Abstract Bone marrow mesenchymal stromal cells (MSCs) and mononuclear cells (BM-MNCs) have shown great therapeutic potential in various clinical settings. Although intravascular transplantation of the cells constitutes the optimal delivery route, massive pulmonary entrapment, with the threat of embolization, remains a major obstacle for using this type of therapy. Because pulmonary entrapment is at least partially mediated by adhesion molecules, cell surface modification could enhance pulmonary passage. We used a porcine model of allogeneic MSC and autologous BM-MNC transplantation and radionuclide labelling to track the cells. The role of the transplantation route on lung entrapment, biodistribution, safety and BM-MNC targeting to the injured brain was studied. Effects of pronase detachment on the lung passage of MSCs were studied in porcine and murine models; a rat model of acute limb injury was used to further evaluate tissue targeting. Treatment with pronase to detach cell surface molecules and the effect on stem cell potential was assessed in vitro. Intra-arterial administration of MSCs diminishes their lung deposition; intravascular transplantation did not cause pulmonary embolisms. Intra-arterially transplanted BM-MNCs did not reach the brain in significant numbers. Transient proteolytic modification of MSCs with pronase decreased lung accumulation and tissue targeting without affecting their therapeutic characteristics. Intra-arterial transplantation increases lung passage of MSCs. Although thromboembolic events were not observed, further studies are warranted to ensure the safety of this route of MSC delivery. Pronase detachment is a promising method to enhance the potential of systemic MSC therapies. / Tiivistelmä Luutytimen mesenkymaaliset kantasolut (MSC) ja mononukleaariset solut (BM-MNC) ovat osoittautuneet tehokkaiksi useissa kliinisissä käyttöaiheissa. Solujen systeeminen annostelu verenkiertoon olisi käytännön kannalta paras soluterapian toteutukseen, mutta solujen merkittävä taipumus jäädä keuhkoihin loukkuun ja veritulppariski muodostavat haasteen. Keuhkohakeutumisen tiedetään ainakin osin johtuvan solujen pintamolekyyleistä ja näiden muokkaaminen voisi parantaa solujen keuhkoläpäisevyyttä. Tutkimuksessa käytettiin koe-eläimenä sikaa, jolle istutettiin systeemisesti allogeenisia mesenkymaalisia kantasoluja tai autologisia luuytimen mononukleaarisia soluja; solujen kudoshakeutumisen seuranta toteutettiin isotooppileimauksella- ja kuvannuksella. Tutkimuksessa arvioitiin annostelureitin vaikutusta keuhkoläpäisevyyteen, solujen kudojakautumista, toimenpiteen turvallisuutta sekä mononukleaarisolujen hakeutumista vaurioituneeseen aivokudokseen. Pronaasikäsittelyn vaikutusta mesenkymaalisten kantasolujen keuhkoläpäisevyyteen arvioitiin sika- ja hiirimallissa; rotan raajavauriomallia käytettiin lisäksi pronaasin kudoshakeutumisvaikutusten arvioimiseen. Pronaasikäsittelyn vaikutuksia solujen pintarakenteisiin ja toiminnallisuuteen arvioitiin in vitro- kokeissa. Mesenkyymalisten kantasolujen annostelu valtimonsisäisesti paransi solujen keuhkoläpäisevyyttä; tutkimuksissa käytetyt solut eivät aiheuttaneet keuhkoveritulppia. Valtimonsisäisesti annostellut mononukleaarisolut eivät hakeutuneet vaurioituneeseen aivokudokseen sikamallissa. Pronaasikäsittely muovasi solujen pintaproteiineja palautuvasti ja tämä lisäsi huomattavasti mesenkymaalisten kantasolujen keuhkoläpäisevyyttä ja kudoshakeutumista vaikuttamatta solujen toiminnallisuuteen. Mesenkymaalisten kantasolujen annostelu valtimonsisäisesti voi parantaa solujen keuhkoläpäisevyyttä. Tutkimuksessa ei todettu keuhkoveritulppaa tai muita tromboembolisia tapahtumia, mutta lisätutkimuksia tarvitaan MSC- terapian turvallisuuden takaamiseksi. Pronaasikäsittelyn tulokset mesenkymaalisten kantasolujen systeemisen annostelun parantamisessa olivat lupaavia.

Abstract Cancer is a major global killer and a challenge for the healthcare worldwide. Earlier cancer has been treated with surgery, radiation, chemotherapy and hormonal therapy. Unfortunately the efficiency of these therapies has shown to be limited and this has raised an enthusiasm for development of new, targeted cancer therapies that are based on activated oncogenes. The challenge of the targeted therapies is therapy resistance, de novo, adaptive and acquired. This work investigated targeted therapy sensitivity and resistance in lung cancer, breast cancer, colorectal cancer, and melanoma cell lines. The results of this study indicate that in some non-small cell lung cancer cell lines, dual PI3K and MEK inhibition is a more efficacious treatment than inhibition of either solely. It was also showed that the maximal effect of the dual inhibition can be achieved with alternative dosing schedules that are potentially more tolerable in clinical use. Furthermore, by combining ABT-263, entinostat or dasatinib to the dual PI3K and MEK inhibition, the efficiency of the therapy can be increased. Bcl-xl downregulation is a major determinant of the apoptotic response to the triple inhibitor treatment. The current work showed that cancer stem cells can mediate resistance to targeted therapies. Since these cells follow the stochastic model, concurrent therapy with a targeted agent and a stem cell targeting drug might be needed for maximal therapeutic efficiency. This study also showed that Gö6976 acts as a potent inhibitor of mutant EGFR despite the presence of T790M, the most important mechanism of acquired resistance for EGFR tyrosine kinase inhibitors in lung cancer, both in vitro and in vivo. / Tiivistelmä Syöpä on yksi johtavia kuolemanaiheuttajia ja tauti on maailmanlaajuinen haaste terveydenhuollolle. Perinteiset syöpähoidot käsittävät kirurgian, sädehoidon, kemoterapian ja hormonaalisen hoidon, mutta näiden rinnalle on noussut uusia, aktivoituneiden onkogeenien signaalien estoon perustuvia hoitoja. Tämä työ tutki kohdennettuja syöpähoitoja ja näihin hoitoihin liittyvää resistenssiä keuhko-, rinta- ja paksusuolen syövän sekä melanooman solulinjoissa. Tulokset osoittavat, että joissakin ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjoissa yhdistetty PI3K- ja MEK-esto aiheuttaa tehokkaamman vasteen kuin kummankaan signaalireitin esto yksistään. Tässä työssä näytettiin myös, että maksimaalinen vaste yhdistetylle PI3K- ja MEK-estolle voidaan saavuttaa vaihtoehtoisilla annostelutavoilla, jotka ovat voisivat olla paremmin siedettyjä kliinisessä käytössä kuin kahden lääkkeen jatkuva annostelu. Tämä tutkimus osoitti lisäksi, että kaksoiseston tehokkuutta voidaan lisätä yhdistämällä hoitoon kolmas lääkeaine, ABT-263, entinostaatti tai dasatinibi. Bcl-xl proteiinilla on keskeinen rooli apoptoottisen vasteen määrittäjänä näille kolmen lääkkeen käsittelyille. Tämä työ osoitti, että syövän kantasolut voivat välittää resistenssiä kohdennetuille syöpähoidoille. Nämä solut noudattavat niin kutsuttua stokastista mallia, joten parhaan vasteen saaminen saattaa edellyttää että hoito kohdentuu sekä erilaistuneisiin että kantasolutyyppisiin syöpäsoluihin. Tässä tutkimuksessa osoitettin lisäksi, että Gö6976 toimii mutatoituneen EGFR:n estäjänä, huolimatta kehittyvää keuhkosyövissä resistenssiä välittävästä T90M mutaatiosta, sekä in vitro -että in vivo -malleissa.

Abstract Cancer treatments have remarkably improved over the past years since targeted therapies and immunotherapy have been introduced to the field of oncology. The benefit of these new therapies is often limited, however, by de novo or acquired therapy resistances, which should be noticed when making clinical decisions. In this current work, we studied the prognostic and predictive values of several immunological markers in metastatic HER2-positive breast cancer treated with trastuzumab, because trastuzumab is still given to patients according to the HER2 status only, without certainty of tumor response. We also determined the role of HER2 and HER3 for cancer stem cells (CSC) in ALK translocated non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines since the CSCs are causing therapy resistance and cancer recurrence. The results demonstrated that a high number of cytotoxic T cells, together with a high number of M1-like macrophages in the center of the tumor (CT), are promising and independent prognostic factors in HER2-positive breast cancer. These markers together also can predict the progression of the disease and the length of trastuzumab discontinuation in tumor response. Expression of HER2 and HER3 increased the stem-like properties of ALK translocated NSCLC cells, which were decreased when the expressions were downregulated. HER2-HER3-dependent CSCs also mediated the ALK therapy resistance. In conclusion, this study suggests that patients with a favorable immunological tumor profile (high number of cytotoxic T cells and M1-like macrophages in the CT) could be treated in a less-intensive manner, that trastuzumab discontinuation could be feasible for these patients, and that targeting of HER2 and HER3 receptors can lead to more effective killing of cancer stem-like cells and should be further studied. / Tiivistelmä Syöpähoidot ovat kehittyneet huomattavasti, kun kohdennetut hoidot ja immunologiset hoidot ovat tulleet perinteisten hoitojen rinnalle. Usein näiden hoitojen hyötyä kuitenkin rajoittaa jo olemassa oleva lääkeresistenssi tai sen kehittyminen, mikä tulisi ottaa huomioon hoitoja suunniteltaessa. Tässä työssä tutkittiin immunologisia merkkiaineita, joilla voitaisiin ennustaa trastutsumabi-hoidon vastetta sekä potilaiden ennustetta levinneessä HER2-positiivisessa rintasyövässä. Tällä hetkellä trastutsumabi-hoitopäätös tehdään pelkän HER2-geenimonistuman mukaan ilman varmuutta siitä, hyötyykö potilas oikeasti hoidosta. Lisäksi tutkimme HER2- ja HER3-reseptorien merkitystä syövän kantasoluille ALK-translokoituneessa ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä (NSCLC), sillä syövän kantasolut ovat yksi merkittävimmistä tekijöistä lääkeresistenssin kehittymisessä ja syövän uusiutumisessa. Työssä havaittiin, että kasvaimen keskellä oleva suuri määrä sytotoksisia T-soluja sekä M1-tyypin makrofageja on yhteydessä potilaiden parempaan ennusteeseen ja että kyseiset merkkiaineet ovat toisistaan riippumattomia. Merkkiaineet pystyivät ennustamaan myös taudin etenemistä sekä trastutsumabi-hoitokeskeytyksen pituutta. HER2- ja HER3-proteiinien tuotto lisäsi ALK-translokoituneiden NSCLC-solujen kantasolumaisia ominaisuuksia, jotka puolestaan vähenivät, kun proteiinien tuotto estettiin. Lisäksi HER2-HER3 -riippuvaiset syövän kantasolut säätelivät lääkeresistenssiä kyseisessä taudissa. Työn tulokset viittaavat siihen, että potilaita, joilla on suotuisa kasvaimen immunoprofiili (suuri määrä sytotoksisia T-soluja ja M1-tyypin makrofageja kasvaimen keskellä) pystyttäisiin hoitamaan keveimmillä hoidoilla ja HER2-hoitokeskeytys voisi olla mahdollinen näillä potilailla. Lisäksi työ korostaa HER2- ja HER3-reseptorien kohdentamista syövän kantasolumaisten solujen tehokkaamman tuhoamisen saavuttamiseksi. / Huomautus/Notice Painetussa virheelliset ISBN -tunnukset: ISBN (print) 978-952-42-2343-8 pitäisi olla 978-952-62-2343-8. ISBN (PDF) 978-952-42-2344-5 pitäisi olla 978-952-62-2344-5. Printed version has incorrect ISBNs: ISBN (print) 978-952-42-2343-8 it should be 978-952-62-2343-8. ISBN (PDF) 978-952-42-2344-5 it should be 978-952-62-2344-5.

Abstract Bone tissue engineering has become a rapidly expanding research area because it offers a promising new approach for bone repair and regeneration. Compared to traditional autograft and allograft procedures, bone tissue engineering techniques based on the use of scaffolding materials in combination with autogenous stem cells can eliminate problems of donor site morbidity associated with the harvest of bone tissue, and its short supply. Clearly, the choices of material as well as a scaffold design that enhance bone regeneration are major challenges in the tissue engineering approach. Fibers in the micro-range in combination with textile-based technologies are consider as potential routes for the production of complex scaffolds since they can be used to generate a wide range of morphological structures and geometrically varied structures with high precision. Therefore in this thesis the specific objects were to: (i) develop a biocompatible composite fiber from poly(lactic acid) (PLA) and hydroxyapatite (HA) by melt spinning, (ii) design a 3D textile scaffold utilizing weaving and (iii) evaluate the scaffolds’ performance as a bone substitute material in vitro. In the present study PLA/HA composite fibers were successfully produced, and found to possess sufficient mechanical strength even at high loading concentrations (i.e. 20wt %), to be useful in a textile process. In addition, the material was shown to be biocompatible and the presence of HA in the PLA composite significantly enhanced the initial cell attachment. In a 3D woven scaffold, bone marrow derived human mesenchymal stem cells (hMSCs) differentiated into osteoblasts and mineralized bone formation in vitro was observed through-the-thickness of the scaffold. Taken together, these results indicate the potential feasibility of PLA/HA composite fiber in a 3D woven scaffold for use as a bone substitute material in tissue engineering applications. / Tiivistelmä Luupuutosten korvaaminen kudosteknologisesti on kehittynyt nopeasti ja tutkimustulokset tarjoavat lupaavia mahdollisuuksia tuottaa uutta luuta luupuutosalueelle. Perinteisiin potilaan omasta luusta tehtyihin luusiirteisiin ja pankkiluusiirteisiin verrattuna potilaan omat kantasolut voivat vähentää ongelmia, joita ovat siirremateriaalin rajallinen saatavuus ja vieraan kudoksen aiheuttamat reaktiot. On tärkeä etsiä hyviä materiaaleja, joista voidaan valmistaa sellaisia kolmiulotteisia (3D) rakenteita, joilla tehostetaan luun paranemista ja uuden luun muodostumista. Kutomalla tuotetut tukirakenteet mahdollistavat kantasolusiirteille kolmiulotteisuuden, jota voidaan säädellä monipuolisesti ja tarkasti. Tämän väitöstutkimuksen tarkoituksena oli: (i) kehittää bioyhteensopiva kuitu maitohappopolymeeristä poly lactic acid (PLA) ja hydroksiapatiitista (HA) kuituekstruusiolla, (ii) suunnitella ja kutoa tästä kuidusta 3D tekstiilirakenne, ja (iii) tutkia sen toimivuus ja ominaisuudet luunmuodostusta tukevana materiaalina soluviljelyolosuhteissa. Tämä tutkimus osoittaa, että PLA kuitua voidaan seostaa hydroksiapatiitilla, ja PLA/HA kuidut ovat mekaanisesti kestäviä sisältäessään jopa 20 painoprosenttia hydroksiapatiittia. Siten kuidut ovat tekstiilin valmistuksessa käyttökelpoisia. Lisäksi materiaali osoittautui bioyhteensopivaksi, ja hydroksiapatiitti paransi solujen tarttumista PLA kuituun viljelyn alkuvaiheessa. Ihmisen luuytimestä peräisin olevat sidekudoksen kantasolut (hMSCs) erilaistuivat soluviljelmässä luuta muodostaviksi soluiksi eli osteoblasteiksi, ja tuottivat mineralisoitunutta luun väliainetta kautta koko kudotun tukirakenteen. Johtopäätöksenä on, että PLA/HA yhdistelmäkuitua voidaan kutoa kolmiulotteiseksi tukirakenteeksi, ja sitä on mahdollista käyttää apuna korvattaessa luupuutoksia kudosteknologian keinoin.

Abstract Stem cell therapy has several mechanisms for repairing damaged myocardium and improving functional capacity of the left ventricle reduced by myocardial infarction. Despite the increase in scientific data, details of these mechanisms are still partly unexplained. The optimal number and type of stem cells as well as timing and route of transplantation are unclear. The purpose of this study was to clarify therapeutic potential of bone marrow-derived stem cells (BM-MNCs) using experimental porcine acute myocardial infarction model. Myocardial infarction was caused by occluding the circumflex coronary artery for 90 minutes. Immediately after reperfusion BM-MNCs were injected directly into the damaged myocardium or by angioplastic catheter into the infarct-related coronary artery. Left ventricular ejection fraction (LVEF) improved 3 weeks after infarction in animals that received BM-MNCs intramyocardially whereas in animals that received intracoronary transplantation or saline LVEF failed to recover. Radionuclide imaging and histological analysis showed intramyocardially transplanted cells remaining in the infarcted myocardium, whereas after intracoronary transplantation a major fraction of cells flushed into the lungs. In histological analysis minor fraction of BM-MNCs showed differentiation towards myocyte form and proliferation. Significantly lower collagen density and higher levels of smooth muscle actin and skeletal muscle actin were detected in the infarcted myocardium after intramyocardial or intracoronary BM-MNC transplantation compared with animals that received saline. Proteomic screening indicated that mitochondrial energy metabolism recovered after BM-MNC transplantation. Additionally, two proteins showed elevated levels after BM-MNC transplantation, which indicates that they are actively involved in the pathological mechanisms. BM-MNCs appear to enhance recovery of the infarcted myocardium by restoring the reduced LVEF after infarction. Intramyocardial stem cell therapy showed best results in recovery. Stem cell therapy moulds the infarct scar by reducing collagen density and by increasing components typical for muscle cells. The effects of stem cell therapy are mainly paracrine. / Tiivistelmä Kantasoluterapian on havaittu korjaavan infarktissa vaurioitunutta sydänlihasta toimintakykyisemmäksi usealla mekanismilla sekä parantavan sydänlihaksen pumppaustoimintaa. Huolimatta lisääntyneestä tutkimustiedosta näiden monimutkaisten mekanismien yksityiskohdat ovat edelleen paljolti selvittämättä. Samoin käytettävien kantasolujen tyypin, määrän, siirtotekniikan ja siirron ajoituksen optimointi on vielä epäselvää. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää kokeellista sian infarktimallia käyttäen luuytimen kantasolujen kykyä tehostaa vaurioituneen sydänlihaksen toipumista akuutin infarktin jälkeen. Mallissa aiheutettiin sydäninfarkti sulkemalla vasemman sepelvaltimon kiertävähaara 90 minuutiksi. Välittömästi verenkierron uudelleen avaamisen jälkeen luuytimen soluja ruiskutettiin infarktialueelle joko suoraan sydänlihakseen tai sepelvaltimoon. Kolmen viikon kuluttua infarktista kantasoluja suoraan sydänlihakseen saaneiden eläinten vasemman kammion ejektiofraktio (LVEF) parani tilastollisesti merkitsevästi verrattuna kantasoluja sepelvaltimoon saaneisiin eläimiin ja keittosuolaa saaneisiin eläimiin, joiden LVEF pysyi infarktin jälkeisellä alentuneella tasolla. Isotooppitutkimus ja histologinen analyysi osoittivat, että suoraan sydänlihakseen ruiskutetuista kantasoluista valtaosa säilyy infarktialueella kun taas sepelvaltimoon siirretyt solut pääasiassa ajautuvat keuhkoihin. Histologisessa analyysissa sydänlihakseen ruiskutettujen solujen todettiin vähäisessä määrin erilaistuvan lihassolujen suuntaan ja jakautuvan. Kantasoluja saaneiden eläinten ryhmissä todettiin infarktialueella merkitsevästi alhaisempi kollageenipitoisuus sekä enemmän sileälihassolujen aktiinia ja poikkijuovaisten lihassolujen aktiinia kuin keittosuolaa saaneilla eläimillä. Proteomiikka-analyysin tulokset viittaavat kantasoluterapian saaneilla eläimillä mitokondrioiden energiatalouden tehostumiseen. Lisäksi esille tuli kaksi kantasoluterapian jälkeen aktiivista proteiinia, joilla todennäköisesti on keskeinen tehtävä infarktin patogeneesissä. Tutkimuksen perusteella luuytimen kantasolut tehostavat sydänlihaksen toipumista infarktista palauttamalla sydämen alentunutta pumppaustehoa. Suoraan sydänlihakseen annettu kantasoluterapia vaikuttaa tehokkaimmalta menetelmältä. Kantasoluterapia muovaa infarktiarpea vähentämällä kollageenin ja lisäämällä lihassoluille tyypillisten komponenttien määrää. Kantasoluterapian vaikutukset ovat pääasiassa parakriinisiä.

Abstract Cancer progression is a multistep process dependent on tumour-stroma interactions. Various cell types, such as fibroblasts, endothelial, inflammatory and stem cells, as well as extracellular matrix (ECM) proteins, such as collagens, contribute to the tumour outcome. Tumour growth and invasion is accompanied by the proteolysis of ECM components mediated by various enzymes, such as matrix metalloproteases (MMPs). Proteolytic fragments released into the circulation may reflect cancer progression. The aim of this study was to develop novel in vitro methods for investigating cell invasion and for measuring cancer-associated collagen degradation. Human carcinoma cell invasion studies in vitro are often performed in organotypic cell culture models, mainly composed of rat or mouse ECM proteins. To create a human microenvironment for invasion studies, a novel organotypic model based on human uterine myoma (benign tumour) tissue was developed. Compared to the conventional collagen-based organotypic model, in the myoma model the carcinoma cell invasion depth was about eightfold and the invasion resembled, to a greater degree, the invasion pattern of dissected tissue samples of cancer patients. In addition, the invasion was easily quantified with a novel radioimmunoassay measuring type III collagen degradation products from the organotypic culture media. As human mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the stromal cell types that may affect tumour progression, the mechanisms of stem cell invasion were also studied. On the surface of MSCs, Toll-like receptor 9 (TLR9) functions in immune defence against microbes. The activation of TLR9 with microbial DNA-resembling molecules induced human MSC invasion into the myoma tissue in a MMP-13-mediated fashion. To analyse cancer-associated soft tissue degradation, a novel enzyme immunoassay was developed. This novel assay enabled, for the first time, the measurement of type III collagen degradation products from human serum samples. In head and neck cancer patient sera, high levels of type III and type I collagen degradation products were shown to predict poor survival. In conclusion, the novel myoma model showed that the tumour microenvironment crucially affects carcinoma cell invasion. In addition, cancer-associated type III collagen degradation was successfully measured in cell cultures and in human sera by novel immunoassays. / Tiivistelmä Syövän eteneminen on monivaiheinen tapahtuma, jossa syöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa lähiympäristönsä kanssa. Ympäristön eri solutyypit, kuten kantasolut ja sidekudoksen fibroblastit sekä soluväliaineen proteiinit kuten kollageenit, vaikuttavat syöpäsolujen invaasioon eli tunkeutumiseen ympäröivään kudokseen. Syövän invaasiossa useat entsyymit, mm. matriksin metalloproteaasit (MMP:t), hajottavat soluväliainetta. Kasvaimen kehittymisen aikana verenkiertoon vapautuu soluväliaineen hajoamistuotteita, joiden määrä voi kuvastaa sairauden etenemistä. Väitöstutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia menetelmiä solujen invaasion ja syöpään liittyvän kollageenin hajoamisen tutkimiseen. Ihmisen karsinoomasolujen invaasion tutkimuksessa on perinteisesti käytetty kolmiulotteisia soluviljelymalleja, jotka koostuvat pääasiassa rotan tai hiiren soluväliaineproteiineista. Työssä kehitettiin uusi viljelymalli, jossa soluja kasvatettiin ihmisen hyvälaatuisen kohtukasvainkudospalan eli myooman päällä. Perinteiseen kollageenimalliin verrattuna myoomamallissa karsinoomasolut tunkeutuivat noin kahdeksan kertaa syvemmälle, ja solujen kasvu muistutti enemmän potilaiden syöpäkudosnäytteissä havaittua kasvutapaa. Invaasion voimakkuuden määrittämiseen kehitettiin vasta-aineisiin perustuva menetelmä, jolla mitattiin soluviljelmän kasvatusliuokseen myoomakudoksesta vapautuneiden tyypin III kollageenin hajoamistuotteiden määrää. Koska kantasolujen tiedetään voivan vaikuttaa syöpäkasvaimen leviämiseen, tutkimme myös ihmisen luuytimen kantasolujen invaasiota. Kantasolujen pinnalla TLR9-reseptori osallistuu immuunipuolustukseen mikrobeja vastaan. Kun reseptoria aktivoitiin mikrobi-DNA:ta muistuttavilla molekyyleillä, kantasolut alkoivat invasoitua myoomakudokseen ja MMP-13:n aktiivisuus soluissa lisääntyi. Syöpään liittyvän pehmytkudoksen hajoamisen tutkimiseksi kehitettiin vasta-ainemenetelmä, jolla onnistuttiin ensi kertaa mittaamaan potilaiden seeruminäytteistä tyypin III kollageenin hajoamistuotteita. Pään ja kaulan alueen syöpäpotilailla korkean tyypin III kollageenin hajoamistuotepitoisuuden todettiin liittyvän huonoon ennusteeseen. Tutkimus osoitti, että kasvaimen ympäristö vaikuttaa olennaisesti syöpäsolujen leviämiseen. Syöpään liittyvää tyypin III kollageenin hajoamista pystyttiin työssä kehitetyillä menetelmillä mittaamaan sekä soluviljelmistä että potilaiden seeruminäytteistä.

Abstract Wnt4, a member of the Wnt family of secreted factors, is essential for kidney organogenesis since the kidney fails to develop in its absence. Besides the kidney, Wnt4 signaling is involved in the control of development of several other organs such as the gonads, adrenal glands and pituitary gland. In the context of the embryonic kidney, Wnt4 signaling induces mesenchymal to epithelial transition of the progenitor cells in the metanephric mesenchyme, an early step in nephrogenesis. Wnt4 signaling may also be relevant in the development of a childhood kidney tumor, the Wilms’ tumor, that involves the function of Wilms’ tumor suppressor protein 1 (WT1). Wilms’ tumor is thought to arise from the early metanephric mesenchymal cells of the embryonic kidney, but the detailed mechanisms are not known. The main aim of this project was to study the mechanisms that regulate expression of the Wnt4 gene by using immortalized embryonic kidney mesenchyme-derived mK4 cells as a model. The Wnt4 gene expression was also analyzed in vivo in the frog embryonic pronephros. Through the use of reporter assays and a two-hybrid screen, Sox11, a member of the SoxC family of transcription factors, was identified as a synergistic protein that interacts with WT1. Immunoprecipitation studies provided further evidence that Sox11 and WT1 may physically interact with each other in the developing embryonic kidney. Indeed, Sox11 and WT1 may regulate the Wnt4 gene expression in vivo since the morpholino-based knock-down of either WT1 or Sox11 led to notable downregulation of the Wnt4 gene expression in the frog embryonic pronephros. The other general aim of this thesis was to develop novel tissue targeting and therapy tools to the cell lineages regulated by the Wnt4 signals, including the podocytes. For this purpose, we utilized mice carrying a floxed expression cassette for the avidin-LDL receptor fusion protein, Lodavin, in the constitutively active Rosa-26 locus. Three Cre driver mice, including the Wnt4-Cre knock-in line, were used to activate Lodavin expression in the respective cells of the embryonic kidney. Moreover, we generated a podocyte injury model by expressing the human receptor for diphtheria toxin specifically in the podocytes. This was achieved by crossing mice containing a floxed expression cassette for this receptor in the Rosa-26 locus with those expressing the Cre recombinase under the nephrin promoter. Administration of diphtheria toxin led initially to podocyte damage only, followed by a progression to glomerular sclerosis. As a summary, Sox11 and WT1 serve as synergistic transcription factors that may regulate expression of the Wnt4 gene in vivo. The transgenic mouse models generated and used provide the basis to generate acute and chronic kidney disease models and the potential to purify the respective cells for developing cell-based therapy avenues for the kidney. Moreover, the Lodavin-based approaches may enable targeted delivery of biotinylated small compounds, proteins, viruses or even cells and novel means for in vivo imaging and functional studies. / Tiivistelmä Wnt-4 kuuluu signaloivien proteiinien Wnt-perheeseen ja sen toiminta on välttämätöntä munuaisen kehityksessä. Ilman Wnt-4 proteiinia munuainen ei kehity. Munuaisen lisäksi Wnt4-signalointi on mukana useiden muiden elinten, kuten sukurauhasten, lisämunuaisen ja aivolisäkkeen säätelyssä. Alkion munuaisessa Wnt4-signalointi saa aikaan mesenkymaalisen kantasolukon epitelisoitumisen, edustaen näin ollen nefronin kehityksen varhaisia vaiheita. Wnt4-signaloinnilla on myös merkittävä asema lapsuusiän munuaiskasvaimen, niin kutsutun Wilmsin kasvaimen kehittymisessä. Tämän tyyppisessä kasvaimessa keskeisenä on Wilmsin tuumoriproteiinin WT1:n toiminta, mutta myös Wnt4:n toiminnalla voi olla merkitystä. Wilmsin kasvaimen arvellaan saavan alkunsa varhaisista sikiöaikaisista jälkimunuaisen soluista, mutta yksityiskohtaisia mekanismeja ei vielä tunneta. Tämän projektin tarkoituksena oli tutkia Wnt4-geenin ilmentymistä sääteleviä mekanismeja käyttäen mallina mK4-soluja eli alkion munuaisesta saatuja, immortalisoituja soluja. Wnt4-geenin ilmentymistä analysoitiin myös in vivo sammakon alkion alkumunuaisessa. Tuplahybridi-analysoinnin avulla tunnistettiin transkriptiotekijäperhe SoxC:n jäsen Sox11 samantoimiseksi proteiiniksi transkriptiotekijä WT1:n kanssa Wnt4-geenin ilmentymisen säätelyssä. Immunopresipitaatiotutkimukset tukivat ajatusta, että Sox11 ja WT1 voisivat olla fyysisessä vuorovaikutuksessa säädellessään nefroninmuodostuksen alullepanossa ratkaisevan Wnt4-geenin ilmentymistä. Sox11 ja WT1 voivat mahdollisesti säädellä Wnt4-geenin ilmentymistä myös in vivo, sillä morfoliineihin perustuvissa kokeissa sekä WT1:n että Sox11:n hiljennys laski Wnt4-geenin ilmentymistasoa sammakon alkumunuaisessa. Tämän väitöstutkimuksen toinen yleinen tavoite oli kehittää uusia kudoskohdennus- ja terapiakeinoja Wnt4-signaloinnin säätelemille solulinjoille, kuten podosyyteille. Tätä tarkoitusta varten kloonattiin siirtogeeninen hiiri, jossa floksattu avidiini-LDL -reseptorifuusioproteiini, Lodavin, kohdennettiin jatkuvasti aktiiviseen Rosa-26 -lokukseen. Kolmea eri Cre-hiirilinjaa käytettiin aktivoimaan Lodavinin ilmentyminen kussakin tietyssä alkion munuaisen solupopulaatiossa. Yksi näistä Cre-linjoista oli Wnt4-Cre. Jotta kyettäisiin vahingoittamaan samoja soluja, jotka ilmentävät Lodavinia, hyödynnettiin difteriamyrkyn ihmisen reseptoria (iDTR). IDTR:n ilmentäminen tietyissä hiiren soluissa tekee ne alttiiksi tappavalle difteriamyrkylle. IDTR-perusteisen munuaisvauriomallin kehittämiseksi käytettiin floksattua iDTR-hiirimallia, ja geenin ilmentyminen aktivoitiin Wnt4-indusoiduissa munuaissolulinjoissa, erityisesti podosyyteissä Nephrin Cre -välitteisesti. NephrinCre;R26RiDTR hiiriä altistettiin difteriamyrkylle ja niiden munuaiskerästen muutoksia seurattiin. Tutkimukset antavat viitteitä siitä, että R26R-floksatut iDTR-hiiret toimivat hyvänä mallina kehitettäessä sekä akuutteja että kroonisia munuaistautimalleja. Yhteenvetona voidaan todeta, että Sox-11 ja WT-1 ovat samantoimisia transkriptiotekijöitä, jotka voivat säädellä Wnt4-geenin ilmentymistä in vivo. Tutkimuksessa kehitetyt ja käytetyt siirtogeeniset hiirimallit tarjoavat perustan kehittää sekä akuutteja että kroonisia munuaistautimalleja. Samalla ne mahdollistavat kulloistenkin solujen eristämisen uusien soluperusteisten hoitomenetelmien kehittelemiseksi. Lisäksi Lodavin-perusteiset lähestymistavat voivat mahdollistaa biotinyloitujen pienten yhdisteiden, proteiinien, virusten tai jopa solujen kuljetuksen kohdennetusti sekä avata uusia mahdollisuuksia in vivo -kuvantamiselle ja toiminnallisille tutkimuksille.