Abstract Tissue repair and cancer progression involve similar mechanisms, including degradation of extracellular matrix in which matrix metalloproteinases (MMPs) play essential roles. The action of MMPs is important in normal physiological processes but MMPs also contribute to various pathological conditions. MMP-8 belongs to a family of collagenases with a diverse set of substrates. MMP-8 action is involved in skin wound healing and in various human cancers. The function of MMP-8 in cancer appears to be highly complex and varies depending on the cancer type and location. Little is known about the involvement of MMP-8 in oral physiology and pathology. The aim of this study was to clarify the role of MMP-8 in oral tissue repair and oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC). Studies with MMP-8 deficient mice revealed that the function of MMP-8 in tissue repair is highly dependent on the spatial aspects. In alveolar bone, MMP-8 increased inflammation and affected collagen metabolism. In tongue wounds, MMP-8 impaired early healing and reduced transforming growth factor (TGF) -β1 levels. This study also revealed the protective role of MMP-8 in OTSCC patients, in agreement with previous studies indicating positive features of MMP-8 in cancer. Low MMP-8 level and high vascular endothelial growth factor (VEGF) -C levels in tumors correlated with worse prognosis in these patients. In mouse tongue fibroblast cell cultures, MMP-8 reduced TGF-β1 signaling molecule phosphorylated Smad2 levels and impaired the collagen contraction ability. TGF-β1, apoptosis factor Fas-ligand (Fas-L) and estrogen receptors (ERs) were identified as novel MMP-8 substrates. In OTSCC cell cultures, MMP-8 impaired cell migration and invasion. Diminished TGF-β1 levels were involved in the defective migration of MMP-8 overexpressing cells. Moreover, MMP-8 affected the expression of MMP-9, MMP-1, cathepsin-K, VEGF-C and TGF-β1. In mouse models of OTSCC, MMP-8 protected against tumor development but was not able to prevent metastasis formation. The main findings of this study were that 1) MMP-8 action in tissue repair depends on the site of the injury and 2) in OTSCC, MMP-8 has tumor suppressive effects, but in mouse, MMP-8 does not inhibit metastasis formation. In addition, 3) four novel MMP-8 substrates (TGF-β1, Fas-L, ER-α and -β) were identified that may explain the spatial and diverse roles of MMP-8. / Tiivistelmä Kudosvaurioiden paranemiseen ja syövän etenemiseen liittyy useita samankaltaisia mekanismeja. Molemmissa toimivat soluvälitilan muokkaamiseen osallistuvat proteaasit, joista matriksin metalloproteinaaseilla (MMP) on tärkeä merkitys; ne osallistuvat lukuisiin elimistön keskeisiin fysiopatologisiin prosesseihin. Kollagenaasi MMP-8 muokkaa monentyyppisiä molekyylejä. Se on mukana ihohaavan paranemisessa ja useissa syövissä. MMP-8:n toiminta syöpätiloissa on hyvin moninainen riippuen syöpätyypistä ja sijainnista. Väitöstutkimuksessa selvitettiin MMP-8:n merkitystä suun kova- ja pehmytkudosvaurioprosesseissa sekä kielisyövässä, joissa se on ollut tuntematon. MMP-8 poistogeenisillä hiirillä tehdyissä pehmyt- ja kovakudoshaavoissa MMP-8:n vaikutusmekanismit riippuivat kohdekudoksesta. Alveoliluun paranemisen yhteydessä MMP-8 lisäsi tulehdusta ja osallistui kollageenin muokkaamiseen. Akuutin kielihaavan paranemisessa MMP-8 hidasti haavan umpeutumista ja vähensi transformoivan kasvutekijä-β1:n (TGF-β1) määrää. Kuten useissa muissakin syövissä, myös kielisyövässä todettiin MMP-8:lla olevan suojaava vaikutus. Potilaan ennuste huononi, jos kasvainsolukon matala MMP-8-taso yhdistyi korkeaan verisuonten kasvutekijä-C:n (VEGF-C) määrään. Hiiren kielen normaaleissa fibroblastiviljelmissä MMP-8 vähensi TGF-β1:n solunsisäistä signalointia välittävän fosforyloidun Smad2:n määrää sekä solujen kykyä supistaa kollageenikiekkoja. Koeputkessa MMP-8 pilkkoi TGF-β1:tä, estrogeenireseptoreja (ER) ja apoptoositekijä Fas-ligandia (Fas-L). Ihmisen kielikarsinoomasoluviljelmissä korkea MMP-8:n määrä vähensi solujen migraatiota ja invaasiota sekä muutti MMP-1:n, MMP-9:n, katepsiini-K:n, TGF-β1:n ja VEGF-C:n ilmentymistä. Migraation heikentyminen MMP-8:aa tuottavissa soluissa johtui osin vähentyneestä TGF-β1:n määrästä. Hiiren kokeellisissa kielisyövissä MMP-8 hidasti syövän muodostumista mutta ei estänyt etäpesäkkeiden muodostusta. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on kolme päälöydöstä: 1) MMP-8:n vaikutus kudoksen paranemisprosessiin riippuu vauriokohdasta, 2) MMP-8 on kielisyövän kehittymisessä puolustuksellinen molekyyli, mutta sen lisääntynyt tuotto ei hiirikokeissa estänyt etäpesäkkeiden muodostusta, 3) MMP-8:lle löydettiin neljä uutta kohdemolekyyliä (TGF-β1, Fas-L, ER-α ja -β), joiden muokkaus saattaa osin selittää MMP-8:n monipuoliset kudos- ja prosessispesifit vaikutukset.

Abstract Heterotopic ossification is a pathological condition in which bone forms outside the skeletal system. It can also occur in skin, which is the case in some genetic disorders. In multiple miliary osteoma cutis (MMOC), tiny bone fragments develop in the dermis and nearby subcutaneous tissue of the face and upper chest region during middle age. The etiology of the disease is poorly understood. The origin of the osteoma-forming cells is not known and also unknown are the signaling factors that direct the skin cells towards an osteogenic lineage. The purpose of this study was to investigate MMOC and the pathogenesis of ectopic bone formation by combining patient study and cell biology methods. The results from an extensive review of the literature and five new cases revealed MMOC as a distinct disease entity, where heterotopic bone formation is intramembranous. No correlation was found between MMOC and acne scars, hormonal disturbances or GNAS gene mutations. In cell culture studies mouse and human dermal fibroblasts and mouse dermal papilla (DP) cells were found to differentiate into osteoblast-like matrix mineralizing cells. The bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) homodimer and BMP-2/7 heterodimer had significant effects on the osteogenic differentiation of the above mentioned cells. Interestingly, the BMPs enhanced the differentiation of mouse cells but reduced it in human cells. In mouse DP cells and human fibroblasts BMP-2/7 was more potent than BMP-4. The skin area affected by osteomas in patients was compared to their unaffected skin and also to the corresponding skin areas in controls with regard to osteogenic differentiation and gene expression studies. MMOC patients’ skin differs from controls both in osteoma and unaffected skin areas, which suggests MMOC is not only a local but also a systemic skin disease. The results confirm the previous findings that gene expression in skin is different in different parts of the body, which could explain why the osteomas develop in certain skin areas. The results of this study provide new information about MMOC and heterotopic ossification in skin and could be useful when developing treatments for MMOC. This study also presents new information about BMPs and their different effects in mouse and human cells, which may stimulate discussion about the generalization of mouse studies in humans and the clinical use of BMPs. / Tiivistelmä Virhesijaintinen luutuminen on patologinen tila, jossa luuta muodostuu luisen tukirangan ulkopuolelle. Tätä voi tapahtua myös ihossa, kuten käy tietyissä sairauksissa. Ihon lukuisat jyvämäiset osteoomat on tauti, jossa pieniä luujyväsiä ilmaantuu verinahkaan ja ihonalaiskudokseen keski-iässä. Taudin syytä, osteoomia muodostavien solujen alkuperää tai sitä, mitkä viestinvälittäjät saavat esiastesolut siirtymään luusolulinjalle, ei tiedetä. Tässä työssä tutkittiin ihon lukuisia jyvämäisiä osteoomia ja virhesijaintista luutumista yhdistämällä kliinisiä ja solubiologisia menetelmiä. Laajasta kirjallisuuteen perehtymisestä ja viidestä omasta potilaasta saadut tulokset osoittivat ihon lukuisten jyvämäisten osteoomien olevan oma erillinen tautinsa, jossa virhesijaintinen luutuminen tapahtuu suoran luutumisen mekanismilla. Tauti ei näytä olevan yhteydessä aknearpiin, hormonihäiriöihin tai GNAS-geenin mutaatioihin. Soluviljelykokeissa hiiren ja ihmisen verinahan fibroblastien ja hiiren karvatupen nystyn solujen havaittiin erilaistuvan osteoblastityyppisiksi soluväliainetta mineralisoiviksi soluiksi. Luun morfogeneettisillä proteiineilla (BMP) 4 ja 2/7 oli merkitsevä vaikutus yllä mainittujen solujen erilaistumisessa. Yllättävää kyllä, ne edistivät hiiren solujen, mutta vähensivät ihmisen solujen erilaistumista. Hiiren karvatupen soluille ja ihmisen fibroblasteille BMP-2/7 oli tehokkaampi kuin BMP-4. Potilaiden osteoma-aluetta verrattiin heidän terveeseen ihoalueeseensa samoin kuin vastaaviin ihoalueisiin kontrollihenkilöillä käyttäen menetelminä solujen erilaistamista luuta muodostavaan suuntaan sekä geenien ilmentymisen tutkimista. Potilaiden iho erosi kontrollien ihosta sekä osteooma-alueella että terveellä ihoalueella, mikä viittaa taudin olevan koko elimistöön vaikuttava. Tulokset vahvistavat aikaisempia löydöksiä siitä, että geenien ilmentyminen ihossa on erilaista eri puolilla kehoa. Tämä voisi selittää osteoomien esiintymisen vain tietyllä alueella. Tämän tutkimuksen tulokset antavat uutta tietoa ihon lukuisista jyvämäisistä osteoomista ja virhesijaintisesta luutumisesta ja saattavat olla hyödyksi kehitettäessä taudin hoitoa. Tutkimus antaa uutta tietoa luun morfogeneettisten proteiinien erilaisesta käyttäytymisestä hiirellä ja ihmisellä, mikä herättänee keskustelua hiirikokeiden yleistämisestä ihmiseen ja luun morfogeneettisten proteiinien kliinisestä käytöstä.

Abstract Pulmonary fibrosis, lung cancer and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are severe diseases and common death causes worldwide. Due to the lack of an effective therapy, the investigation of cell biological mechanisms behind these diseases is essential. An activation of stromal cells, including myofibroblasts, is a main feature found in the pathogenesis of lung diseases. Myofibroblasts express alpha-smooth muscle actin (α-SMA), have specific ultrastructure, produce extracellular matrix proteins and possess contractile capacity. Detailed structure and function of myofibroblasts and their roles in healthy and diseased lung are not yet wholly understood. The investigation of the myofibroblasts may further offer novel tools for the acquisition of proper diagnosis, prognosis and medical treatment. The study aimed to characterize the ultrastructural, functional and disease-specific features of stromal cells, particularly myofibroblasts, in interstitial and malignant lung diseases. The functional properties evaluated here were differentiation, invasive and contractile properties. The study material included in vitro stromal cells cultured from bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. The appearance and location of myofibroblasts in different lung compartments of non-smokers and the COPD-patients were examined in vivo. The cells were investigated by light and electron microscopy. The α-SMA expression was analysed by gene or protein assays. The study demonstrated that stromal cells could be cultured from diagnostic BAL fluid samples and lung tissues. Cultured cells were a mixture of fibroblasts and myofibroblasts. A small proportion of cells exhibited progenitor-like features. Myofibroblasts revealed differential features in electron microscopy and invasive or contractile assays. When studying tissues from healthy and COPD lungs, myofibroblasts were located both in alveoli and airways. In alveoli myofibroblasts localized in widened alveolar tips which were newly described structures and locations of myofibroblasts in healthy and diseased lung. The amount of myofibroblasts in large airways, but not in peripheral lung, was increased in COPD. We concluded that myofibroblasts have several locations in normal and COPD lung, which suggests a function both in pulmonary regeneration and the pathogenesis of COPD. Smoking altered the phenotype of myofibroblasts regardless of its origin. / Tiivistelmä Keuhkofibroosi, keuhkosyöpä ja keuhkoahtaumatauti (COPD) ovat kansallisesti ja maailmanlaajuisesti yleisiä ja kuolemaan johtavia sairauksia. Taudinmääritys ja hoito ovat vaativia, eikä kaikille potilaille ole parantavaa hoitoa. Keuhkosairauksien kaikkia solubiologisia mekanismeja ei vielä tunneta, mikä on yksi syy lääkekehityksen ongelmiin. Interstitiaaleissa ja pahanlaatuisissa keuhkosairauksissa esiintyy paljon aktiivisia sidekudossoluja, kuten muuntuneita fibroblasteja eli myofibroblasteja. Ne tunnistetaan hienorakenteesta, jota voidaan tutkia elektronimikroskoopilla. Myofibroblastit ilmentävät myös solun sisäistä sileän lihaksen alfa-aktiinia (α-SMA), tuottavat sidekudoksen proteiineja ja kykenevät supistumaan. Myofibroblastien hienorakenteen ja toiminnan selvittäminen voi antaa lisätietoa keuhkosairauksien syntymekanismeista, jolloin diagnostiikkaa, ennustetta sekä hoitoja voidaan arvioida paremmin. Väitöskirjassa selvitettiin myofibroblastien hienorakennetta ja toimintaa eri keuhkosairauksissa. Tutkitut toiminnalliset ominaisuudet olivat erilaistumispotentiaali, invasiivisuus ja supistumiskyky. Sairauksien kliinistä käyttäytymistä ja potilaiden tupakointitottumuksia tarkasteltiin suhteessa solubiologiatason havaintoihin. Tutkimusmateriaali kerättiin taudinmäärityksen yhteydessä interstitiaalisia keuhkosairauksia, keuhkoahtaumatautia tai keuhkosyöpää sairastavilta potilailta. Tulosten mukaan bronkoalveolaarihuuhtelunesteestä (BAL) ja keuhkokudospaloista voidaan soluviljelymenetelmin kasvattaa ja ylläpitää solulinjoja. Viljellyt solut muodostivat sekasolupopulaatiota, joissa esiintyi pääosin fibroblasteja ja vaihteleva osuus myofibroblasteja. Pieni osa soluista ilmensi kantasoluille tyypillisiä piirteitä. Myofibroblastien tyyppipiirteet ja toiminnalliset ominaisuudet vaihtelivat taudeittain. Kudoksessa myofibroblasteja ilmentyi sekä keuhkorakkuloissa että ilmateissä. Keuhkorakkulatasolla myofibroblastit sijoittuivat irrallisten alveoliseinämien laajentuneisiin päihin, joita ei ole aiemmin tutkittu tieteellisessä kirjallisuudessa myofibroblastien yhteydessä. Keuhkoahtaumatauti ja tupakointi vähensivät näiden rakenteiden määrää perifeerisessä keuhkossa, kun taas suurissa ilmateissä keuhkoahtaumatauti lisäsi myofibroblasteja. Päättelimme, että myofibroblastit edistävät keuhkoahtaumataudin syntyä isoissa ilmateissä, mutta saattavat osallistua keuhkojen korjaukseen keuhkorakkuloissa ja pienissä ilmateissä.