Abstract Cancer is a major global killer and a challenge for the healthcare worldwide. Earlier cancer has been treated with surgery, radiation, chemotherapy and hormonal therapy. Unfortunately the efficiency of these therapies has shown to be limited and this has raised an enthusiasm for development of new, targeted cancer therapies that are based on activated oncogenes. The challenge of the targeted therapies is therapy resistance, de novo, adaptive and acquired. This work investigated targeted therapy sensitivity and resistance in lung cancer, breast cancer, colorectal cancer, and melanoma cell lines. The results of this study indicate that in some non-small cell lung cancer cell lines, dual PI3K and MEK inhibition is a more efficacious treatment than inhibition of either solely. It was also showed that the maximal effect of the dual inhibition can be achieved with alternative dosing schedules that are potentially more tolerable in clinical use. Furthermore, by combining ABT-263, entinostat or dasatinib to the dual PI3K and MEK inhibition, the efficiency of the therapy can be increased. Bcl-xl downregulation is a major determinant of the apoptotic response to the triple inhibitor treatment. The current work showed that cancer stem cells can mediate resistance to targeted therapies. Since these cells follow the stochastic model, concurrent therapy with a targeted agent and a stem cell targeting drug might be needed for maximal therapeutic efficiency. This study also showed that Gö6976 acts as a potent inhibitor of mutant EGFR despite the presence of T790M, the most important mechanism of acquired resistance for EGFR tyrosine kinase inhibitors in lung cancer, both in vitro and in vivo. / Tiivistelmä Syöpä on yksi johtavia kuolemanaiheuttajia ja tauti on maailmanlaajuinen haaste terveydenhuollolle. Perinteiset syöpähoidot käsittävät kirurgian, sädehoidon, kemoterapian ja hormonaalisen hoidon, mutta näiden rinnalle on noussut uusia, aktivoituneiden onkogeenien signaalien estoon perustuvia hoitoja. Tämä työ tutki kohdennettuja syöpähoitoja ja näihin hoitoihin liittyvää resistenssiä keuhko-, rinta- ja paksusuolen syövän sekä melanooman solulinjoissa. Tulokset osoittavat, että joissakin ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjoissa yhdistetty PI3K- ja MEK-esto aiheuttaa tehokkaamman vasteen kuin kummankaan signaalireitin esto yksistään. Tässä työssä näytettiin myös, että maksimaalinen vaste yhdistetylle PI3K- ja MEK-estolle voidaan saavuttaa vaihtoehtoisilla annostelutavoilla, jotka ovat voisivat olla paremmin siedettyjä kliinisessä käytössä kuin kahden lääkkeen jatkuva annostelu. Tämä tutkimus osoitti lisäksi, että kaksoiseston tehokkuutta voidaan lisätä yhdistämällä hoitoon kolmas lääkeaine, ABT-263, entinostaatti tai dasatinibi. Bcl-xl proteiinilla on keskeinen rooli apoptoottisen vasteen määrittäjänä näille kolmen lääkkeen käsittelyille. Tämä työ osoitti, että syövän kantasolut voivat välittää resistenssiä kohdennetuille syöpähoidoille. Nämä solut noudattavat niin kutsuttua stokastista mallia, joten parhaan vasteen saaminen saattaa edellyttää että hoito kohdentuu sekä erilaistuneisiin että kantasolutyyppisiin syöpäsoluihin. Tässä tutkimuksessa osoitettin lisäksi, että Gö6976 toimii mutatoituneen EGFR:n estäjänä, huolimatta kehittyvää keuhkosyövissä resistenssiä välittävästä T90M mutaatiosta, sekä in vitro -että in vivo -malleissa.

Abstract Colorectal carcinoma (CRC) is an important cause of cancer-associated deaths. About 30–50% of CRCs show KRAS or BRAF mutation. In many cancers, anoikis, i.e. apoptosis induced by loss of extracellular matrix (ECM) contact, is disturbed. Anoikis resistance is essential for the formation of metastases, and since anoikis resistance assessment is based on in vitro cell cultures, the prognostic value of anoikis resistance is largely unknown. We aimed to identify the histopathological features indicating anoikis resistance in CRC and analyze their prognostic value. The roles of BRAF and KRAS mutations and survivin in anoikis resistance were analyzed and 3-D cell culture was used to model the histopathology of anoikis resistant (AR) structures. The two cohorts of CRC cases used in the study consisted of 62 (series 1) and 137 patients (series 2). Immunohistochemistry for ECM proteins enabled identification of tumor cells with and without ECM contact, and in both populations, apoptosis was determined with staining for caspase-cleaved keratin 18. Based on absence of ECM contact and decreased apoptosis rate, we identified micropapillary (MIP), cribriform and solid structures to represent the putative AR populations. High areal density of AR structures associated independently with short survival and was an independent prognostic factor. MIPs showed lower survivin expression, proliferation and apoptosis rates than non-MIP cells, and low apoptosis rate was associated with poor prognosis in stage I and II cases. For 3-D in vitro model of AR structures, we transfected Caco-2 cells with mutated KRAS or BRAF genes; both induced anoikis resistance as measured with Annexin V test in suspension culture. In 3-D cultures, native Caco-2 cells formed polarized cysts. In contrast, mutated cell lines formed partially filled cysts or solid structures, and inverted polarity in KRAS mutant cells. In conclusion, it is possible to identify putative AR structures by conventional histopathology and their number is associated with poor prognosis. MIPs represent a distinct subpopulation of CRC cells with features of quiescence. KRAS and BRAF mutations induce anoikis resistance in Caco-2 cells. In 3-D cultures, oncogenes KRAS and BRAF induce solid structures and cell piling, with structural resemblance to putative AR structures observed by histopathology. The mutated Caco-2 cells thus serve as a model to study the manifestation of anoikis resistance as a distinct histological feature with oncological significance. / Tiivistelmä Paksu- ja peräsuolisyöpä on yleinen syöpäkuoleman aiheuttaja. KRAS- tai BRAF-geenien mutaatio todetaan 30–50 prosentissa suolisyövistä. Anoikis tarkoittaa apoptoosia, jonka käynnistää solun irtoaminen soluväliaineesta. Anoikisresistenssi on etäpesäkkeen synnyn edellytys. Anoikisresistenssiä voidaan todeta vain soluviljelyssä, joten sen merkitystä syövässä in vivo ei ole aiemmin arvioitu. Tässä työssä pyrittiin tunnistamaan anoikisresistenssiin viittaavat muutokset histopatologisista suolisyöpänäytteistä ja selvittämään niiden vaikutusta potilaan ennusteeseen. Lisäksi tutkittiin BRAF- ja KRAS-mutaatioiden yhteyttä anoikisresistenssiin ja mallinnettiin anoikisresistenttejä (AR) rakenteita kolmiulotteisessa soluviljelmässä. Potilasaineisto koostui 199 suolisyöpäpotilaasta. Kudosleikkeistä värjättiin soluväliaineen komponentteja sekä määritettiin apoptoottiset ja jakautuvat solut (M30- ja Ki-67-värjäykset). AR-solupopulaatioiden tunnistamisessa käytettiin kriteereinä soluväliainekontaktin puuttumista ja vähentynyttä apoptoositiheyttä. AR-populaatioiksi osoittautuivat mikropapillaariset (MIP), seulamaiset ja solidit rakenteet. Näiden rakenteiden korkea kokonaisesiintyvyys osoittautui itsenäiseksi huonon ennusteen tekijäksi. MIP-rakenteissa surviviinin ilmentyminen ja apoptoosi- ja proliferaatiotiheys olivat vähentyneet muihin kasvainsoluihin verrattuna. Lisäksi apoptoottisten solujen pieni määrä MIP-rakenteissa liittyi huonoon ennusteeseen paikallisessa syövässä. Mallinnusta varten Caco-2 solut transfektoitiin mutatoiduilla KRAS- tai BRAF-geeneillä. Onkogeenien transfektion todettiin indusoivan anoikisresistenssiä. Kolmiulotteisessa soluviljelyssä polarisoituneet Caco-2 solut muodostivat säännöllisiä rauhasmaisia rakenteita. Onkogeeneillä transfektoidut solut muodostivat puolestaan osittain tai kokonaan täyttyneitä rakenteita ja KRAS-transfektio aiheutti solujen polariteetin kääntymistä. Havainnot osoittavat, että anoikisresistenssiä edustavat rakenteet voidaan tunnistaa kudosleikkeestä ja niiden runsas määrä viittaa huonoon ennusteeseen. MIP-rakenteissa todettiin lepotilan (quiescence) piirteitä. KRAS- ja BRAF-mutaatiot aiheuttavat Caco-2 soluissa anoikisresistenssiä. Kolmiulotteisissa soluviljelmissä onkogeenien vaikutus näkyy solujen pinoutumisena, mikä muistuttaa syöpäkudosnäytteissä todettuja AR-rakenteita. Tulosten perusteella modifioituja Caco-2 soluja voidaan hyödyntää anoikisresistenssin mallintamiseen ja tarkempien mekanismien tutkimiseen.

Abstract Cancer progression is a multistep process dependent on tumour-stroma interactions. Various cell types, such as fibroblasts, endothelial, inflammatory and stem cells, as well as extracellular matrix (ECM) proteins, such as collagens, contribute to the tumour outcome. Tumour growth and invasion is accompanied by the proteolysis of ECM components mediated by various enzymes, such as matrix metalloproteases (MMPs). Proteolytic fragments released into the circulation may reflect cancer progression. The aim of this study was to develop novel in vitro methods for investigating cell invasion and for measuring cancer-associated collagen degradation. Human carcinoma cell invasion studies in vitro are often performed in organotypic cell culture models, mainly composed of rat or mouse ECM proteins. To create a human microenvironment for invasion studies, a novel organotypic model based on human uterine myoma (benign tumour) tissue was developed. Compared to the conventional collagen-based organotypic model, in the myoma model the carcinoma cell invasion depth was about eightfold and the invasion resembled, to a greater degree, the invasion pattern of dissected tissue samples of cancer patients. In addition, the invasion was easily quantified with a novel radioimmunoassay measuring type III collagen degradation products from the organotypic culture media. As human mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the stromal cell types that may affect tumour progression, the mechanisms of stem cell invasion were also studied. On the surface of MSCs, Toll-like receptor 9 (TLR9) functions in immune defence against microbes. The activation of TLR9 with microbial DNA-resembling molecules induced human MSC invasion into the myoma tissue in a MMP-13-mediated fashion. To analyse cancer-associated soft tissue degradation, a novel enzyme immunoassay was developed. This novel assay enabled, for the first time, the measurement of type III collagen degradation products from human serum samples. In head and neck cancer patient sera, high levels of type III and type I collagen degradation products were shown to predict poor survival. In conclusion, the novel myoma model showed that the tumour microenvironment crucially affects carcinoma cell invasion. In addition, cancer-associated type III collagen degradation was successfully measured in cell cultures and in human sera by novel immunoassays. / Tiivistelmä Syövän eteneminen on monivaiheinen tapahtuma, jossa syöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa lähiympäristönsä kanssa. Ympäristön eri solutyypit, kuten kantasolut ja sidekudoksen fibroblastit sekä soluväliaineen proteiinit kuten kollageenit, vaikuttavat syöpäsolujen invaasioon eli tunkeutumiseen ympäröivään kudokseen. Syövän invaasiossa useat entsyymit, mm. matriksin metalloproteaasit (MMP:t), hajottavat soluväliainetta. Kasvaimen kehittymisen aikana verenkiertoon vapautuu soluväliaineen hajoamistuotteita, joiden määrä voi kuvastaa sairauden etenemistä. Väitöstutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia menetelmiä solujen invaasion ja syöpään liittyvän kollageenin hajoamisen tutkimiseen. Ihmisen karsinoomasolujen invaasion tutkimuksessa on perinteisesti käytetty kolmiulotteisia soluviljelymalleja, jotka koostuvat pääasiassa rotan tai hiiren soluväliaineproteiineista. Työssä kehitettiin uusi viljelymalli, jossa soluja kasvatettiin ihmisen hyvälaatuisen kohtukasvainkudospalan eli myooman päällä. Perinteiseen kollageenimalliin verrattuna myoomamallissa karsinoomasolut tunkeutuivat noin kahdeksan kertaa syvemmälle, ja solujen kasvu muistutti enemmän potilaiden syöpäkudosnäytteissä havaittua kasvutapaa. Invaasion voimakkuuden määrittämiseen kehitettiin vasta-aineisiin perustuva menetelmä, jolla mitattiin soluviljelmän kasvatusliuokseen myoomakudoksesta vapautuneiden tyypin III kollageenin hajoamistuotteiden määrää. Koska kantasolujen tiedetään voivan vaikuttaa syöpäkasvaimen leviämiseen, tutkimme myös ihmisen luuytimen kantasolujen invaasiota. Kantasolujen pinnalla TLR9-reseptori osallistuu immuunipuolustukseen mikrobeja vastaan. Kun reseptoria aktivoitiin mikrobi-DNA:ta muistuttavilla molekyyleillä, kantasolut alkoivat invasoitua myoomakudokseen ja MMP-13:n aktiivisuus soluissa lisääntyi. Syöpään liittyvän pehmytkudoksen hajoamisen tutkimiseksi kehitettiin vasta-ainemenetelmä, jolla onnistuttiin ensi kertaa mittaamaan potilaiden seeruminäytteistä tyypin III kollageenin hajoamistuotteita. Pään ja kaulan alueen syöpäpotilailla korkean tyypin III kollageenin hajoamistuotepitoisuuden todettiin liittyvän huonoon ennusteeseen. Tutkimus osoitti, että kasvaimen ympäristö vaikuttaa olennaisesti syöpäsolujen leviämiseen. Syöpään liittyvää tyypin III kollageenin hajoamista pystyttiin työssä kehitetyillä menetelmillä mittaamaan sekä soluviljelmistä että potilaiden seeruminäytteistä.