In the process of pre-mRNA splicing introns are removed from pre-mRNA and exons are joined together. Current studies show, that about 95 % of genes, which contain more than two exons, can undergo alternative splicing. In this process some exons are included in or excluded from the final mRNA. Majority of pre-mRNA splicing take place co- transcriptionaly at this time RNA polymerase II is still attached to pre-mRNA. Alternative splicing is complex process that takes place in a close proximity of DNA and histones that might modulate alternative splicing decisions. Futher studies have validated fibronectin gene (FN1) and his alternative exons EDA and EDB (extra domain A and B) as suitably model for studying alternative splicing. Study using FN1 minigene reporter system, which is composed from EDA exon and two surrounding introns and exons, has proved that insertion of transcription enhancer SV40 infront of promotor, the level of EDA inclusion is decreased. So far, has not been prooved if this mechanism can function in real genome context and if distal transcription elements can influence alternative splicing. In this study, we have predicted transcription enhancer for FN1 gene by using The Ensemble Regulatory Build and FANTOM 5. The predicted transcription enhancer, is located 23,5 kbp upstream of TSS...

In the process of pre-mRNA splicing introns are removed from pre-mRNA and exons are joined together. Current studies show, that about 95 % of genes, which contain more than two exons, can undergo alternative splicing. In this process some exons are included in or excluded from the final mRNA. Majority of pre-mRNA splicing take place co- transcriptionaly at this time RNA polymerase II is still attached to pre-mRNA. Alternative splicing is complex process that takes place in a close proximity of DNA and histones that might modulate alternative splicing decisions. Futher studies have validated fibronectin gene (FN1) and his alternative exons EDA and EDB (extra domain A and B) as suitably model for studying alternative splicing. Study using FN1 minigene reporter system, which is composed from EDA exon and two surrounding introns and exons, has proved that insertion of transcription enhancer SV40 infront of promotor, the level of EDA inclusion is decreased. So far, has not been prooved if this mechanism can function in real genome context and if distal transcription elements can influence alternative splicing. In this study, we have predicted transcription enhancer for FN1 gene by using The Ensemble Regulatory Build and FANTOM 5. The predicted transcription enhancer, is located 23,5 kbp upstream of TSS...

Die Untersuchung von Zell-Material-Wechselwirkungen ist bedeutsam für die Entwicklung innovativer Biomaterialien, wobei aus biophysikalischer Sicht der Einfluss mechanischer Eigenschaften auf das Zellverhalten, d.h., die Mechanotransduktion, von besonderem Interesse ist. Für diese Dissertation wurden humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene zur Adhäsion auf Polyacrylamidhydrogele (PAA-Hydrogele) gegeben, die mit einer Maleinsäurecopolymer-Beschichtung versehen waren. Für Experimente unter veränderlichen Substrateigenschaften wurden die Steifigkeit der PAA-Hydrogele und die Ligandenaffinität der Beschichtung variiert. Der erste Teil der Dissertation umfasste die Charakterisierung der beschichteten PAA-Hydrogele. Dafür wurde der Elastizitätsmodul gemessen und die Adsorption von Fibronektin untersucht. Im zweiten Teil der Dissertation wurden die PAA-Hydrogele in der Zellzugkraftmikroskopie während der initialen Zelladhäsion (2 h) verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass zwar die finale Zellfläche unabhängig von den Substratparametern war, aber die Ausbreitung von Zellen mit zunehmender Steifigkeit und Ligandenaffinität schneller ablief. Außerdem waren der Anstieg und die Plateauwerte der Zellzugkräfte auf steiferen Substraten größer. Die Steifigkeitsabhängigkeit lässt sich aus der Dehnungsversteifung des Aktinzytoskeletts unter Wirkung einer Spannung erklären. Eine Zunahme der Ligandenaffinität führte ebenfalls zu einer schnelleren Zunahme und größeren Plateauwerten von Gesamtzellzugkräften. Diese Beobachtung kann der Zunahme von Reibungskräften zugesprochen werden. Im letzten Teil der Dissertation sollten die biophysikalischen Ergebnisse durch die Untersuchung intrazellulärer Signalprozesse zusätzlich unterlegt werden. Dafür wurde die Entwicklung von Adhäsionsstellen durch eine immunzytochemische Färbung untersucht. Obwohl diese aufgrund der technischen Herausforderungen keine umfassenden Aussagen liefern konnte, deuteten sich einige Korrelationen, z.B. eine schnellere Entwicklung der Adhäsionsstellen auf steiferen Substraten, an. Die Ergebnisse der Dissertation ordnen sich in den aktuellen Forschungsstand zur Mechanotransduktion von Zellen ein und konnten in Bezug auf die Adhäsionsdynamik neue Erkenntnisse beisteuern. Vor allem der Stellenwert dissipativer Beiträge zu Zell-Substrat-Wechselwirkungen (z.B. Ligandenreibung) wurde unterstrichen. Diese sind in der Entwicklung neuer Biomaterialien mit spezifischen viskoelastischen Eigenschaften von besonderer Bedeutung. / The investigation of cell-substrate-interactions is of great importance for the development of innovative biomaterials. The influence of thematerials mechanical properties on cells and their functions, i. e., the process of mechanotransduction, is of particular interest from a biophysical point of view. In this dissertation human umbilical cord vein endothelial cells were seeded onto polyacrylamide hydrogels which had been modified by a maleic acid copolymer coating. To tune the mechanical properties of the substrate the hydrogels’ stiffness and the affinity of the coatings to the adhesion ligand fibronectin were variied. The first part of the dissertation is concerned with the characterization of the coated polyacrylamide hydrogels. The hydrogels’ Young’s modulus was measured and the adsorption of fibronectin was investigated. In the second part of the dissertation these cell culture scaffolds were used for cell traction force microscopy during the first two hours of cell adhesion. Although maximum cell area was not influenced by substrate parameters, cell spreading was faster for higher stiffness and higher ligand affinity. Traction force increase as well as plateau forces were higher on stiff substrates. The dependence of the dynamics of area and traction force on stiffness and their respective magnitudes after saturation could be related to properties of the actin cytoskeleton under stress. The increase in ligand affinity also led to a faster increase and higher mean plateau values of the total cell force. This observation was assigned to increasing friction forces between ligands and polymer coating. In the last part of the dissertation possible correlations between cell traction forces and intracellular signalling processes were examined. The development of adhesion sites during early cell adhesion was investigated by immunocytochemical staining. Due to technical reasons no comprehensive investigation could be realized, but nevertheless some correlations were observed, such as a faster adhesion site formation with higher stiffness. The results of this dissertation add to the current state of research regarding mechanotransduction of cells and yield new findings regarding to cell adhesion dynamics. Most notably viscous contributions to cell-substrate-interactions (i.e., ligand friction) were shown to influence cell behavior. This highlights that a thorough understanding of viscous processes is of utmost significance for the development of new biomaterials with specific viscoelastic properties.

Der Erfolg neuer Strategien in der Regenerativen Medizin und im Tissue Engineering hängt maßgeblich von einem gut entwickeltem vaskulären Netzwerk ab, welches die auf den Implantaten wachsenden Zellen und Gewebe versorgen. Oberflächeneigenschaften der Implantate sowie die Präsentation verschiedener Liganden für extrazelluläre Matrixproteine spielen bei der Besiedlung der Implantate, als auch bei der Bildung versorgender Blutgefäße durch die Endothelzellen eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit konnte durch Variation der Anbindungsstärke (kovalent oder physisorptiv) des extrazellulären Matrixproteins Fibronektins an die MSA-Copolymere der Einfluss des Aufbaus der extrazellulären Matrix auf das Differenzierungsverhalten der Endothelzellen gezeigt werden. Auch die initiale Konzentration von Adhäsionsproteinen an der Substratoberfläche zeigte sich bedeutend für das Verhalten der Zellen. Optimal für eine gute Adhäsion, native Entwicklung und Kapillarbildung der Endothelzellen war die stabile (kovalente) Anbindung weniger Adhäsionsproteine (hier Fibronektin) an die Substratoberfläche, so dass die Zellen problemlos adhärieren konnten. Erfolgte die weiter Proteinadsorption an die Oberflächen in einem nativen Zustand (hier auf den hydrophilen Oberflächen) so waren die Endothelzellen in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu reorganisieren und ein dem in vivo Zustand ähnlicher Aufbau der extrazellulären Matrix konnte realisiert werden. Dies ermöglichte den Zellen wiederum ein natürliches Verhalten. Die Ausbildung einer moderaten Anzahl von Adhäsionsstellen der Zellen, sowie der in vivo ähnliche Aufbau der Adhäsionspunkte ermöglichte den Zellen einen eher lockeren Kontakt zum Substrat. Daher waren sie sehr flexibel in ihrer Morphologieanpassung. Unter diesen Bedingungen war es möglich, dass die Endothelzellen bei Stimulierung der Angiogenese kapillarähnliche Strukturen ausbildeten. Die Verwendung dreidimensionaler Zellkulturträger zeigte eine Unterstützung der Kapillarbildung der Endothelzellen in Abhängigkeit unter den beschrieben Bedingungen. / The success of tissue engineering strategies using artificial scaffolds crucially depends on a controlled formation of well-developed vascular networks in growing tissues. The presentation of extracellular matrix ligands on scaffolds is often envisioned as an appropriate strategy to support capillary formation. We show that the control of primary coupling mode — covalent versus physisorbed — as well as of secondary interactions of cell-secreted extracellular matrix proteins have a strong impact on endothelial cell development. A set of maleic anhydride copolymer thin films was used as planar model substrates. They exhibit a switchable mode of primary matrix coupling combined with a gradation of secondary matrix–substrate interactions due to a variation of surface hydrophobicity and polarity. We found that the cells adhere in a more native state at a low amount of covalent primary coupled fibronectin ligands in conjunction with weak interactions of secondarily adsorbed adhesion ligands on hydrophilic surfaces. These substrates allow for a formation of capillary-like networks of endothelial cells. High ligand densities and strong secondary hydrophobic interactions inhibit a pronounced capillary formation. The composition and structure of the formed extracellular matrix correlates well with the specific integrin expression pattern. From these results it is concluded that the formation of blood capillaries in artificial scaffolds can be triggered by controlling primary and secondary coupling of cell adhesion ligands to implant materials. 2

Die Untersuchung von Zell-Material-Wechselwirkungen ist bedeutsam für die Entwicklung innovativer Biomaterialien, wobei aus biophysikalischer Sicht der Einfluss mechanischer Eigenschaften auf das Zellverhalten, d.h., die Mechanotransduktion, von besonderem Interesse ist. Für diese Dissertation wurden humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene zur Adhäsion auf Polyacrylamidhydrogele (PAA-Hydrogele) gegeben, die mit einer Maleinsäurecopolymer-Beschichtung versehen waren. Für Experimente unter veränderlichen Substrateigenschaften wurden die Steifigkeit der PAA-Hydrogele und die Ligandenaffinität der Beschichtung variiert. Der erste Teil der Dissertation umfasste die Charakterisierung der beschichteten PAA-Hydrogele. Dafür wurde der Elastizitätsmodul gemessen und die Adsorption von Fibronektin untersucht. Im zweiten Teil der Dissertation wurden die PAA-Hydrogele in der Zellzugkraftmikroskopie während der initialen Zelladhäsion (2 h) verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass zwar die finale Zellfläche unabhängig von den Substratparametern war, aber die Ausbreitung von Zellen mit zunehmender Steifigkeit und Ligandenaffinität schneller ablief. Außerdem waren der Anstieg und die Plateauwerte der Zellzugkräfte auf steiferen Substraten größer. Die Steifigkeitsabhängigkeit lässt sich aus der Dehnungsversteifung des Aktinzytoskeletts unter Wirkung einer Spannung erklären. Eine Zunahme der Ligandenaffinität führte ebenfalls zu einer schnelleren Zunahme und größeren Plateauwerten von Gesamtzellzugkräften. Diese Beobachtung kann der Zunahme von Reibungskräften zugesprochen werden. Im letzten Teil der Dissertation sollten die biophysikalischen Ergebnisse durch die Untersuchung intrazellulärer Signalprozesse zusätzlich unterlegt werden. Dafür wurde die Entwicklung von Adhäsionsstellen durch eine immunzytochemische Färbung untersucht. Obwohl diese aufgrund der technischen Herausforderungen keine umfassenden Aussagen liefern konnte, deuteten sich einige Korrelationen, z.B. eine schnellere Entwicklung der Adhäsionsstellen auf steiferen Substraten, an. Die Ergebnisse der Dissertation ordnen sich in den aktuellen Forschungsstand zur Mechanotransduktion von Zellen ein und konnten in Bezug auf die Adhäsionsdynamik neue Erkenntnisse beisteuern. Vor allem der Stellenwert dissipativer Beiträge zu Zell-Substrat-Wechselwirkungen (z.B. Ligandenreibung) wurde unterstrichen. Diese sind in der Entwicklung neuer Biomaterialien mit spezifischen viskoelastischen Eigenschaften von besonderer Bedeutung. / The investigation of cell-substrate-interactions is of great importance for the development of innovative biomaterials. The influence of thematerials mechanical properties on cells and their functions, i. e., the process of mechanotransduction, is of particular interest from a biophysical point of view. In this dissertation human umbilical cord vein endothelial cells were seeded onto polyacrylamide hydrogels which had been modified by a maleic acid copolymer coating. To tune the mechanical properties of the substrate the hydrogels’ stiffness and the affinity of the coatings to the adhesion ligand fibronectin were variied. The first part of the dissertation is concerned with the characterization of the coated polyacrylamide hydrogels. The hydrogels’ Young’s modulus was measured and the adsorption of fibronectin was investigated. In the second part of the dissertation these cell culture scaffolds were used for cell traction force microscopy during the first two hours of cell adhesion. Although maximum cell area was not influenced by substrate parameters, cell spreading was faster for higher stiffness and higher ligand affinity. Traction force increase as well as plateau forces were higher on stiff substrates. The dependence of the dynamics of area and traction force on stiffness and their respective magnitudes after saturation could be related to properties of the actin cytoskeleton under stress. The increase in ligand affinity also led to a faster increase and higher mean plateau values of the total cell force. This observation was assigned to increasing friction forces between ligands and polymer coating. In the last part of the dissertation possible correlations between cell traction forces and intracellular signalling processes were examined. The development of adhesion sites during early cell adhesion was investigated by immunocytochemical staining. Due to technical reasons no comprehensive investigation could be realized, but nevertheless some correlations were observed, such as a faster adhesion site formation with higher stiffness. The results of this dissertation add to the current state of research regarding mechanotransduction of cells and yield new findings regarding to cell adhesion dynamics. Most notably viscous contributions to cell-substrate-interactions (i.e., ligand friction) were shown to influence cell behavior. This highlights that a thorough understanding of viscous processes is of utmost significance for the development of new biomaterials with specific viscoelastic properties.

Der Erfolg neuer Strategien in der Regenerativen Medizin und im Tissue Engineering hängt maßgeblich von einem gut entwickeltem vaskulären Netzwerk ab, welches die auf den Implantaten wachsenden Zellen und Gewebe versorgen. Oberflächeneigenschaften der Implantate sowie die Präsentation verschiedener Liganden für extrazelluläre Matrixproteine spielen bei der Besiedlung der Implantate, als auch bei der Bildung versorgender Blutgefäße durch die Endothelzellen eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit konnte durch Variation der Anbindungsstärke (kovalent oder physisorptiv) des extrazellulären Matrixproteins Fibronektins an die MSA-Copolymere der Einfluss des Aufbaus der extrazellulären Matrix auf das Differenzierungsverhalten der Endothelzellen gezeigt werden. Auch die initiale Konzentration von Adhäsionsproteinen an der Substratoberfläche zeigte sich bedeutend für das Verhalten der Zellen. Optimal für eine gute Adhäsion, native Entwicklung und Kapillarbildung der Endothelzellen war die stabile (kovalente) Anbindung weniger Adhäsionsproteine (hier Fibronektin) an die Substratoberfläche, so dass die Zellen problemlos adhärieren konnten. Erfolgte die weiter Proteinadsorption an die Oberflächen in einem nativen Zustand (hier auf den hydrophilen Oberflächen) so waren die Endothelzellen in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu reorganisieren und ein dem in vivo Zustand ähnlicher Aufbau der extrazellulären Matrix konnte realisiert werden. Dies ermöglichte den Zellen wiederum ein natürliches Verhalten. Die Ausbildung einer moderaten Anzahl von Adhäsionsstellen der Zellen, sowie der in vivo ähnliche Aufbau der Adhäsionspunkte ermöglichte den Zellen einen eher lockeren Kontakt zum Substrat. Daher waren sie sehr flexibel in ihrer Morphologieanpassung. Unter diesen Bedingungen war es möglich, dass die Endothelzellen bei Stimulierung der Angiogenese kapillarähnliche Strukturen ausbildeten. Die Verwendung dreidimensionaler Zellkulturträger zeigte eine Unterstützung der Kapillarbildung der Endothelzellen in Abhängigkeit unter den beschrieben Bedingungen. / The success of tissue engineering strategies using artificial scaffolds crucially depends on a controlled formation of well-developed vascular networks in growing tissues. The presentation of extracellular matrix ligands on scaffolds is often envisioned as an appropriate strategy to support capillary formation. We show that the control of primary coupling mode — covalent versus physisorbed — as well as of secondary interactions of cell-secreted extracellular matrix proteins have a strong impact on endothelial cell development. A set of maleic anhydride copolymer thin films was used as planar model substrates. They exhibit a switchable mode of primary matrix coupling combined with a gradation of secondary matrix–substrate interactions due to a variation of surface hydrophobicity and polarity. We found that the cells adhere in a more native state at a low amount of covalent primary coupled fibronectin ligands in conjunction with weak interactions of secondarily adsorbed adhesion ligands on hydrophilic surfaces. These substrates allow for a formation of capillary-like networks of endothelial cells. High ligand densities and strong secondary hydrophobic interactions inhibit a pronounced capillary formation. The composition and structure of the formed extracellular matrix correlates well with the specific integrin expression pattern. From these results it is concluded that the formation of blood capillaries in artificial scaffolds can be triggered by controlling primary and secondary coupling of cell adhesion ligands to implant materials. 2

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