Natural diseases caused by keratin mutations are rare and have only been reported in humans. We have recently identified a heritable skin disorder in Norfolk terriers caused by a mutation in KRT10. Affected dogs have a tendency to form shallow erosions or blisters following mild trauma, which is first noted after the birthing process. As the dogs age, they display generalized hyperpigmentation and scaling that is most severe in the axillary and inguinal regions. The main histologic and ultrastructural features include: marked hyperkeratosis, epidermal hyperplasia, prominent vacuolation of the upper suprabasal layers, eosinophilic intracytoplasmic aggregates (keratin bundles), numerous and frequently enlarged keratohyaline granules, and epidermal hyperplasia. Analysis of an extended pedigree through seven generations confirmed an autosomal recessive mode of inheritance. The keratin 10 mutation was defined as a G-T point mutation in intron 5 that affected splicing at the boundary of exon 4 and intron 5. The primary outcome of the mutation was a 35 bp deletion in exon 4 caused by use of a cryptic splice site. Real-time PCR quantitation of KRT10 confirmed that this mutation led to premature mRNA decay and an average 35-fold decrease in KRT10 message. Organotypic cell culture techniques were used to establish in vitro models for normal and affected Norfolk terriers. After 21 days of culture, normal epidermis was cornified with a compact and multifocally parakeratotic stratum corneum. Affected epidermis largely reproduced the expected morphologic alterations. Immunoblotting and immunohistochemistry for keratin 10 protein and real-time PCR quantitation of KRT10 message showed significantly less keratin expression in vitro than in vivo suggesting that the differentiation program in vitro underwent significant alterations. A diagnostic PCR assay was established for detection of the carrier state. Global analysis of gene expression between normal, carrier and affected dogs was performed with DermArray cDNA microarrays. Affected and carrier dogs showed differential regulation of 320 and 298 genes, respectively, between normal dogs. In affected dogs, 217 were upregulated and 103 were downregulated. In carrier dogs, 222 were upregulated and 76 were downregulated. 72 genes (65 upregulated, 7 downregulated) were altered in both affected and heterozygous dogs.

Abstract The tumor microenvironment (TME) is critically important for tumor development. The microenvironment consists of fibroblasts, endothelial and immune cells as well as extracellular matrix (ECM), proteases and various other soluble factors produced by the cells. It is challenging to develop methods that appropriately mimic the human microenvironment, but this effort is essential in order to reliably elucidate the properties of potential anti-tumor drugs. The aim of this study was to create new 3D organotypic invasion models based on human tissue that would be used to study the effects of the anti-angiogenic molecules arresten and endostatin on tongue squamous carcinoma cells. The classic way to study cancer invasion has been to use a collagen invasion model that is created by mixing rat type I collagen, matrix produced by mouse EHS tumor cells and human fibroblasts. Our research group has developed a novel human myoma tissue based invasion model, which is composed of several different cell types and molecules that are normally present in the human TME. We show how this model is suitable for invasion studies, not only for oral cancer, but for other invasive cell lines as well. There are several matrix-derived fragments that have been shown to possess anti-angiogenic activity. Arresten is a 26 kDa fragment that is cleaved from type IV collagen and is known to inhibit angiogenesis, the formation of new capillaries and tumor growth in vivo. However, its effect on the tumor microenvironment in addition to endothelial cells has not been studied. We show that arresten also directly affects oral cancer cells by decreasing their migration and invasion as well as tumor size, invasion and angiogenesis in in vivo mouse xenografts. Another inhibitor of angiogenesis, endostatin, is cleaved from type XVIII collagen. It has been shown to suppress angiogenesis and tumor growth without toxicity or side effects in mouse models. Our studies show that endostatin directly affects tongue squamous carcinoma cells by reducing their invasion and spreading in organotypic 3D assays and mouse tumor models. In summary, arresten and endostatin are anti-angiogenic as well as anti-invasive molecules and therefore potential cancer drugs. They seem to have a direct effect on carcinoma cells making the cells less invasive. The myoma model allows us to study the effects of anti-cancer molecules with a new prospective. / Tiivistelmä Syövän mikroympäristö on erittäin tärkeä syövän kehittymisen kannalta. Se koostuu fibroblasteista, endoteeli- ja immuunisoluista, soluväliaineesta, proteaaseista ja monista muista solujen tuottamista liukoisista molekyyleistä. On haastavaa kehittää uusia menetelmiä, jotka jäljittelisivät oikeaa ihmisen syövän mikroympäristöä, mutta se on välttämätöntä uusien syöpälääkkeiden tutkimiseksi. Väitöstutkimuksen tavoitteena oli kehittää kolmiulotteinen ihmisen myoomakudokseen perustuvan invaasiomalli, jonka avulla voisimme tutkia verisuonten kasvua estävien arresten ja endostatin molekyylien vaikutusta kielisyöpäsoluihin. Aiemin syövän invaasiota on tutkittu käyttämällä klassista kollageeni-invaasiomallia, joka tehdään sekoittamalla rotan tyypin I kollageeniä, hiiren sarkoomasolujen tuottamaa matriksia ja ihmisen fibroblasteja. Tutkimuksissamme kehitimme uuden invaasiomallin, joka perustuu ihmisen myoomakudokseen. Tutkimuksessa sen todettiin sisältävän monia erilaisia soluja ja molekyylejä, joita on normaalistikkin syövän mikroympäristössä. Lisäksi osoitimme, että se sopii invaasiotutkimuksiin monille syöpätyypeille. Soluvälitilamatriksista pilkotaan useita erilaisia molekyylejä joilla on osoitettu olevan angiogeneesia hillitseviä ominaisuuksia. Arresten on 26 kDa kokoinen polypeptidi, jota pilkotaan tyypin IV kollageenista. Sen tiedetään vähentävän angiogeneesia – uusien verisuonten muodostumista ja syövän kasvua in vivo. Sen vaikutuksia muihin kuin endoteelisoluihin ei ole kuitenkaan tutkittu. Tutkimuksissamme se vaikutti suoraan kielisyöpäsoluihin vähentäen niiden liikkumista ja invaasiota kolmiulotteisissa organotyyppisisssä malleissa ja hiirimallissa. Toinen tutkimamme angiogeneesin inhibiittori on endostatin, jota pilkotaan tyypin XVIII kollageenista. Sen tiedetään vähentävän angiogeneesia hiirimalleissa ilman toksisia sivuvaikutuksia. Me osoitimme tutkimuksissamme, että se vaikuttaa suoraan kielisyöpäsoluihin vähentäen niiden invaasiota ja leviämistä 3D organotyyppisissä malleissa sekä hiirikokeissa. Koska arresten ja endostatin ovat anti-angiogeenisiä ja anti-invasiivisia molekyylejä, ne ovat täten potentiaalisia syöpälääkkeitä. Ne näyttäisivät vaikuttavan suoraan syöpäsoluihin vähentämällä niiden invaasiota. Myoomainvaasiomalli mahdollistaa syöpää ehkäisevien molekyylien tutkimisen uudella ja todenmukaisemmalla tavalla.

Abstract Oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) is the most common cancer of the oral cavity. The 5-year mortality of OTSCC remains at about 50%. The tumor microenvironment (TME) is now recognized as an important factor in cancer progression and metastasis, as well as a tool for prognostication. The aim of this study was to elucidate the roles of TME hypoxia and soluble factors on cancer cell migration and invasion, and the prognostic value of two extracellular matrix (ECM) molecules: tenascin-C (TNC) and fibronectin (FN). Hypoxia was studied using oral squamous cell carcinoma cells in migration and invasion assays. Invasion assays were carried out using a 3D-myoma invasion method. Similarly, the effect of soluble factors as well as ECM alterations were studied using the myoma model: the effect of soluble factors was studied by rinsing the myoma discs prior to experiments, and ECM alterations by lyophilizing and rehydrating. ECM was further studied by analyzing the prognostic value of TNC and FN from OTSCC samples. The effect of hypoxia was shown to be OTSCC cell line dependent: the effect of hypoxia on migration and invasion was increased in aggressive cell lines. Additionally, the response to hypoxia was altered in rinsed tissue. Tissue rinsing media were analyzed and factors affecting cell motility were found. The TME was found to be pivotal for cancer invasion: invasion was impaired in non-neoplastic tissue. Furthermore, changes in the ECM by lyophilization and rehydration led to a change in the invasion mechanism. High expression of stromal TNC and FN were excellent prognosticators in early-stage OTSCC. In conclusion, the present study highlighted the role of various TME components in cancer cell invasion as well as prognostication in OTSCC. Additionally, this study provided feasible tools for more precise diagnosis of early-stage OTSCC. / Tiivistelmä Liikkuvan kielen levyepiteelikarsinooma (OTSCC) on suuontelon yleisin syöpä. Viiden vuoden kuolleisuus OTSCC:an on edelleen noin 50 %. Kasvaimen mikroympäristön (TME) tiedetään nykyään olevan tärkeässä roolissa syövän kehityksessä ja etäpesäkkeiden muodostuksessa, sekä tarjoavan työkaluja ennusteiden laadintaan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää TME:n hypoksian ja liukoisten tekijöiden vaikutusta syöpäsolujen liikkumiseen ja invaasioon ympäröivään kudokseen, sekä tutkia kahden solunulkoisen matriksin (ECM) proteiinin, tenaskiini-C:n (TNC) ja fibronektiinin (FN), vaikutusta OTSCC:n ennusteeseen. Hypoksian vaikutusta tutkittiin käyttäen suun levyepiteelikarsinoomasoluja liikkuvuus- ja invaasiokokeissa. Invaasiokokeissa hyödynnettiin kolmiulotteista ihmisen myoomaan perustuvaa invaasiomallia. Myös liukoisten tekijöiden ja ECM:n muutosten vaikutusten tutkimisessa käytettiin myoomamallia: liukoisten tekijöiden vaikutusta tutkittiin huuhtomalla myoomakiekot ennen niiden käyttämistä, ja ECM:n muutosten vaikutusta kylmäkuivaamalla ja uudelleen nesteyttämällä myoomakiekot. ECM:ia tutkittiin myös analysoimalla TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden merkitystä OTSCC:n ennusteessa. Hypoksian vaikutus osoittautui solulinjariippuvaiseksi: hypoksia lisäsi kielisyöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasiota eniten aggressiivisimmilla solulinjoilla. Lisäksi solujen vaste hypoksialle oli erilainen huuhdotussa kudoksessa. Huuhteluliuos analysoitiin ja siitä löydettiin solujen liikkumiseen vaikuttavia tekijöitä. TME:n havaittiin olevan ratkaisevassa roolissa syöpäsolujen invaasiossa: syöpäsolut eivät kyenneet invasoitumaan lainkaan ei-neoplastiseen kudokseen. Lisäksi muutosten ECM:ssä havaittiin johtavan muutoksiin solujen käyttämässä invaasion mekanismissa. Strooman TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden todettiin olevan erinomaisia ennustekijöitä aikaisen vaiheen OTSCC:ssa. Tiivistettynä voidaan todeta, että tämä tutkimus alleviivasi useiden TME:n komponenttien vaikutusta syövän invaasiolle ja ennusteelle OTSCC:ssä. Lisäksi se tarjoaa käyttökelpoiset työkalut (TNC ja FN) tarkemmalle diagnostiikalle aikaisen vaiheen OTSCC:ssä.

Abstract Cancer progression is a multistep process dependent on tumour-stroma interactions. Various cell types, such as fibroblasts, endothelial, inflammatory and stem cells, as well as extracellular matrix (ECM) proteins, such as collagens, contribute to the tumour outcome. Tumour growth and invasion is accompanied by the proteolysis of ECM components mediated by various enzymes, such as matrix metalloproteases (MMPs). Proteolytic fragments released into the circulation may reflect cancer progression. The aim of this study was to develop novel in vitro methods for investigating cell invasion and for measuring cancer-associated collagen degradation. Human carcinoma cell invasion studies in vitro are often performed in organotypic cell culture models, mainly composed of rat or mouse ECM proteins. To create a human microenvironment for invasion studies, a novel organotypic model based on human uterine myoma (benign tumour) tissue was developed. Compared to the conventional collagen-based organotypic model, in the myoma model the carcinoma cell invasion depth was about eightfold and the invasion resembled, to a greater degree, the invasion pattern of dissected tissue samples of cancer patients. In addition, the invasion was easily quantified with a novel radioimmunoassay measuring type III collagen degradation products from the organotypic culture media. As human mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the stromal cell types that may affect tumour progression, the mechanisms of stem cell invasion were also studied. On the surface of MSCs, Toll-like receptor 9 (TLR9) functions in immune defence against microbes. The activation of TLR9 with microbial DNA-resembling molecules induced human MSC invasion into the myoma tissue in a MMP-13-mediated fashion. To analyse cancer-associated soft tissue degradation, a novel enzyme immunoassay was developed. This novel assay enabled, for the first time, the measurement of type III collagen degradation products from human serum samples. In head and neck cancer patient sera, high levels of type III and type I collagen degradation products were shown to predict poor survival. In conclusion, the novel myoma model showed that the tumour microenvironment crucially affects carcinoma cell invasion. In addition, cancer-associated type III collagen degradation was successfully measured in cell cultures and in human sera by novel immunoassays. / Tiivistelmä Syövän eteneminen on monivaiheinen tapahtuma, jossa syöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa lähiympäristönsä kanssa. Ympäristön eri solutyypit, kuten kantasolut ja sidekudoksen fibroblastit sekä soluväliaineen proteiinit kuten kollageenit, vaikuttavat syöpäsolujen invaasioon eli tunkeutumiseen ympäröivään kudokseen. Syövän invaasiossa useat entsyymit, mm. matriksin metalloproteaasit (MMP:t), hajottavat soluväliainetta. Kasvaimen kehittymisen aikana verenkiertoon vapautuu soluväliaineen hajoamistuotteita, joiden määrä voi kuvastaa sairauden etenemistä. Väitöstutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia menetelmiä solujen invaasion ja syöpään liittyvän kollageenin hajoamisen tutkimiseen. Ihmisen karsinoomasolujen invaasion tutkimuksessa on perinteisesti käytetty kolmiulotteisia soluviljelymalleja, jotka koostuvat pääasiassa rotan tai hiiren soluväliaineproteiineista. Työssä kehitettiin uusi viljelymalli, jossa soluja kasvatettiin ihmisen hyvälaatuisen kohtukasvainkudospalan eli myooman päällä. Perinteiseen kollageenimalliin verrattuna myoomamallissa karsinoomasolut tunkeutuivat noin kahdeksan kertaa syvemmälle, ja solujen kasvu muistutti enemmän potilaiden syöpäkudosnäytteissä havaittua kasvutapaa. Invaasion voimakkuuden määrittämiseen kehitettiin vasta-aineisiin perustuva menetelmä, jolla mitattiin soluviljelmän kasvatusliuokseen myoomakudoksesta vapautuneiden tyypin III kollageenin hajoamistuotteiden määrää. Koska kantasolujen tiedetään voivan vaikuttaa syöpäkasvaimen leviämiseen, tutkimme myös ihmisen luuytimen kantasolujen invaasiota. Kantasolujen pinnalla TLR9-reseptori osallistuu immuunipuolustukseen mikrobeja vastaan. Kun reseptoria aktivoitiin mikrobi-DNA:ta muistuttavilla molekyyleillä, kantasolut alkoivat invasoitua myoomakudokseen ja MMP-13:n aktiivisuus soluissa lisääntyi. Syöpään liittyvän pehmytkudoksen hajoamisen tutkimiseksi kehitettiin vasta-ainemenetelmä, jolla onnistuttiin ensi kertaa mittaamaan potilaiden seeruminäytteistä tyypin III kollageenin hajoamistuotteita. Pään ja kaulan alueen syöpäpotilailla korkean tyypin III kollageenin hajoamistuotepitoisuuden todettiin liittyvän huonoon ennusteeseen. Tutkimus osoitti, että kasvaimen ympäristö vaikuttaa olennaisesti syöpäsolujen leviämiseen. Syöpään liittyvää tyypin III kollageenin hajoamista pystyttiin työssä kehitetyillä menetelmillä mittaamaan sekä soluviljelmistä että potilaiden seeruminäytteistä.