Abstract Pancreatic cancer remains one of the deadliest malignancies, with dismal prognosis. Pancreatic cancer arises from precursor lesions called pancreatic intraepithelial neoplasia. Toll-like receptors (TLR) are receptors of the innate immunity responsible for initiating immune responses against invading pathogens. Their involvement in cancer progression is becoming evident. Hypoxia is a typical characteristic of pancreatic cancer and linked to poor prognosis. Typically, pancreatic cancer has an abundant desmoplastic stroma that contributes to the hypoxia and poor delivery of anti-tumor drugs to the cancer cells. Tenascin-C and fibronectin are proteins of the extracellular matrix. They are involved in normal organ development, but in recent years, their involvement in various cancers has become evident. This thesis examined the involvement of Toll-like receptors, hypoxia markers HIF-1alpha and Carbonic anhydrase 9 (CAIX) as well as stromal markers tenascin-C and fibronectin in pancreatic cancer. Furthermore, the prognostic effect of each protein was evaluated. The material consisted of whole section tissue samples of surgically treated patients with pancreatic ductal adenocarcinoma. The expression of the proteins was evaluated using immunohistochemical stainings. TLR, HIF-1alpha, CAIX, tenascin-C and fibronectin were all abundantly expressed in pancreatic cancer. High TLR9 associated with improved prognosis while weak HIF-1alpha indicated poor prognosis. In a subgroup analysis consisting of only T1 and T2 tumors, high tenascin-C associated with poor prognosis. There was no significant correlation between TLR and hypoxia marker expression. Based on these results, TLR2, TLR4 and TLR9 are expressed in pancreatic cancer, and high TLR9 associates with improved survival of the patients. Weak HIF-1alpha associated with poor prognosis, suggesting that other factors than hypoxia might be involved in the regulation of HIF-1alpha expression. Tenascin-C and fibronectin are not associated with patient prognosis in pancreatic cancer. / Tiivistelmä Haimasyövällä on kaikista syövistä yksi huonoimmista ennusteista. Haimasyöpä kehittyy tiehyidensisäisistä muutoksista, joita kutsutaan englanninkielisellä nimellä pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN). Tollin kaltaiset reseptorit (TLR) ovat luontaisen immuniteetin reseptoreja, ja niiden tehtävä on aloittaa elimistön puolustusvaste tunkeutuvia taudinaiheuttajia vastaan. Tollin kaltaisten reseptorien osuus on osoitettu eri syövissä. Hypoksia on tyypillistä haimasyövälle, ja se on yleensä yhteydessä huonontuneeseen ennusteen. Tyypillisesti haimasyövällä on voimakas sidekudosreaktio, joka osaltaan lisää kasvaimen hapenpuutetta ja vaikeuttaa sytostaattien kulkeutumista syöpäsoluihin. Tenaskiini ja fibronektiini ovat solunulkoisen tilan proteiineja, jotka osallistuvat normaaliin elimistön kehitykseen. Viime aikoina niillä on huomattu olevan osuutta myös erilaisten syöpien kehittymiseen. Tässä väitöskirjassa on tutkittu Tollin kaltaisten reseptorien, hypoksiamerkkiaineiden HIF-1alpha ja hiilihappoanhydraasi 9 (CAIX) sekä sidekudosmerkkiaineiden tenaskiini ja fibronektiini ilmentymistä haimasyövässä. Lisäksi tutkimuksessa selvitettiin näiden proteiinien osuutta haimasyövän ennusteeseen. Tutkimuksen materiaali koostuu haimasyöpäpotilaiden syöpäkudosnäytteistä. Näytteinä käytettiin kokoleikenäytteitä. Näytteille tehtiin immunohistokemialliset värjäykset, joista eri proteiinien ilmentymistä arvioitiin. Tollin kaltaiset reseptorit, HIF-1alpha, CAIX, tenaskiini ja fibronektiini ilmenivät kaikki haimasyövässä. Korkea TLR9 oli yhteydessä parantuneeseen ennusteeseen, kun taas heikko HIF-1alpha oli yhteydessä huonontuneeseen ennusteeseen. Huomioitaessa vain T1- ja T2-kasvaimet korkea tenaskiini oli yhteydessä huonontuneeseen ennusteeseen. Tollin kaltaisten reseptorien ja hypoksiamerkkiaineiden välillä ei ollut merkittävää yhteyttä. Tulosten perusteella haimasyövässä on runsaasti Tollin kaltaisia reseptoreita, ja korkea TLR9 on yhteydessä parantuneeseen ennusteeseen. Matala HIF-1alpha on yhteydessä huonoon ennusteeseen. Tenaskiinilla ja fibronektiinilla ei ole vaikutusta potilaiden ennusteeseen.

Abstract Tumor associated macrophages (TAMs) are linked to the invasion of oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC). We modified THP-1 leukemia cells to M1 (inflammatory), M2 (TAM-like) and R848 (imidazoquinoline-treated) type macrophages in order to examine their interactions with OTSCC-cells (HSC-3) by using different kinds of in vitro migration and invasion models. We observed that interaction of TAM-resembling M2-type macrophages with HSC-3 cells induced invasion and migration, whereas the influence of M1 macrophages reduced them. Patient response to chemoradiotherapy is highly reliant on the characteristics such as the aggressiveness and stage of the cancer. Therefore, new methods for treatment testing are needed in order to design personalized therapies. We tested the applicability and consistency of human TME mimicking tissue methods for analyzing the effects of chemoradiation using commercial OTSCC cell lines. Based on our trials, both our human uterine leiomyoma tissue -based matrix models provide viable platforms for future in vitro chemoradiotherapy testing. Conventionally pro-tumorigenic activities of matrix metalloproteinase (MMP)9 have been linked with oral squamous cell carcinoma, but recently its tumor-suppressor role has also been revealed. Our study provides strong evidence that MMP9 also has an anti-invasive effect in OTSCC and is a potential mediator of the protective effects of arresten in tongue cancer cells. / Tiivistelmä Makrofageilla on yhteys kielen levyepiteelikarsinooman invaasioon eli syöpäkasvaimen tunkeutumiseen ympäröivään kudokseen. Tutkimuksessamme muokkasimme ihmisen THP-1 leukemiasoluja kemiallisesti tulehdusreittejä aktivoiviksi M1-makrofageiksi, kasvaimeen liittyvien makrofagien kaltaisiksi M2-makrofageiksi sekä imidatsokinoliini-käsitellyiksi R848-makrofageiksi. Tarkoituksenamme oli tutkia makrofagien ja kielisyöpäsolujen vuorovaikutuksia erilaisilla in vitro migraatio- ja invaasiomalleilla. Anti-inflammatoristen, syövän etenemistä edesauttavien TAM-makrofagien kaltaisiksi erilaistetut M2-tyypin makrofagit lisäsivät HSC-3 kielikarsinoomasolujen invaasiota ja migraatiota, kun taas M1-tyypin makrofagien vaikutus oli päinvastainen. Potilaan vaste kemosädehoitoon riippuu syöpäkasvaimen ominaisuuksista, kuten syöpäsolujen aggressiivisuudesta ja syövän levinneisyysasteesta. Tämän vuoksi on tarve uusille menetelmille, joiden avulla voidaan ottaa huomioon potilaan sekä syöpätyypin yksilölliset ominaisuudet hoitoa suunniteltaessa. Testasimme syöpäkasvaimen mikroympäristöä mallintavien, ihmiskudokseen perustuvien menetelmien käyttökelpoisuutta ja luotettavuutta kemosädehoidon vaikutusten arvioimiseen. Testiemme perusteella myoomakudokseen pohjautuvat menetelmät voivat auttaa kemosädehoidon vaikutusten testauksessa. Matriksin metalloproteinaasi (MMP) 9:n on pitkään uskottu olevan yksinomaan syövän etenemistä edesauttava molekyyli. Viimeaikaisissa tutkimuksissa on myös havaittu, että MMP9:llä voi olla syövältä suojaavia vaikutuksia. Tutkimme MMP9:n vaikutusta kielisyöpäsoluihin ja havaitsimme, että MMP9:llä on myös invaasiota hillitseviä vaikutuksia. Lisäksi MMP9 saattaa toimia verisuonten muodostumista estävän arresten-molekyylin syövältä suojaavien mekanismien välittäjänä.

Abstract The tumor microenvironment (TME) is critically important for tumor development. The microenvironment consists of fibroblasts, endothelial and immune cells as well as extracellular matrix (ECM), proteases and various other soluble factors produced by the cells. It is challenging to develop methods that appropriately mimic the human microenvironment, but this effort is essential in order to reliably elucidate the properties of potential anti-tumor drugs. The aim of this study was to create new 3D organotypic invasion models based on human tissue that would be used to study the effects of the anti-angiogenic molecules arresten and endostatin on tongue squamous carcinoma cells. The classic way to study cancer invasion has been to use a collagen invasion model that is created by mixing rat type I collagen, matrix produced by mouse EHS tumor cells and human fibroblasts. Our research group has developed a novel human myoma tissue based invasion model, which is composed of several different cell types and molecules that are normally present in the human TME. We show how this model is suitable for invasion studies, not only for oral cancer, but for other invasive cell lines as well. There are several matrix-derived fragments that have been shown to possess anti-angiogenic activity. Arresten is a 26 kDa fragment that is cleaved from type IV collagen and is known to inhibit angiogenesis, the formation of new capillaries and tumor growth in vivo. However, its effect on the tumor microenvironment in addition to endothelial cells has not been studied. We show that arresten also directly affects oral cancer cells by decreasing their migration and invasion as well as tumor size, invasion and angiogenesis in in vivo mouse xenografts. Another inhibitor of angiogenesis, endostatin, is cleaved from type XVIII collagen. It has been shown to suppress angiogenesis and tumor growth without toxicity or side effects in mouse models. Our studies show that endostatin directly affects tongue squamous carcinoma cells by reducing their invasion and spreading in organotypic 3D assays and mouse tumor models. In summary, arresten and endostatin are anti-angiogenic as well as anti-invasive molecules and therefore potential cancer drugs. They seem to have a direct effect on carcinoma cells making the cells less invasive. The myoma model allows us to study the effects of anti-cancer molecules with a new prospective. / Tiivistelmä Syövän mikroympäristö on erittäin tärkeä syövän kehittymisen kannalta. Se koostuu fibroblasteista, endoteeli- ja immuunisoluista, soluväliaineesta, proteaaseista ja monista muista solujen tuottamista liukoisista molekyyleistä. On haastavaa kehittää uusia menetelmiä, jotka jäljittelisivät oikeaa ihmisen syövän mikroympäristöä, mutta se on välttämätöntä uusien syöpälääkkeiden tutkimiseksi. Väitöstutkimuksen tavoitteena oli kehittää kolmiulotteinen ihmisen myoomakudokseen perustuvan invaasiomalli, jonka avulla voisimme tutkia verisuonten kasvua estävien arresten ja endostatin molekyylien vaikutusta kielisyöpäsoluihin. Aiemin syövän invaasiota on tutkittu käyttämällä klassista kollageeni-invaasiomallia, joka tehdään sekoittamalla rotan tyypin I kollageeniä, hiiren sarkoomasolujen tuottamaa matriksia ja ihmisen fibroblasteja. Tutkimuksissamme kehitimme uuden invaasiomallin, joka perustuu ihmisen myoomakudokseen. Tutkimuksessa sen todettiin sisältävän monia erilaisia soluja ja molekyylejä, joita on normaalistikkin syövän mikroympäristössä. Lisäksi osoitimme, että se sopii invaasiotutkimuksiin monille syöpätyypeille. Soluvälitilamatriksista pilkotaan useita erilaisia molekyylejä joilla on osoitettu olevan angiogeneesia hillitseviä ominaisuuksia. Arresten on 26 kDa kokoinen polypeptidi, jota pilkotaan tyypin IV kollageenista. Sen tiedetään vähentävän angiogeneesia – uusien verisuonten muodostumista ja syövän kasvua in vivo. Sen vaikutuksia muihin kuin endoteelisoluihin ei ole kuitenkaan tutkittu. Tutkimuksissamme se vaikutti suoraan kielisyöpäsoluihin vähentäen niiden liikkumista ja invaasiota kolmiulotteisissa organotyyppisisssä malleissa ja hiirimallissa. Toinen tutkimamme angiogeneesin inhibiittori on endostatin, jota pilkotaan tyypin XVIII kollageenista. Sen tiedetään vähentävän angiogeneesia hiirimalleissa ilman toksisia sivuvaikutuksia. Me osoitimme tutkimuksissamme, että se vaikuttaa suoraan kielisyöpäsoluihin vähentäen niiden invaasiota ja leviämistä 3D organotyyppisissä malleissa sekä hiirikokeissa. Koska arresten ja endostatin ovat anti-angiogeenisiä ja anti-invasiivisia molekyylejä, ne ovat täten potentiaalisia syöpälääkkeitä. Ne näyttäisivät vaikuttavan suoraan syöpäsoluihin vähentämällä niiden invaasiota. Myoomainvaasiomalli mahdollistaa syöpää ehkäisevien molekyylien tutkimisen uudella ja todenmukaisemmalla tavalla.

Abstract Oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) is the most common cancer of the oral cavity. The 5-year mortality of OTSCC remains at about 50%. The tumor microenvironment (TME) is now recognized as an important factor in cancer progression and metastasis, as well as a tool for prognostication. The aim of this study was to elucidate the roles of TME hypoxia and soluble factors on cancer cell migration and invasion, and the prognostic value of two extracellular matrix (ECM) molecules: tenascin-C (TNC) and fibronectin (FN). Hypoxia was studied using oral squamous cell carcinoma cells in migration and invasion assays. Invasion assays were carried out using a 3D-myoma invasion method. Similarly, the effect of soluble factors as well as ECM alterations were studied using the myoma model: the effect of soluble factors was studied by rinsing the myoma discs prior to experiments, and ECM alterations by lyophilizing and rehydrating. ECM was further studied by analyzing the prognostic value of TNC and FN from OTSCC samples. The effect of hypoxia was shown to be OTSCC cell line dependent: the effect of hypoxia on migration and invasion was increased in aggressive cell lines. Additionally, the response to hypoxia was altered in rinsed tissue. Tissue rinsing media were analyzed and factors affecting cell motility were found. The TME was found to be pivotal for cancer invasion: invasion was impaired in non-neoplastic tissue. Furthermore, changes in the ECM by lyophilization and rehydration led to a change in the invasion mechanism. High expression of stromal TNC and FN were excellent prognosticators in early-stage OTSCC. In conclusion, the present study highlighted the role of various TME components in cancer cell invasion as well as prognostication in OTSCC. Additionally, this study provided feasible tools for more precise diagnosis of early-stage OTSCC. / Tiivistelmä Liikkuvan kielen levyepiteelikarsinooma (OTSCC) on suuontelon yleisin syöpä. Viiden vuoden kuolleisuus OTSCC:an on edelleen noin 50 %. Kasvaimen mikroympäristön (TME) tiedetään nykyään olevan tärkeässä roolissa syövän kehityksessä ja etäpesäkkeiden muodostuksessa, sekä tarjoavan työkaluja ennusteiden laadintaan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää TME:n hypoksian ja liukoisten tekijöiden vaikutusta syöpäsolujen liikkumiseen ja invaasioon ympäröivään kudokseen, sekä tutkia kahden solunulkoisen matriksin (ECM) proteiinin, tenaskiini-C:n (TNC) ja fibronektiinin (FN), vaikutusta OTSCC:n ennusteeseen. Hypoksian vaikutusta tutkittiin käyttäen suun levyepiteelikarsinoomasoluja liikkuvuus- ja invaasiokokeissa. Invaasiokokeissa hyödynnettiin kolmiulotteista ihmisen myoomaan perustuvaa invaasiomallia. Myös liukoisten tekijöiden ja ECM:n muutosten vaikutusten tutkimisessa käytettiin myoomamallia: liukoisten tekijöiden vaikutusta tutkittiin huuhtomalla myoomakiekot ennen niiden käyttämistä, ja ECM:n muutosten vaikutusta kylmäkuivaamalla ja uudelleen nesteyttämällä myoomakiekot. ECM:ia tutkittiin myös analysoimalla TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden merkitystä OTSCC:n ennusteessa. Hypoksian vaikutus osoittautui solulinjariippuvaiseksi: hypoksia lisäsi kielisyöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasiota eniten aggressiivisimmilla solulinjoilla. Lisäksi solujen vaste hypoksialle oli erilainen huuhdotussa kudoksessa. Huuhteluliuos analysoitiin ja siitä löydettiin solujen liikkumiseen vaikuttavia tekijöitä. TME:n havaittiin olevan ratkaisevassa roolissa syöpäsolujen invaasiossa: syöpäsolut eivät kyenneet invasoitumaan lainkaan ei-neoplastiseen kudokseen. Lisäksi muutosten ECM:ssä havaittiin johtavan muutoksiin solujen käyttämässä invaasion mekanismissa. Strooman TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden todettiin olevan erinomaisia ennustekijöitä aikaisen vaiheen OTSCC:ssa. Tiivistettynä voidaan todeta, että tämä tutkimus alleviivasi useiden TME:n komponenttien vaikutusta syövän invaasiolle ja ennusteelle OTSCC:ssä. Lisäksi se tarjoaa käyttökelpoiset työkalut (TNC ja FN) tarkemmalle diagnostiikalle aikaisen vaiheen OTSCC:ssä.

Abstract Desmoglein 3 (Dsg3) is an adhesion receptor in desmosomes, but relatively little is known about its role in cancer. In this study, the function of Dsg3 was investigated in oral squamous cell carcinoma (SCC) cell lines in vitro using locally established human leiomyoma tumor microenvironment (TME) matrices. Since Dsg3 has been identified as a key regulator in cell adhesion, we hypothesized that it may play a role in oral SCC cells adhesion and motility. Thus, one aim of the study was to explore this hypothesis by both gain and loss of function methods in four human buccal mucosa SCC SqCC/Y1 cell lines: transduction of vector control (Ct), full-length (FL) or two different C-terminally truncated Dsg3 mutants (Δ238 and Δ560). Live cell imaging was performed for 2D migration and 3D sandwich, alongside other assays. In 3D sandwich, we tested the effects of the monoclonal antibody, AK23, targeting the extracellular domain of Dsg3 in SqCC/Y1 cells. Our results showed that loss of Dsg3 disrupted cell adhesion and protein expression. In 2D assays, FL and Dsg3 mutants migrated faster with higher accumulated distances than Ct. In contrast with 2D, mutants showed accelerated invasion over the Ct in 3D models. The AK23 antibody inhibited only the invasion of FL cells. The TME in vivo consists of cellular and matrix elements playing a leading role in carcinoma progression. To study carcinoma cells invasion in vitro, mouse Matrigel® and rat type 1 collagen are the most commonly used matrices in 3D models. Since they are non-human in origin, they do not perfectly mimic human TME. To address this, we have developed a solid organotypic myoma disc model derived from human uterus leiomyoma tumor. Here, we introduce a novel Myogel, prepared from leiomyoma similar to Matrigel®. We validated Myogel for cell-TME interactions in 3D models, using SqCC/Y1 and HSC-3 cell lines. Compared with Matrigel® and type I collagen, oral SCC cell lines invaded more efficiently in Myogel containing matrices. This study describes promising 3D models using human TME mimicking Myogel which is suitable to analyze oral SCC cells both in carcinoma monocultures and in co-cultures, such as with TME fibroblasts. We also introduce a possible novel therapeutic target against Dsg3 to suppress cancer cell invasion. / Tiivistelmä Desmogleiini 3 (Dsg3) on desmosomien adheesioreseptori, jonka merkityksestä syövässä tiedetään vähän. Koska Dsg3 on tärkeä epiteelisolujen välisissä liitoksissa, oletimme sillä olevan vaikutusta myös suun karsinoomasolujen tarttumisessa ja niiden liikkuvuudessa. Testasimme hypoteesiamme muuttamalla Dsg3:n toimintaa ihmisen posken karsinoomasolulinjassa SqCC/Y1, josta oli aiemmin valmistettu neljä erilaista muunnosta: tyhjän vektorin sisältävä kontrollisolulinja (Ct), kokopitkää Dsg3 tuottava solulinja (FL), sekä kaksi Dsg3 C-päästä lyhennettyä mutanttisolulinjaa (Δ238 ja Δ560). Immunofluoresenssi-menetelmää käyttäen analysoimme solulinjoissamme solujen välisiä liitoksia. Lisäksi mittasimme solujen liikkeitä 2D-migraatio- ja 3D-sandwich-kokeissa. Testasimme myös Dsg3:n solunulkoista osaa tunnistavan monoklonaalisen vasta-aineen (AK23) vaikutusta solujen invaasioon. Osoitimme, että Dsg3:n rakenteen muuttaminen ja toiminnan estyminen häiritsi solujen tarttumista. 2D-kokeissa sekä FL että mutanttilinjat (Δ238 ja Δ560) migroivat kontrollisoluja nopeammin ja pidemmälle, mutta 3D-kokeissa vain mutanttilinjat invasoituivat kontrollisoluja tehokkaammin. AK23-vasta-aine esti vain FL-solujen invaasiota. Syöpäsolujen 3D-invaasiota mittaavissa kokeissa käytetään yleensä hiiren kasvaimesta valmistettua kaupallista Matrigeeliä® tai rotan kudoksista eristettyä tyypin I kollageenia. Tutkimusryhmämme on jo aiemmin kehittänyt organotyyppisen myoomamallin, jossa valmistamme myoomakudosnapit ihmisen kohdun leiomyoomakasvaimista. Tässä työssä valmistimme leiomyoomasta Myogeelia, vertasimme sitä Matrigeeliin®, sekä tutkimme tarkemmin Myogeeli-valmisteen soveltuvuutta 3D-tutkimuksiin. Totesimme, että kielen (HSC-3) ja posken (SqCC/Y1) karsinoomasolut invasoituivat tehokkaimmin Myogeeli-pitoisissa matrikseissa kuin Matrigeeliä® tai kollageeniä sisältävissä kasvatusalustoissa. Tutkimustulostemme perusteella Myogeeli-pohjaiset 3D-mallit soveltuvat hyvin sekä syöpäsolulinjojen invaasiotutkimuksiin että yhteisviljelmiin, joissa syöpäsoluja viljellään yhdessä syöpäkasvaimen ympärillä olevien solujen, kuten fibroblastien, kanssa.