one of the deadliest malignancies, with dismal prognosis. Pancreatic cancer arises from precursor lesions called pancreatic intraepithelial neoplasia. Toll-like receptors (TLR) are receptors of the innate immunity responsible for initiating immune responses against invading pathogens. Their involvement in cancer progression is becoming evident. Hypoxia is a typical characteristic of pancreatic cancer and linked to poor prognosis. Typically, pancreatic cancer has an abundant desmoplastic stroma that contributes to the hypoxia and poor delivery of anti-tumor drugs to the cancer cells. Tenascin-C and fibronectin are proteins of the extracellular matrix. They are involved in normal organ development, but in recent years, their involvement in various cancers has become evident. This thesis examined the involvement of Toll-like receptors, hypoxia markers HIF-1alpha and Carbonic anhydrase 9 (CAIX) as well as stromal markers tenascin-C and fibronectin in pancreatic cancer. Furthermore, the prognostic effect of each protein was evaluated. The material consisted of whole section tissue samples of surgically treated patients with pancreatic ductal adenocarcinoma. The expression of the proteins was evaluated using immunohistochemical stainings. TLR, HIF-1alpha, CAIX, tenascin-C and fibronectin were all abundantly expressed in pancreatic cancer. High TLR9 associated with improved prognosis while weak HIF-1alpha indicated poor prognosis. In a subgroup analysis consisting of only T1 and T2 tumors, high tenascin-C associated with poor prognosis. There was no significant correlation between TLR and hypoxia marker expression. Based on these results, TLR2, TLR4 and TLR9 are expressed in pancreatic cancer, and high TLR9 associates with improved survival of the patients. Weak HIF-1alpha associated with poor prognosis, suggesting that other factors than hypoxia might be involved in the regulation of HIF-1alpha expression. Tenascin-C and fibronectin are not associated with patient prognosis in pancreatic cancer. / Tiivistelmä Haimasyövällä on kaikista syövistä yksi huonoimmista ennusteista. Haimasyöpä kehittyy tiehyidensisäisistä muutoksista, joita kutsutaan englanninkielisellä nimellä pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN). Tollin kaltaiset reseptorit (TLR) ovat luontaisen immuniteetin reseptoreja, ja niiden tehtävä on aloittaa elimistön puolustusvaste tunkeutuvia taudinaiheuttajia vastaan. Tollin kaltaisten reseptorien osuus on osoitettu eri syövissä. Hypoksia on tyypillistä haimasyövälle, ja se on yleensä yhteydessä huonontuneeseen ennusteen. Tyypillisesti haimasyövällä on voimakas sidekudosreaktio, joka osaltaan lisää kasvaimen hapenpuutetta ja vaikeuttaa sytostaattien kulkeutumista syöpäsoluihin. Tenaskiini ja fibronektiini ovat solunulkoisen tilan proteiineja, jotka osallistuvat normaaliin elimistön kehitykseen. Viime aikoina niillä on huomattu olevan osuutta myös erilaisten syöpien kehittymiseen. Tässä väitöskirjassa on tutkittu Tollin kaltaisten reseptorien, hypoksiamerkkiaineiden HIF-1alpha ja hiilihappoanhydraasi 9 (CAIX) sekä sidekudosmerkkiaineiden tenaskiini ja fibronektiini ilmentymistä haimasyövässä. Lisäksi tutkimuksessa selvitettiin näiden proteiinien osuutta haimasyövän ennusteeseen. Tutkimuksen materiaali koostuu haimasyöpäpotilaiden syöpäkudosnäytteistä. Näytteinä käytettiin kokoleikenäytteitä. Näytteille tehtiin immunohistokemialliset värjäykset, joista eri proteiinien ilmentymistä arvioitiin. Tollin kaltaiset reseptorit, HIF-1alpha, CAIX, tenaskiini ja fibronektiini ilmenivät kaikki haimasyövässä. Korkea TLR9 oli yhteydessä parantuneeseen ennusteeseen, kun taas heikko HIF-1alpha oli yhteydessä huonontuneeseen ennusteeseen. Huomioitaessa vain T1- ja T2-kasvaimet korkea tenaskiini oli yhteydessä huonontuneeseen ennusteeseen. Tollin kaltaisten reseptorien ja hypoksiamerkkiaineiden välillä ei ollut merkittävää yhteyttä. Tulosten perusteella haimasyövässä on runsaasti Tollin kaltaisia reseptoreita, ja korkea TLR9 on yhteydessä parantuneeseen ennusteeseen. Matala HIF-1alpha on yhteydessä huonoon ennusteeseen. Tenaskiinilla ja fibronektiinilla ei ole vaikutusta potilaiden ennusteeseen.

Abstract Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a common pathogen with an age-standardized seroprevalence of 52% in Finland. The most common manifestation of HSV-1 infection is labial herpes, but recently HSV-1 has emerged as the most common cause of primary genital herpes in Finnish women. HSV-1 can also lead to severe conditions such as encephalitis. After the primary lytic HSV-1 infection at the epithelia, the progeny viruses infect the innervating sensory neurons. The neuronal infection may lead to a quiescent infection form, called latency. Periodically, the virus may reactivate, which can lead to recurrent infection at the epithelia. During different phases of the viral life cycle the host cells try to restrict the infection. This study set out to investigate the roles of two HSV-1 proteins, γ134.5 and Us3 during different phases of the HSV-1 life cycle. The aim of the first study was to investigate how the deletion of Us3 affected host responses, especially Toll-like Receptor (TLR) signaling, in monocytic U937 cells. TLR3 expression was increased during Us3 deletion virus infections. This also led to increased activation of IRF-3 and increased expression of type I interferons (IFN) and an interferon stimulated protein. This study shows that TLR3 is involved in controlling the HSV-1 infection and that Us3 regulates IRF-3 activation. The second study focused on the role of the γ134.5 protein in HSV-1 latency. Embryonic mouse dorsal root ganglion (DRG) cultures were used as a cell culture model for HSV-1 latency and reactivation. In this model γ134.5 deletion viruses did not reactivate as efficiently as wild-type viruses, even though they replicated well and established latency in the neurons. Stress granules are part of the host response. In the third study, the roles of the innate immunity effectors HSV-1 Us3 and human Z-DNA binding protein 1 (ZBP1) in stress granule formation (SG) were studied. Wild-type HSV-1 efficiently prevented the formation of SGs. The overexpression of ZBP1 resulted in accumulation of smaller but more abundant SGs during oxidative stress. Overexpression of Us3 did not significantly affect the size or number of SGs, but during Us3 deletion virus infection, SG proteins localized to cis-Golgi. This work shows that HSV-1 uses Us3 to evade and modulate host responses and that the γ134.5 protein is required for reactivation in mouse DRG cultures. / Tiivistelmä Herpes simplex virus tyyppi 1 (HSV-1) on yleinen taudinaiheuttaja, jonka ikävakioitu seroprevalenssi Suomessa on 52 %. HSV-1 tunnetaan yleisimmin huuliherpeksen aiheuttajana, mutta myös kasvava osuus genitaaliherpeksistä on HSV-1:n aiheuttamia. HSV-1 voi johtaa myös vakaviin ilmentymiin, kuten aivotulehdukseen. Epiteelisolujen infektion tuottamia viruksia siirtyy aluetta hermottaviin tuntohermosoluihin, mikä voi johtaa piilevään infektiomuotoon eli latenssiin. Latentti virus voi ajoittain reaktivoitua, mistä voi seurata uusintainfektio. Isäntäsolu pyrkii rajoittamaan infektiota sen eri vaiheissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kahden HSV-1:n virulenssiproteiinin, γ134.5:n ja Us3:n, merkitystä HSV-1:n elinkierrossa. Osatyössä I tutkittiin, miten Us3:n poisto vaikuttaa luontaisen immuniteetin vasteisiin, keskittyen etenkin Tollin kaltaisten reseptorien (TLR) signaalivälitykseen U937-monosyyttisoluissa. Us3-poistogeenisillä viruksilla suoritetuissa infektioissa TLR3:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi. Tämä johti myös lisääntyneeseen IRF-3-aktivaatioon sekä tyypin I interferonien ja interferonistimuloituvan proteiinin lisääntyneeseen ilmentymiseen. Tämä osoittaa, että TLR3 osallistuu HSV-1-viruksen tunnistukseen ja että Us3 säätelee IRF-3:n aktivaatiota. Osatyössä II keskityttiin γ134.5-proteiinin merkitykseen HSV-1:n latenssissa. Hiirialkioiden takajuuren hermoganglioita käytettiin soluviljelymallina HSV-1:n latenssin ja reaktivaation tutkimisessa. Tässä mallissa γ134.5-poistogeeniset virukset kasvoivat hyvin ja asettuivat latenteiksi, mutta eivät silti reaktivoituneet kuten luonnonkannan virukset. Stressijyväset ovat osa luontaista immuniteettia. Osatyössä III määritettiin HSV-1:n Us3-proteiinin ja ihmisen Z-DNA:han sitoutuvan proteiini 1:n (ZBP1) merkitystä stressijyvästen muodostumisessa. Luonnonkannan virus kykeni tehokkaasti estämään jyvästen muodostumisen. ZBP1:n yli-ilmentäminen oksidatiivisen stressin aikana johti suureen määrään pienikokoisia stressijyväsiä. Us3:n yli-ilmentäminen ei vaikuttanut stressijyväsiin, kun taas Us3-poistogeenisellä viruksella suoritetuissa infektioissa stressijyväsproteiinit paikantuivat Golgin laitteeseen. Tämä tutkimus osoittaa, että HSV-1 käyttää Us3-proteiinia luontaisten immuunivasteiden muunteluun ja että γ134.5-proteiini on välttämätön reaktivaatiossa hiiren hermoganglioissa.