Abstract Tissue repair and cancer progression involve similar mechanisms, including degradation of extracellular matrix in which matrix metalloproteinases (MMPs) play essential roles. The action of MMPs is important in normal physiological processes but MMPs also contribute to various pathological conditions. MMP-8 belongs to a family of collagenases with a diverse set of substrates. MMP-8 action is involved in skin wound healing and in various human cancers. The function of MMP-8 in cancer appears to be highly complex and varies depending on the cancer type and location. Little is known about the involvement of MMP-8 in oral physiology and pathology. The aim of this study was to clarify the role of MMP-8 in oral tissue repair and oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC). Studies with MMP-8 deficient mice revealed that the function of MMP-8 in tissue repair is highly dependent on the spatial aspects. In alveolar bone, MMP-8 increased inflammation and affected collagen metabolism. In tongue wounds, MMP-8 impaired early healing and reduced transforming growth factor (TGF) -β1 levels. This study also revealed the protective role of MMP-8 in OTSCC patients, in agreement with previous studies indicating positive features of MMP-8 in cancer. Low MMP-8 level and high vascular endothelial growth factor (VEGF) -C levels in tumors correlated with worse prognosis in these patients. In mouse tongue fibroblast cell cultures, MMP-8 reduced TGF-β1 signaling molecule phosphorylated Smad2 levels and impaired the collagen contraction ability. TGF-β1, apoptosis factor Fas-ligand (Fas-L) and estrogen receptors (ERs) were identified as novel MMP-8 substrates. In OTSCC cell cultures, MMP-8 impaired cell migration and invasion. Diminished TGF-β1 levels were involved in the defective migration of MMP-8 overexpressing cells. Moreover, MMP-8 affected the expression of MMP-9, MMP-1, cathepsin-K, VEGF-C and TGF-β1. In mouse models of OTSCC, MMP-8 protected against tumor development but was not able to prevent metastasis formation. The main findings of this study were that 1) MMP-8 action in tissue repair depends on the site of the injury and 2) in OTSCC, MMP-8 has tumor suppressive effects, but in mouse, MMP-8 does not inhibit metastasis formation. In addition, 3) four novel MMP-8 substrates (TGF-β1, Fas-L, ER-α and -β) were identified that may explain the spatial and diverse roles of MMP-8. / Tiivistelmä Kudosvaurioiden paranemiseen ja syövän etenemiseen liittyy useita samankaltaisia mekanismeja. Molemmissa toimivat soluvälitilan muokkaamiseen osallistuvat proteaasit, joista matriksin metalloproteinaaseilla (MMP) on tärkeä merkitys; ne osallistuvat lukuisiin elimistön keskeisiin fysiopatologisiin prosesseihin. Kollagenaasi MMP-8 muokkaa monentyyppisiä molekyylejä. Se on mukana ihohaavan paranemisessa ja useissa syövissä. MMP-8:n toiminta syöpätiloissa on hyvin moninainen riippuen syöpätyypistä ja sijainnista. Väitöstutkimuksessa selvitettiin MMP-8:n merkitystä suun kova- ja pehmytkudosvaurioprosesseissa sekä kielisyövässä, joissa se on ollut tuntematon. MMP-8 poistogeenisillä hiirillä tehdyissä pehmyt- ja kovakudoshaavoissa MMP-8:n vaikutusmekanismit riippuivat kohdekudoksesta. Alveoliluun paranemisen yhteydessä MMP-8 lisäsi tulehdusta ja osallistui kollageenin muokkaamiseen. Akuutin kielihaavan paranemisessa MMP-8 hidasti haavan umpeutumista ja vähensi transformoivan kasvutekijä-β1:n (TGF-β1) määrää. Kuten useissa muissakin syövissä, myös kielisyövässä todettiin MMP-8:lla olevan suojaava vaikutus. Potilaan ennuste huononi, jos kasvainsolukon matala MMP-8-taso yhdistyi korkeaan verisuonten kasvutekijä-C:n (VEGF-C) määrään. Hiiren kielen normaaleissa fibroblastiviljelmissä MMP-8 vähensi TGF-β1:n solunsisäistä signalointia välittävän fosforyloidun Smad2:n määrää sekä solujen kykyä supistaa kollageenikiekkoja. Koeputkessa MMP-8 pilkkoi TGF-β1:tä, estrogeenireseptoreja (ER) ja apoptoositekijä Fas-ligandia (Fas-L). Ihmisen kielikarsinoomasoluviljelmissä korkea MMP-8:n määrä vähensi solujen migraatiota ja invaasiota sekä muutti MMP-1:n, MMP-9:n, katepsiini-K:n, TGF-β1:n ja VEGF-C:n ilmentymistä. Migraation heikentyminen MMP-8:aa tuottavissa soluissa johtui osin vähentyneestä TGF-β1:n määrästä. Hiiren kokeellisissa kielisyövissä MMP-8 hidasti syövän muodostumista mutta ei estänyt etäpesäkkeiden muodostusta. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on kolme päälöydöstä: 1) MMP-8:n vaikutus kudoksen paranemisprosessiin riippuu vauriokohdasta, 2) MMP-8 on kielisyövän kehittymisessä puolustuksellinen molekyyli, mutta sen lisääntynyt tuotto ei hiirikokeissa estänyt etäpesäkkeiden muodostusta, 3) MMP-8:lle löydettiin neljä uutta kohdemolekyyliä (TGF-β1, Fas-L, ER-α ja -β), joiden muokkaus saattaa osin selittää MMP-8:n monipuoliset kudos- ja prosessispesifit vaikutukset.

Abstract Cancer progression is a multistep process dependent on tumour-stroma interactions. Various cell types, such as fibroblasts, endothelial, inflammatory and stem cells, as well as extracellular matrix (ECM) proteins, such as collagens, contribute to the tumour outcome. Tumour growth and invasion is accompanied by the proteolysis of ECM components mediated by various enzymes, such as matrix metalloproteases (MMPs). Proteolytic fragments released into the circulation may reflect cancer progression. The aim of this study was to develop novel in vitro methods for investigating cell invasion and for measuring cancer-associated collagen degradation. Human carcinoma cell invasion studies in vitro are often performed in organotypic cell culture models, mainly composed of rat or mouse ECM proteins. To create a human microenvironment for invasion studies, a novel organotypic model based on human uterine myoma (benign tumour) tissue was developed. Compared to the conventional collagen-based organotypic model, in the myoma model the carcinoma cell invasion depth was about eightfold and the invasion resembled, to a greater degree, the invasion pattern of dissected tissue samples of cancer patients. In addition, the invasion was easily quantified with a novel radioimmunoassay measuring type III collagen degradation products from the organotypic culture media. As human mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the stromal cell types that may affect tumour progression, the mechanisms of stem cell invasion were also studied. On the surface of MSCs, Toll-like receptor 9 (TLR9) functions in immune defence against microbes. The activation of TLR9 with microbial DNA-resembling molecules induced human MSC invasion into the myoma tissue in a MMP-13-mediated fashion. To analyse cancer-associated soft tissue degradation, a novel enzyme immunoassay was developed. This novel assay enabled, for the first time, the measurement of type III collagen degradation products from human serum samples. In head and neck cancer patient sera, high levels of type III and type I collagen degradation products were shown to predict poor survival. In conclusion, the novel myoma model showed that the tumour microenvironment crucially affects carcinoma cell invasion. In addition, cancer-associated type III collagen degradation was successfully measured in cell cultures and in human sera by novel immunoassays. / Tiivistelmä Syövän eteneminen on monivaiheinen tapahtuma, jossa syöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa lähiympäristönsä kanssa. Ympäristön eri solutyypit, kuten kantasolut ja sidekudoksen fibroblastit sekä soluväliaineen proteiinit kuten kollageenit, vaikuttavat syöpäsolujen invaasioon eli tunkeutumiseen ympäröivään kudokseen. Syövän invaasiossa useat entsyymit, mm. matriksin metalloproteaasit (MMP:t), hajottavat soluväliainetta. Kasvaimen kehittymisen aikana verenkiertoon vapautuu soluväliaineen hajoamistuotteita, joiden määrä voi kuvastaa sairauden etenemistä. Väitöstutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia menetelmiä solujen invaasion ja syöpään liittyvän kollageenin hajoamisen tutkimiseen. Ihmisen karsinoomasolujen invaasion tutkimuksessa on perinteisesti käytetty kolmiulotteisia soluviljelymalleja, jotka koostuvat pääasiassa rotan tai hiiren soluväliaineproteiineista. Työssä kehitettiin uusi viljelymalli, jossa soluja kasvatettiin ihmisen hyvälaatuisen kohtukasvainkudospalan eli myooman päällä. Perinteiseen kollageenimalliin verrattuna myoomamallissa karsinoomasolut tunkeutuivat noin kahdeksan kertaa syvemmälle, ja solujen kasvu muistutti enemmän potilaiden syöpäkudosnäytteissä havaittua kasvutapaa. Invaasion voimakkuuden määrittämiseen kehitettiin vasta-aineisiin perustuva menetelmä, jolla mitattiin soluviljelmän kasvatusliuokseen myoomakudoksesta vapautuneiden tyypin III kollageenin hajoamistuotteiden määrää. Koska kantasolujen tiedetään voivan vaikuttaa syöpäkasvaimen leviämiseen, tutkimme myös ihmisen luuytimen kantasolujen invaasiota. Kantasolujen pinnalla TLR9-reseptori osallistuu immuunipuolustukseen mikrobeja vastaan. Kun reseptoria aktivoitiin mikrobi-DNA:ta muistuttavilla molekyyleillä, kantasolut alkoivat invasoitua myoomakudokseen ja MMP-13:n aktiivisuus soluissa lisääntyi. Syöpään liittyvän pehmytkudoksen hajoamisen tutkimiseksi kehitettiin vasta-ainemenetelmä, jolla onnistuttiin ensi kertaa mittaamaan potilaiden seeruminäytteistä tyypin III kollageenin hajoamistuotteita. Pään ja kaulan alueen syöpäpotilailla korkean tyypin III kollageenin hajoamistuotepitoisuuden todettiin liittyvän huonoon ennusteeseen. Tutkimus osoitti, että kasvaimen ympäristö vaikuttaa olennaisesti syöpäsolujen leviämiseen. Syöpään liittyvää tyypin III kollageenin hajoamista pystyttiin työssä kehitetyillä menetelmillä mittaamaan sekä soluviljelmistä että potilaiden seeruminäytteistä.