Abstract Oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC) is the most common cancer of the oral cavity. The 5-year mortality of OTSCC remains at about 50%. The tumor microenvironment (TME) is now recognized as an important factor in cancer progression and metastasis, as well as a tool for prognostication. The aim of this study was to elucidate the roles of TME hypoxia and soluble factors on cancer cell migration and invasion, and the prognostic value of two extracellular matrix (ECM) molecules: tenascin-C (TNC) and fibronectin (FN). Hypoxia was studied using oral squamous cell carcinoma cells in migration and invasion assays. Invasion assays were carried out using a 3D-myoma invasion method. Similarly, the effect of soluble factors as well as ECM alterations were studied using the myoma model: the effect of soluble factors was studied by rinsing the myoma discs prior to experiments, and ECM alterations by lyophilizing and rehydrating. ECM was further studied by analyzing the prognostic value of TNC and FN from OTSCC samples. The effect of hypoxia was shown to be OTSCC cell line dependent: the effect of hypoxia on migration and invasion was increased in aggressive cell lines. Additionally, the response to hypoxia was altered in rinsed tissue. Tissue rinsing media were analyzed and factors affecting cell motility were found. The TME was found to be pivotal for cancer invasion: invasion was impaired in non-neoplastic tissue. Furthermore, changes in the ECM by lyophilization and rehydration led to a change in the invasion mechanism. High expression of stromal TNC and FN were excellent prognosticators in early-stage OTSCC. In conclusion, the present study highlighted the role of various TME components in cancer cell invasion as well as prognostication in OTSCC. Additionally, this study provided feasible tools for more precise diagnosis of early-stage OTSCC. / Tiivistelmä Liikkuvan kielen levyepiteelikarsinooma (OTSCC) on suuontelon yleisin syöpä. Viiden vuoden kuolleisuus OTSCC:an on edelleen noin 50 %. Kasvaimen mikroympäristön (TME) tiedetään nykyään olevan tärkeässä roolissa syövän kehityksessä ja etäpesäkkeiden muodostuksessa, sekä tarjoavan työkaluja ennusteiden laadintaan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää TME:n hypoksian ja liukoisten tekijöiden vaikutusta syöpäsolujen liikkumiseen ja invaasioon ympäröivään kudokseen, sekä tutkia kahden solunulkoisen matriksin (ECM) proteiinin, tenaskiini-C:n (TNC) ja fibronektiinin (FN), vaikutusta OTSCC:n ennusteeseen. Hypoksian vaikutusta tutkittiin käyttäen suun levyepiteelikarsinoomasoluja liikkuvuus- ja invaasiokokeissa. Invaasiokokeissa hyödynnettiin kolmiulotteista ihmisen myoomaan perustuvaa invaasiomallia. Myös liukoisten tekijöiden ja ECM:n muutosten vaikutusten tutkimisessa käytettiin myoomamallia: liukoisten tekijöiden vaikutusta tutkittiin huuhtomalla myoomakiekot ennen niiden käyttämistä, ja ECM:n muutosten vaikutusta kylmäkuivaamalla ja uudelleen nesteyttämällä myoomakiekot. ECM:ia tutkittiin myös analysoimalla TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden merkitystä OTSCC:n ennusteessa. Hypoksian vaikutus osoittautui solulinjariippuvaiseksi: hypoksia lisäsi kielisyöpäsolujen liikkuvuutta ja invaasiota eniten aggressiivisimmilla solulinjoilla. Lisäksi solujen vaste hypoksialle oli erilainen huuhdotussa kudoksessa. Huuhteluliuos analysoitiin ja siitä löydettiin solujen liikkumiseen vaikuttavia tekijöitä. TME:n havaittiin olevan ratkaisevassa roolissa syöpäsolujen invaasiossa: syöpäsolut eivät kyenneet invasoitumaan lainkaan ei-neoplastiseen kudokseen. Lisäksi muutosten ECM:ssä havaittiin johtavan muutoksiin solujen käyttämässä invaasion mekanismissa. Strooman TNC:n ja FN:n värjäytyvyyden todettiin olevan erinomaisia ennustekijöitä aikaisen vaiheen OTSCC:ssa. Tiivistettynä voidaan todeta, että tämä tutkimus alleviivasi useiden TME:n komponenttien vaikutusta syövän invaasiolle ja ennusteelle OTSCC:ssä. Lisäksi se tarjoaa käyttökelpoiset työkalut (TNC ja FN) tarkemmalle diagnostiikalle aikaisen vaiheen OTSCC:ssä.

Abstract Venous malformations (VMs) are localized defects in vascular morphogenesis which can seriously impede or even threaten the patient’s life. VMs are characterized by enlarged, torturous vein-like channels lined by unevenly distributed smooth muscle cells. A large number of mutations in the endothelial TIE2 receptor tyrosine kinase have been found from more than half of the lesions screened, thus providing a common genetic cause. TIE2 has a crucial role in vascular development, remodeling and quiescence. However, the molecular and cellular abnormalities caused by TIE2-mutations in endothelial cells and how they relate to VM formation have been unknown. The aim of this study was to examine how VM-specific mutations affect the molecular characteristics of TIE2-receptor downstream signaling and cellular functions. Because no effective treatment has been available for VMs, a better understanding of the molecular basis of their pathology should enable the development of more potent and non-invasive treatments as well as provide a better understanding of vascular morphogenesis in general. The results demonstrate that the TIE2-VM forms have both common and specific effects on TIE2 and the endothelial cells (ECs) expressing them. Mutation-induced TIE2 autoactivation leading to loss of normal EC monolayer organization due to extracellular matrix (ECM) fibronectin deficiency was found to be a common change. This was shown to occur through chronic activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, which also caused activation of the proteolytic plasminogen system. Also, most mutations altered TIE2 trafficking and angiopoietin ligand regulated TIE2 functions, albeit through different mechanisms. Using RNA-screening we showed that the most common sporadic TIE2-VM mutation dysregulates genes affecting vascular development, cell migration and ECM remodeling. PDGFB, a major attractant of vascular mural cells, was found to be strongly attenuated due to chronic activation of Akt, which also increases EC survival, by the TIE2 mutant receptors. To conclude, the results in this thesis reveal genetic, molecular and cellular alterations which may potentiate VM formation. This data provides new information on the pathological mechanisms behind abnormal vascular morphogenesis and should assist the development of new molecular treatment strategies for VM patients. / Tiivistelmä Laskimoepämuodostumat ovat paikallisia verisuoniston kehityksen häiriöitä. Riippuen niiden koosta ja anatomisesta sijainnista ne voivat aiheuttaa merkittävää haittaa. Epämuodostumat koostuvat laajentuneista, laskimonkaltaisista verisuonista, joissa sileiden lihassolujen kerros on puutteellisesti järjestäytynyt. Yli puolessa tutkituista laskimoepämuodostumista havaitaan mutaatioita verisuonten sisäpinnan endoteelisoluissa ilmenevässä TIE2 reseptorityrosiinikinaasissa, joka säätelee verisuonten kehitystä, muokkausta ja fysiologista toimintaa. TIE2-mutaatioiden aiheuttamia molekyyli- ja solutason muutoksia tai niiden yhteyttä epämuodostumien syntyyn ei ole aikaisemmin tunnettu. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten laskimoepämuodostumista löydetyt mutaatiot vaikuttavat TIE2-reseptorin toimintaan molekyyli- ja solutasolla sekä TIE2-reseptorista alkavaan solunsisäiseen viestintään. Koska pysyvää hoitomuotoa laskimoepämuodostumille ei tunneta, voisi tieto niiden taustalla olevista patologisista mekanismeista edesauttaa parempien, ei-kajoavien hoitomuotojen kehittämisessä ja antaa myös yleisesti uutta tietoa verisuoniston kehityksestä. Väitöskirjan tulokset osoittavat, että mutaatiot vaikuttavat TIE2-reseptoriin ja sitä ilmentäviin endoteelisoluihin mutaatioille yhteisillä sekä mutaatiokohtaisilla tavoilla. Mutaatioille tyypillinen TIE2-reseptorin ligandista riippumaton aktivaatio aiheutti aktivaation nousun myös TIE2:sta alavirtaan olevissa viestinvälittäjissä. Tämä puolestaan johti fibronektiini-proteiinin häviämiseen soluväliaineesta, sileitä lihassoluja säätelevän PDGFB-kasvutekijän ilmenemisen laskuun ja solujen ohjelmoidun solukuoleman vähenemiseen. Useimmat tutkitut mutaatiot muuttivat myös TIE2-reseptorin sijaintia soluissa häiriten TIE2:n angiopoietiini-ligandien säätelemiä toimintoja usean eri mekanismin kautta. Transkriptomin laajuiset RNA-tutkimukset osoittivat monien verisuonten kehitykseen, solujen liikkumiseen ja soluväliaineen muokkaukseen liittyvien geenien ilmentymisen muuttuneen. Lopputuloksena tutkimus paljasti geeni-, molekyyli-, ja solutason muutoksia, jotka saattavat vaikuttaa laskimoepämuodostumien syntyyn. Tulokset antavat lisätietoa sairautta aiheuttavista mekanismeista verisuoniston kehityksen häiriöiden taustalla ja ovat hyödyksi kehitettäessä uusia lääkkeitä laskimoepämuodostumien molekulaarisia hoitoja varten.