L’étude des formes familiales de syndrome néphrotique (SN) ou de protéinurie glomérulaire avec lésions histologiques de hyalinose segmentaire et focale (HSF) a permis d’incriminer plus d’une vingtaine de gènes, majoritairement exprimés par le podocyte, cellule principale de la barrière de filtration glomérulaire (BFG). Parmi ces gènes, près d’une dizaine code des régulateurs du cytosquelette d’actine démontrant ainsi le rôle central de la plasticité et de l’architecture du podocyte dans le fonctionnement du filtre glomérulaire. L’ensemble de ces travaux a permis de définir une nouvelle catégorie de maladies nommées podocytopathies héréditaires. Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation de plusieurs gènes (TTC21B, WDR73, TRIM3), dont nous avons identifié des mutations dans des cas de podocytopathies héréditaires isolées ou syndromiques. Les résultats du premier volet de ma thèse ont montré que la mutation faux sens p.P209L dans le gène TTC21B induit à l’état homozygote une nouvelle entité clinique associant à la fois une atteinte glomérulaire et une atteinte tubulaire. TTC21B code l’IFT139 (intraflagellar transport protein 139), une protéine impliquée dans le transport protéique antérograde dans le cil primaire, un organite présent à la surface de la plupart des cellules épithéliales. Ces résultats étaient inattendus car l’identification de mutations dans un gène codant une protéine ciliaire n’avait jamais été démontrée auparavant dans des cas de podocytopathies héréditaires, et surtout, il ne semblait pas exister de cil primaire à la surface des podocytes matures. Effectivement, nous avons montré que le cil primaire est présent dans les podocytes humains indifférenciés, mais disparait au cours de la différenciation. Nos résultats ont permis de comprendre l’apparente contradiction entre la survenue d’une pathologie glomérulaire relativement tardive (protéinurie et SN à l’adolescence) et l’absence de cil dans le podocyte mature. En effet, nous avons montré que la mutation p.P209L est une mutation hypomorphe qui induit des défauts mineurs dans la fonction ciliaire, alors qu’elle provoque, dans le podocyte différencié, une déstructuration importante du réseau d’actine et de microtubules du podocyte. Cette étude montre que la protéine ciliaire IFT139, par sa fonction extra-ciliaire, permet de réguler la dynamique des microtubules. Dans le deuxième volet de mon projet, en collaboration avec l’équipe de D Bonneau (Angers), nous avons identifié des mutations tronquantes dans le gène WDR73, dans deux familles non apparentées présentant un syndrome de Galloway-Mowat (SGM), pathologie de transmission autosomique récessive, très hétérogène cliniquement, associant SN et microcéphalie. Ces travaux ont permis d’identifier le premier gène impliqué dans le SGM, dans un sous-groupe de patients présentant un phénotype neurologique très homogène (microcéphalie post-natale, atrophie corticale avec atrophie cérébelleuse majeure, déficience intellectuelle très sévère), alors que l’atteinte glomérulaire est très variable. Ce gène code WDR73, une protéine à motifs WD40. Nos travaux ont montré que la protéine est exprimée dans les neurones du système nerveux central, en particulier dans les cellules de Purkinje du cervelet et dans les podocytes. Des études fonctionnelles nous ont permis de montrer que WDR73 est impliquée dans la survie cellulaire, puisqu’en son absence, une apoptose accrue est observée dans les fibroblastes de patients. De plus, elle est également nécessaire au maintien de la dynamique des microtubules dans les fibroblastes et dans les podocytes différenciés, alors qu’elle ne semble pas avoir de rôle dans la régulation de l’actine. (...) / The genetic study of familial forms of nephrotic syndrome or proteinuria with focal segmental glomerulosclerosis has permitted the identification of 30 causal genes, mainly expressed in the podocyte, which is the principal actor of the glomerular filtration barrier (GFB). Among those genes, approximately ten encode actin cytoskeleton regulators and components, thus highlighting the dramatic role of the podocyte architecture and plasticity in the function of the GFB. During the last decade, all the accumulating results, has made a new category of disease called hereditary podocytopathies. The aim of my thesis project was to characterize the effect of mutations in three candidate genes (TTC21B, WDR73, WDR73), identified by whole exome sequencing in isolated or syndromic podocytopathies. In the first part of my project, we found a homozygous missense mutation (p.P209L) in TTC21B, which encodes a ciliary gene named Intraflagellar transport protein IFT139. This protein ensures the trafficking of components from the tip to the base of the primary cilium, which is an organelle present on most mammalian epithelial cells. These results were unexpected because until now, the existence of the primary cilium was unknown. Our work demonstrates the presence of the primary cilium in the human immature podocyte that disappears once podocytes have differentiated. We also showed that IFT139 localized at the basal body and then relocalized along the complex microtubule network of differenciated cells. We showed that the hypomorphic mutation p.P209L causes minor ciliary defects in undifferentiated cells that are not responsible for the glomerular phenotype. Indeed, the glomerular lesions are rather due to drastic damage in actin and, microtubular dysregulation, found in differentiated podocytes. The second part of my thesis aimed to characterize the effects of truncating mutations identified in the WDR73 gene, found in two families. WDR73 is the first gene identified in Galloway Mowat syndrome by whole exome sequencing combined with homozygous mapping. This rare disease is defined by the association of microcephaly with nephrotic syndrome. In this study, the phenotypes of patients with WDR73 mutations are homogenous concerning neurological features, and are heterogeneous with regards to the renal defects. Thus, WDR73 mutations are responsible for a subset of particular patients affected with Galloway-Mowat syndrome. The WDR73 gene encodes WDR73, a WD-40 containing protein of unknown function. Our studies demonstrated that this protein is expressed in both neurons and podocytes in human tissues. We demonstrated that in undifferentiated cells, WDR73 is weakly expressed in the cytosol, while strong expression and relocalization to the spindle pole, microtubule asters and in the cleavage furrow occur during mitosis. Patient fibroblasts and WDR73-depleted podocytes displayed defects in nuclear morphology, which was associated with a decrease in cell survival in patient fibroblasts. Furthermore, we showed that patient fibroblasts and differentiated WDR73-depleted podocytes harbored an atypical morphology associated with a disorganized microtubule network, suggesting microtubule polymerization defects. Our functional studies demonstrated that WDR73 is crucial in both cell survival and microtubule polymerization in neurons and podocytes. The final part of my PhD work focused on the characterization of a missense mutation in the TRIM3 gene R28W identified by whole exome sequencing in a non consanguineous family with autosomal dominant focal segmental glomerulosclerosis. TRIM3 encodes TRIM3, an E3 ubiquitin-ligase that plays a role in transferrin endosomal recycling, and in microtubule trafficking via KIF21B, one of its known partners. Interestingly, the polymorphism V801M in ACTN4 co-segrates with the disease. Furthermore, mutations in this gene were already incriminated in autosomal dominant cases of HSF. (...)

L’étude des formes familiales de syndrome néphrotique (SN) ou de protéinurie glomérulaire avec lésions histologiques de hyalinose segmentaire et focale (HSF) a permis d’incriminer plus d’une vingtaine de gènes, majoritairement exprimés par le podocyte, cellule principale de la barrière de filtration glomérulaire (BFG). Parmi ces gènes, près d’une dizaine code des régulateurs du cytosquelette d’actine démontrant ainsi le rôle central de la plasticité et de l’architecture du podocyte dans le fonctionnement du filtre glomérulaire. L’ensemble de ces travaux a permis de définir une nouvelle catégorie de maladies nommées podocytopathies héréditaires. Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation de plusieurs gènes (TTC21B, WDR73, TRIM3), dont nous avons identifié des mutations dans des cas de podocytopathies héréditaires isolées ou syndromiques. Les résultats du premier volet de ma thèse ont montré que la mutation faux sens p.P209L dans le gène TTC21B induit à l’état homozygote une nouvelle entité clinique associant à la fois une atteinte glomérulaire et une atteinte tubulaire. TTC21B code l’IFT139 (intraflagellar transport protein 139), une protéine impliquée dans le transport protéique antérograde dans le cil primaire, un organite présent à la surface de la plupart des cellules épithéliales. Ces résultats étaient inattendus car l’identification de mutations dans un gène codant une protéine ciliaire n’avait jamais été démontrée auparavant dans des cas de podocytopathies héréditaires, et surtout, il ne semblait pas exister de cil primaire à la surface des podocytes matures. Effectivement, nous avons montré que le cil primaire est présent dans les podocytes humains indifférenciés, mais disparait au cours de la différenciation. Nos résultats ont permis de comprendre l’apparente contradiction entre la survenue d’une pathologie glomérulaire relativement tardive (protéinurie et SN à l’adolescence) et l’absence de cil dans le podocyte mature. En effet, nous avons montré que la mutation p.P209L est une mutation hypomorphe qui induit des défauts mineurs dans la fonction ciliaire, alors qu’elle provoque, dans le podocyte différencié, une déstructuration importante du réseau d’actine et de microtubules du podocyte. Cette étude montre que la protéine ciliaire IFT139, par sa fonction extra-ciliaire, permet de réguler la dynamique des microtubules. Dans le deuxième volet de mon projet, en collaboration avec l’équipe de D Bonneau (Angers), nous avons identifié des mutations tronquantes dans le gène WDR73, dans deux familles non apparentées présentant un syndrome de Galloway-Mowat (SGM), pathologie de transmission autosomique récessive, très hétérogène cliniquement, associant SN et microcéphalie. Ces travaux ont permis d’identifier le premier gène impliqué dans le SGM, dans un sous-groupe de patients présentant un phénotype neurologique très homogène (microcéphalie post-natale, atrophie corticale avec atrophie cérébelleuse majeure, déficience intellectuelle très sévère), alors que l’atteinte glomérulaire est très variable. Ce gène code WDR73, une protéine à motifs WD40. Nos travaux ont montré que la protéine est exprimée dans les neurones du système nerveux central, en particulier dans les cellules de Purkinje du cervelet et dans les podocytes. Des études fonctionnelles nous ont permis de montrer que WDR73 est impliquée dans la survie cellulaire, puisqu’en son absence, une apoptose accrue est observée dans les fibroblastes de patients. De plus, elle est également nécessaire au maintien de la dynamique des microtubules dans les fibroblastes et dans les podocytes différenciés, alors qu’elle ne semble pas avoir de rôle dans la régulation de l’actine. (...) / The genetic study of familial forms of nephrotic syndrome or proteinuria with focal segmental glomerulosclerosis has permitted the identification of 30 causal genes, mainly expressed in the podocyte, which is the principal actor of the glomerular filtration barrier (GFB). Among those genes, approximately ten encode actin cytoskeleton regulators and components, thus highlighting the dramatic role of the podocyte architecture and plasticity in the function of the GFB. During the last decade, all the accumulating results, has made a new category of disease called hereditary podocytopathies. The aim of my thesis project was to characterize the effect of mutations in three candidate genes (TTC21B, WDR73, WDR73), identified by whole exome sequencing in isolated or syndromic podocytopathies. In the first part of my project, we found a homozygous missense mutation (p.P209L) in TTC21B, which encodes a ciliary gene named Intraflagellar transport protein IFT139. This protein ensures the trafficking of components from the tip to the base of the primary cilium, which is an organelle present on most mammalian epithelial cells. These results were unexpected because until now, the existence of the primary cilium was unknown. Our work demonstrates the presence of the primary cilium in the human immature podocyte that disappears once podocytes have differentiated. We also showed that IFT139 localized at the basal body and then relocalized along the complex microtubule network of differenciated cells. We showed that the hypomorphic mutation p.P209L causes minor ciliary defects in undifferentiated cells that are not responsible for the glomerular phenotype. Indeed, the glomerular lesions are rather due to drastic damage in actin and, microtubular dysregulation, found in differentiated podocytes. The second part of my thesis aimed to characterize the effects of truncating mutations identified in the WDR73 gene, found in two families. WDR73 is the first gene identified in Galloway Mowat syndrome by whole exome sequencing combined with homozygous mapping. This rare disease is defined by the association of microcephaly with nephrotic syndrome. In this study, the phenotypes of patients with WDR73 mutations are homogenous concerning neurological features, and are heterogeneous with regards to the renal defects. Thus, WDR73 mutations are responsible for a subset of particular patients affected with Galloway-Mowat syndrome. The WDR73 gene encodes WDR73, a WD-40 containing protein of unknown function. Our studies demonstrated that this protein is expressed in both neurons and podocytes in human tissues. We demonstrated that in undifferentiated cells, WDR73 is weakly expressed in the cytosol, while strong expression and relocalization to the spindle pole, microtubule asters and in the cleavage furrow occur during mitosis. Patient fibroblasts and WDR73-depleted podocytes displayed defects in nuclear morphology, which was associated with a decrease in cell survival in patient fibroblasts. Furthermore, we showed that patient fibroblasts and differentiated WDR73-depleted podocytes harbored an atypical morphology associated with a disorganized microtubule network, suggesting microtubule polymerization defects. Our functional studies demonstrated that WDR73 is crucial in both cell survival and microtubule polymerization in neurons and podocytes. The final part of my PhD work focused on the characterization of a missense mutation in the TRIM3 gene R28W identified by whole exome sequencing in a non consanguineous family with autosomal dominant focal segmental glomerulosclerosis. TRIM3 encodes TRIM3, an E3 ubiquitin-ligase that plays a role in transferrin endosomal recycling, and in microtubule trafficking via KIF21B, one of its known partners. Interestingly, the polymorphism V801M in ACTN4 co-segrates with the disease. Furthermore, mutations in this gene were already incriminated in autosomal dominant cases of HSF. (...)

L’étude des formes familiales de syndrome néphrotique (SN) ou de protéinurie glomérulaire avec lésions histologiques de hyalinose segmentaire et focale (HSF) a permis d’incriminer plus d’une vingtaine de gènes, majoritairement exprimés par le podocyte, cellule principale de la barrière de filtration glomérulaire (BFG). Parmi ces gènes, près d’une dizaine code des régulateurs du cytosquelette d’actine démontrant ainsi le rôle central de la plasticité et de l’architecture du podocyte dans le fonctionnement du filtre glomérulaire. L’ensemble de ces travaux a permis de définir une nouvelle catégorie de maladies nommées podocytopathies héréditaires. Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation de plusieurs gènes (TTC21B, WDR73, TRIM3), dont nous avons identifié des mutations dans des cas de podocytopathies héréditaires isolées ou syndromiques. Les résultats du premier volet de ma thèse ont montré que la mutation faux sens p.P209L dans le gène TTC21B induit à l’état homozygote une nouvelle entité clinique associant à la fois une atteinte glomérulaire et une atteinte tubulaire. TTC21B code l’IFT139 (intraflagellar transport protein 139), une protéine impliquée dans le transport protéique antérograde dans le cil primaire, un organite présent à la surface de la plupart des cellules épithéliales. Ces résultats étaient inattendus car l’identification de mutations dans un gène codant une protéine ciliaire n’avait jamais été démontrée auparavant dans des cas de podocytopathies héréditaires, et surtout, il ne semblait pas exister de cil primaire à la surface des podocytes matures. Effectivement, nous avons montré que le cil primaire est présent dans les podocytes humains indifférenciés, mais disparait au cours de la différenciation. Nos résultats ont permis de comprendre l’apparente contradiction entre la survenue d’une pathologie glomérulaire relativement tardive (protéinurie et SN à l’adolescence) et l’absence de cil dans le podocyte mature. En effet, nous avons montré que la mutation p.P209L est une mutation hypomorphe qui induit des défauts mineurs dans la fonction ciliaire, alors qu’elle provoque, dans le podocyte différencié, une déstructuration importante du réseau d’actine et de microtubules du podocyte. Cette étude montre que la protéine ciliaire IFT139, par sa fonction extra-ciliaire, permet de réguler la dynamique des microtubules. Dans le deuxième volet de mon projet, en collaboration avec l’équipe de D Bonneau (Angers), nous avons identifié des mutations tronquantes dans le gène WDR73, dans deux familles non apparentées présentant un syndrome de Galloway-Mowat (SGM), pathologie de transmission autosomique récessive, très hétérogène cliniquement, associant SN et microcéphalie. Ces travaux ont permis d’identifier le premier gène impliqué dans le SGM, dans un sous-groupe de patients présentant un phénotype neurologique très homogène (microcéphalie post-natale, atrophie corticale avec atrophie cérébelleuse majeure, déficience intellectuelle très sévère), alors que l’atteinte glomérulaire est très variable. Ce gène code WDR73, une protéine à motifs WD40. Nos travaux ont montré que la protéine est exprimée dans les neurones du système nerveux central, en particulier dans les cellules de Purkinje du cervelet et dans les podocytes. Des études fonctionnelles nous ont permis de montrer que WDR73 est impliquée dans la survie cellulaire, puisqu’en son absence, une apoptose accrue est observée dans les fibroblastes de patients. De plus, elle est également nécessaire au maintien de la dynamique des microtubules dans les fibroblastes et dans les podocytes différenciés, alors qu’elle ne semble pas avoir de rôle dans la régulation de l’actine. (...) / The genetic study of familial forms of nephrotic syndrome or proteinuria with focal segmental glomerulosclerosis has permitted the identification of 30 causal genes, mainly expressed in the podocyte, which is the principal actor of the glomerular filtration barrier (GFB). Among those genes, approximately ten encode actin cytoskeleton regulators and components, thus highlighting the dramatic role of the podocyte architecture and plasticity in the function of the GFB. During the last decade, all the accumulating results, has made a new category of disease called hereditary podocytopathies. The aim of my thesis project was to characterize the effect of mutations in three candidate genes (TTC21B, WDR73, WDR73), identified by whole exome sequencing in isolated or syndromic podocytopathies. In the first part of my project, we found a homozygous missense mutation (p.P209L) in TTC21B, which encodes a ciliary gene named Intraflagellar transport protein IFT139. This protein ensures the trafficking of components from the tip to the base of the primary cilium, which is an organelle present on most mammalian epithelial cells. These results were unexpected because until now, the existence of the primary cilium was unknown. Our work demonstrates the presence of the primary cilium in the human immature podocyte that disappears once podocytes have differentiated. We also showed that IFT139 localized at the basal body and then relocalized along the complex microtubule network of differenciated cells. We showed that the hypomorphic mutation p.P209L causes minor ciliary defects in undifferentiated cells that are not responsible for the glomerular phenotype. Indeed, the glomerular lesions are rather due to drastic damage in actin and, microtubular dysregulation, found in differentiated podocytes. The second part of my thesis aimed to characterize the effects of truncating mutations identified in the WDR73 gene, found in two families. WDR73 is the first gene identified in Galloway Mowat syndrome by whole exome sequencing combined with homozygous mapping. This rare disease is defined by the association of microcephaly with nephrotic syndrome. In this study, the phenotypes of patients with WDR73 mutations are homogenous concerning neurological features, and are heterogeneous with regards to the renal defects. Thus, WDR73 mutations are responsible for a subset of particular patients affected with Galloway-Mowat syndrome. The WDR73 gene encodes WDR73, a WD-40 containing protein of unknown function. Our studies demonstrated that this protein is expressed in both neurons and podocytes in human tissues. We demonstrated that in undifferentiated cells, WDR73 is weakly expressed in the cytosol, while strong expression and relocalization to the spindle pole, microtubule asters and in the cleavage furrow occur during mitosis. Patient fibroblasts and WDR73-depleted podocytes displayed defects in nuclear morphology, which was associated with a decrease in cell survival in patient fibroblasts. Furthermore, we showed that patient fibroblasts and differentiated WDR73-depleted podocytes harbored an atypical morphology associated with a disorganized microtubule network, suggesting microtubule polymerization defects. Our functional studies demonstrated that WDR73 is crucial in both cell survival and microtubule polymerization in neurons and podocytes. The final part of my PhD work focused on the characterization of a missense mutation in the TRIM3 gene R28W identified by whole exome sequencing in a non consanguineous family with autosomal dominant focal segmental glomerulosclerosis. TRIM3 encodes TRIM3, an E3 ubiquitin-ligase that plays a role in transferrin endosomal recycling, and in microtubule trafficking via KIF21B, one of its known partners. Interestingly, the polymorphism V801M in ACTN4 co-segrates with the disease. Furthermore, mutations in this gene were already incriminated in autosomal dominant cases of HSF. (...)

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13067号 / 論医博第2122号 / 新制||医||1019(附属図書館) / 33218 / (主査)教授 長船 健二, 教授 松田 道行, 教授 岩井 一宏 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13193号 / 論医博第2157号 / 新制||医||1030(附属図書館) / (主査)教授 浅野 雅秀, 教授 岩井 一宏, 教授 小川 修 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

The role of podocytes in glomerular permselectivity is tightly associated with their intricate morphology, featuring interdigitating foot processes from adjacent cells. The actin cytoskeleton is an integral component of podocyte foot processes and is regulated by a number of proteins expressed in podocytes. Rho-family of small GTPases are known key regulators of the actin cytoskeleton. This study, investigated the role of Rac1 in podocytes, using conditionally immortalized mouse podocytes (MPs). We studied Rho-GTPase activities and morphology/cytoskeleton of differentiating mouse podocytes stably expressing nephrin. We also studied the impact of transfection of various Rho-GTPase mutants and IQGAP1 mutants. We demonstrated that nephrin expression potentiates and sustains Rac1 activity during the differentiation process. We showed that Rac1 contributes to process formation in differentiating MPs and may have a similar role in vivo when podocytes are recovering from injuries.

Le rein est un organe considéré comme statique, montrant une capacité régénérative très limitée. Les cellules épithéliales du glomérule, appelées podocytes, sont des cellules hautement différenciées qui possèdent des extensions cytoplasmiques indispensables à leur fonction de filtration du sang. Ces cellules sont particulièrement impactées dans les pathologies rénales chroniques, et il apparaît primordial de développer des stratégies thérapeutiques permettant de restaurer leur fonction. Une des approches thérapeutiques qui semble des plus prometteuses consiste en le remplacement des cellules lésées par des cellules fonctionnelles. Dans cette approche de médecine régénérative, les capacités endogènes de régénération des organes sont exploitées et stimulées afin de permettre un rétablissement des tissus constituant les organes. Bien que les podocytes montrent un potentiel de prolifération et de régénération limité, un moyen unique de stimuler ces cellules consiste en la surexpression de la sous-unité protéique TERT de la télomérase. En effet, la surexpression transitoire de TERT dans le rein adulte induit la dédifférenciation et la prolifération des podocytes, suivi par la régénération de ces cellules. L’objectif de mon travail de thèse était d’identifier les voies de signalisation moléculaires ciblées par TERT lors de la reprogrammation des podocytes en cellules dédifférenciées et prolifératives. Le travail réalisé a permis de mettre en évidence les facteurs moléculaires impliqués dans l’initiation de ce processus ainsi que les effecteurs de la reprogrammation ciblés par TERT. De plus, l’analyse des voies de signalisation dérégulées par TERT montre que l’interaction et le remodelage de la matrice extracellulaire représentent des événements très précoces lors de la reprogrammation. Un autre objectif de ma thèse consistait en l’élucidation des mécanismes cellulaires mis en œuvre lors de la régénération des podocytes suite à la surexpression transitoire de TERT. Aussi, les résultats obtenus grâce à l’emploie d’une approche non biaisée de traçage cellulaire a révélé la présence de cellules progénitrices dans le néphron du rein adulte capables de s’amplifier de manière clonale afin de régénérer les podocytes de manière efficace et rapide. Ces résultats présentent un mécanisme cellulaire encore jamais appréhendé, menant à la régénération efficace des podocytes dans le rein des mammifères adultes. Ces données représentent une véritable percée des connaissances au regard de l’existence et de la fonction des progénitures rénaux, ouvrant la voie à des stratégies thérapeutiques permettant d’améliorer la régénération cellulaire de patients souffrant de maladies rénales chroniques. / In mammals, the kidney is considered a static organ with a limited regenerative capacity. Glomerular epithelial cells, named podocytes, are highly differentiated cells harboring cytoplasmic extensions essential for their function of blood filtration. These cells appear to be the weak link in chronic kidney diseases, rising up the necessity to develop therapeutic strategies to restore their function. One promising therapeutic approach consist in the replacement of impaired cells with fully functional cells. The aim of this regenerative medicine approach is to stimulate the endogenous regenerative capacity to reestablish the functionality of tissues within the organ. Although podocytes display a limited regenerative capacity, transient overexpression of the telomerase protein component TERT appears to be an efficient way to stimulate this capacity in vivo. Indeed, TERT exhibits potent effects on kidney podocytes in steady state conditions resulting in acute cell cycle entry and loss of differentiation. Such reprogramming of kidney podocytes is followed by replenishment of those cells by functional podocytes upon TERT withdrawal. TERT effects on kidney podocytes are independent of its role in telomere synthesis, and rather rely on its ability to modulate signaling pathways. My thesis objective was to identify the molecular mechanisms targeted by TERT non-canonical activity upon initiation and progression of podocyte reprogramming. Analysis of the molecular signaling modulated by TERT show that interaction and remodeling of the extracellular matrix represent early events of the reprogramming process. Those results highlighting TERTtarget genes and pathways upon in vivo cellular change of fate provide precious knowledge for unprecedented therapeutic strategies that aim to target TERT non-canonical activity in kidney cancers and other epithelial cancers more broadly. The second objective of my thesis was to elucidate the cellular mechanisms that support podocytes regeneration upon transient overexpression of TERT. Using podocyte lineage tracing approaches, we found that renewed podocytes observed following a TERT pulse are not derived from initially present podocytes. Using an unbiased lineage tracing approach, we further found that clonal amplification of progenitor cells is the source of podocyte replenishment in this system. Those results unveil a cellular mechanism that have never been apprehended previously, which activation lead to efficient podocyte regeneration in the adult mammalian kidney. Those data represent a real breakthrough in knowledge regarding kidney progenitor cells existence and function, and have profound implications for the development of therapeutic strategies that aim to maintain/enhance regeneration in patients with kidney diseases and in the elderly.

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A common feature of glomerular disease is a protein leak into the urine. Proteinuria occurs in kidney disease and is an important risk factor for cardiovascular disease (CVD). ET‐1 is a potent vasoconstrictor/pressor peptide that is up‐regulated in CVD and many forms of inflammatory renal diseases. The actions of ET‐1 are mediated via two G‐protein coupled receptors, the ETAR which serves primarily in the pro‐hypertensive actions of ET‐1 and is often considered as the main pathological receptor subtype, with the ETBR serving to clear circulating ET‐1. Antagonism of one or both of receptors has been shown to be of clinical benefit in the treatment of hypertension. This research demonstrated a beneficial effect of selective ETAR antagonism using Sitaxsentan in a rat model of GN. ETAR blockade reduced blood pressure and importantly reduced glomerular inflammation as assessed by glomerular macrophage (Mϕ) infiltration. Further, we aimed to demonstrate that Mϕ, key mediators of inflammation are activated by ET‐1 to adopt a pro‐inflammatoy phenotype. However, early studies demonstrated that ET‐1 does not activate Mϕ as hypothesised. Mϕ were more phagocytic, and ET‐1 was chemokinetic for macrophages, an ETBR medicated event. ET‐1 was also removed by Mϕ, suggesting a potential regulatory role of Mϕ in the ET system. This phenomenon led to inclusion of additional in vivo studies to investigate the role of Mϕ in the regulation of ET‐1 and its pressor effects. These effects were investigated in a murine model of Mϕ ablation using CD11b‐DTR mice. These experiments determined in vivo that Mϕ ablation augments pressor responses to ET‐1, suggesting that Mϕ are required to regulate ET‐1. In vitro, Mϕ remove ET‐1 by several mechanisms involving proteolytic degradation of the peptide and ETBR mediated clearance, demonstrating a potential mechanism for the in vivo observation. Furthermore, proteinuria is believed to be due to damage or effacement of specialized visceral glomerular epithelial cells or podocytes. We identified in vitro that the ETAR mediates ET‐1 induced human podocyte cell effacement by actin cytoskeleton aberrations and slit‐diaphragm protein down-regulation, ET‐1 and pro‐inflammatory cytokine production. This thesis provides evidence to support our initial hypotheses that selective ETAR antagonism ameliorates proteinuric renal disease via its effects on podocytes and macrophages. Continued studies both in vitro and in vivo will strengthen the body of evidence to promote the therapeutic use of ETR antagonists in inflammatory renal disease.

FSGS (focal segmental glomerulosclerosis) is a pathologic pattern that affects the glomerulus of the kidneys and is associated with progression toward end-stage kidney disease. It is characterized by destruction of the glomerular filtration system and replacement by scar tissue, which leads to chronic renal failure. An increase in glomerular capillary pressure may be an important factor in glomerulosclerosis. The podocyte is a major structural component of the filtration barrier. Since podocytes have an important role in maintaining the structural and functional integrity of glomerular filtration, a chronic increase in glomerular filtration pressure could ultimately damage and compromise the podocyte filtration apparatus. The segmental nature of FSGS suggests that podocyte damage may only occur at specific regions in the glomerulus. This poses the question as to whether differences in podocyte function, assessed by gene expression, may be dependent on their location in the glomerulus, and these regional differences might be responsible for FSGS development. Consequently, in order to evaluate this hypothesis there is a need to selectively isolate podocytes from various regions in a glomerulus. Therefore, the objective of this study was to determine the feasibility of selectively isolating podocyte cells from other renal cells using laser capture microdissection (LCM), and analyzing gene expression in these isolated cells using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). If feasible, this method could be used to examine isolated cells for unique podocyte gene expression patterns that vary regionally throughout the glomerulus, and identify potential molecular and cellular mechanisms responsible for the initiation and progression of FSGS. Such information could then be used to identify new and pharmacologically accessible molecular targets. The specific goals of this project were to: 1) determine the feasibility of employment of the LCM system in the Boston University Department of Pathology for the capture of isolated mouse podocytes. 2) determine optimal tissue preservation and preparation methods for laser capture and mRNA analysis of isolated podocytes; and 3) determine the minimum number of isolated podocytes required to analyze gene expression using qRT-PCR. The results show that 1) liquid nitrogen was the preferred method of tissue freezing; 2) the use of Histogene stain improved cell identification during laser capture; 3) the LCM instrument parameters required for selective podocyte capture were identified; and 4) RNA quality obtained from the LCM samples was suboptimal. These results indicate that the possibility of using LCM for regional podocyte isolation and gene expression analysis is quite promising, and further optimization of the technique will likely yield an important new method for the study of kidney disease pathogenesis.