Bei überkritisch großen Läsionen des peripheren Nervensystems, die zum Verlust von Motorik bzw. Sensibilität an Extremitäten führen und damit eine erhebliche Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten bedingen, ist der Einsatz von Überbrückungsstrukturen bzw. Nervenleitkanälen notwendig. Da weder autologe Transplantate noch künstliche Konstrukte im klinischen Alltag bislang zufriedenstellende Ergebnisse lieferten, ist die Nachfrage nach alternativen Materialien und Konzepten des Tissue Engineering hoch. Im Rahmen dieser Dissertation ist es gelungen zwei thermoplastische Methoden zu etablieren, mit denen aus dem im medizinischen Sinne interessanten und relativ neuartigen Material Poly(3-hydroxybuttersäure) in Kombination mit Polycaprolacton poröse resorbierbare Hohlstrukturen bzw. Hohlfasern erzeugt werden können, die den hohen aktuellen Anforderungen an eine Nervenleitschiene gerecht werden. Neben der Entwicklung und Charakterisierung sowie Modifizierung der erzeugten Leitkanäle bezüglich Porosität, Permeationsverhalten, mechanische Eigenschaften und Oberflächenfunktionalisierung, konnten strukturelle als auch biochemische Reize in diese integriert werden, die in einer Reihe von ex-vivo Studien mit neuronalen Primärzellen hinsichtlich Adhäsion, Vitalität und Ausbreitungsverhalten untersucht werden konnten. Es konnte eine Art „Toolbox“ aus PHB basierten Strukturen erstellt werden, die es erlaubt hierarchische Strukturen zusammenzustellen, die entsprechend des peripheren Defektes zusammengesetzt und biomolekular maßgeschneidert werden könnten, um die native Struktur bestmöglich temporär bis zur vollständigen Regeneration zu imitieren und damit die Therapie größerer Defekte zu ermöglichen bzw. die als Plattform für weitere Konzepte der Grundlagenforschung im Bereich des Neuro-Tissue Engineering dienen.

The desire for repair of tissue defects and injury is the major need prompting research into tissue engineering. Engineering of anisotropic tissues requires production of ordered substrates that orient cells preferentially and support cell viability and differentiation. Towards this goal, this thesis investigated methodologies to align extracellular matrix structures in vitro to guide stem/progenitor cell behaviour for tissue regeneration. Aligned collagen fibrils were deposited on planar substrates from collagen solutions streaming through a microfluidic channel system. Collagen solution concentration, degree of gelation, shear rate and pre-coating of the substrate were demonstrated to determine the orientation and density of the immobilized fibrils. The degree of collagen fibril orientation increased with increasing flow rates of the solution while the matrix density increased at higher collagen solution concentrations and on hydrophobic polymer pre-coatings. Additionally, the length of the immobilized collagen fibrils increased with increasing solution concentration and gelation time. Aligned collagen matrices were refined by incorporating the glycosaminoglycan heparin to study multiple extracellular matrix components in a single system. Multilineage (osteogenic/adipogenic/chondrogenic) differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells was maintained by the aligned structures. Most noticeable was the observation that during osteogenesis, aligned collagen substrates choreographed ordered matrix mineralization. Likewise, myotube assembly of C2C12 cells was profoundly influenced by aligned topographic features resulting in enhanced myotube organization and length. Neurites from neural stem cells were highly oriented in the direction of the underlying fibrils. Neurite outgrowth was enhanced on aligned collagen compared to non-aligned collagen or poly-D-lysine substrates, while neural differentiation and cell survival were not influenced by the type of substrate. Using the new method to align collagen type I, the interior walls of cellulose hollow fiber membranes were coated with longitudinally aligned collagen fibrils to fabricate an advanced guidance conduit for nerve regeneration. First cell culture experiments showed that the tubes coated with aligned collagen supported viability and adherence of spinal cord-derived neurospheres. Together, these results demonstrate the feasibility of aligned collagen matrices as a versatile platform to control cell behaviour towards tissue regeneration. Ultimately, the new method to align collagen fibrils and to coat hollow membranes may become an integral component of tissue engineering, working synergistically with other emerging techniques to promote functional tissue replacements.

In ungeordneten Fe70Pd30-Strukturen ermöglicht eine martensitische Umwandlung den magnetischen Formgedächtniseffekt, der in Aktoren genutzt werden kann. Der inverse Effekt kann für hochempfindliche Dehnungsmessungen verwendet werden. Eine Miniaturisierung zu Schichten ermöglicht Anwendungen in mikro- und nanoelektromechanischen Systemen. Ziel dieser Arbeit ist es, die magnetischen Eigenschaften in Abhängigkeit von der Struktur zu bestimmen und die gewünschte Kombination aus beiden auf dickere Schichten zu übertragen. In Kapitel 2 werden die strukturellen Aspekte im Fe-Pd-System und die Besonderheiten des Wachstums dünner Schichten betrachtet. In Kapitel 3 werden die Schichtherstellung mittels Kathodenzerstäubung und die verschiedenen Charakterisierungsmethoden kurz vorgestellt. Kapitel 4 zeigt den Einfluss durch verschiedene Zwischenschichten mit unterschiedlichen Gitterparametern auf die Kristall- und Elektronenstruktur sowie auf die magnetischen Eigenschaften von dünnen, epitaktischen Fe-Pd-Cu-Schichten. Untersuchungen zur kritischen Schichtdicke und Relaxationsmechanismen stehen in Kapitel 5 im Vordergrund. In Kapitel 6 wird die kombinatorische Schichtherstellung vorgestellt, die eine systematische Variation von Struktur und Zusammensetzung für eine praxisnahe Anwendung erlaubt. Außerdem werden Ergebnisse zu freien Schichten gezeigt und der Einfluss des Ablösens auf Morphologie und Struktur diskutiert.

Der Erfolg neuer Strategien in der Regenerativen Medizin und im Tissue Engineering hängt maßgeblich von einem gut entwickeltem vaskulären Netzwerk ab, welches die auf den Implantaten wachsenden Zellen und Gewebe versorgen. Oberflächeneigenschaften der Implantate sowie die Präsentation verschiedener Liganden für extrazelluläre Matrixproteine spielen bei der Besiedlung der Implantate, als auch bei der Bildung versorgender Blutgefäße durch die Endothelzellen eine wesentliche Rolle. In dieser Arbeit konnte durch Variation der Anbindungsstärke (kovalent oder physisorptiv) des extrazellulären Matrixproteins Fibronektins an die MSA-Copolymere der Einfluss des Aufbaus der extrazellulären Matrix auf das Differenzierungsverhalten der Endothelzellen gezeigt werden. Auch die initiale Konzentration von Adhäsionsproteinen an der Substratoberfläche zeigte sich bedeutend für das Verhalten der Zellen. Optimal für eine gute Adhäsion, native Entwicklung und Kapillarbildung der Endothelzellen war die stabile (kovalente) Anbindung weniger Adhäsionsproteine (hier Fibronektin) an die Substratoberfläche, so dass die Zellen problemlos adhärieren konnten. Erfolgte die weiter Proteinadsorption an die Oberflächen in einem nativen Zustand (hier auf den hydrophilen Oberflächen) so waren die Endothelzellen in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu reorganisieren und ein dem in vivo Zustand ähnlicher Aufbau der extrazellulären Matrix konnte realisiert werden. Dies ermöglichte den Zellen wiederum ein natürliches Verhalten. Die Ausbildung einer moderaten Anzahl von Adhäsionsstellen der Zellen, sowie der in vivo ähnliche Aufbau der Adhäsionspunkte ermöglichte den Zellen einen eher lockeren Kontakt zum Substrat. Daher waren sie sehr flexibel in ihrer Morphologieanpassung. Unter diesen Bedingungen war es möglich, dass die Endothelzellen bei Stimulierung der Angiogenese kapillarähnliche Strukturen ausbildeten. Die Verwendung dreidimensionaler Zellkulturträger zeigte eine Unterstützung der Kapillarbildung der Endothelzellen in Abhängigkeit unter den beschrieben Bedingungen. / The success of tissue engineering strategies using artificial scaffolds crucially depends on a controlled formation of well-developed vascular networks in growing tissues. The presentation of extracellular matrix ligands on scaffolds is often envisioned as an appropriate strategy to support capillary formation. We show that the control of primary coupling mode — covalent versus physisorbed — as well as of secondary interactions of cell-secreted extracellular matrix proteins have a strong impact on endothelial cell development. A set of maleic anhydride copolymer thin films was used as planar model substrates. They exhibit a switchable mode of primary matrix coupling combined with a gradation of secondary matrix–substrate interactions due to a variation of surface hydrophobicity and polarity. We found that the cells adhere in a more native state at a low amount of covalent primary coupled fibronectin ligands in conjunction with weak interactions of secondarily adsorbed adhesion ligands on hydrophilic surfaces. These substrates allow for a formation of capillary-like networks of endothelial cells. High ligand densities and strong secondary hydrophobic interactions inhibit a pronounced capillary formation. The composition and structure of the formed extracellular matrix correlates well with the specific integrin expression pattern. From these results it is concluded that the formation of blood capillaries in artificial scaffolds can be triggered by controlling primary and secondary coupling of cell adhesion ligands to implant materials. 2

Thema der vorgelegten Dissertation ist der Mechanismus der Keimbildung und des Wachstums von Platinclustern in Lösung und auf Biopolymeren nach der Reduktion von Platin-Salzen. Die Untersuchung wird auf atomarer Skala durch ab-initio Molekulardynamik mit der Methode von Car und Parrinello durchgeführt. In einem klassischen, generell akzeptierten Mechanismus erfolgt die Aggregation von Pt-Atomen nur nach kompletter Reduktion der Pt(II)-Komplexen zum metallischen Pt(0)-Zustand. Im Gegensatz dazu, in der hier beobachteten Reaktionsablauf entstehen stabile Pt-Pt-Bindungen schon nach einem einzigen Reduktionsschritt. Darüber hinaus wird es gefunden, dass kleine Pt-Cluster durch Addition von unreduzierten PtCl2(H2O)2-Komplexen wachsen können. Das stimmt mit einem experimentell beocbachteten autokatalytischen Clusterwachstumsmechanismus überein. Es wird weiterhin gefunden, dass Pt(II)-Komplexe, die kovalent an DNA oder an Proteine gebunden sind, als sehr effiziente Nukleationszentren für das weitere Metallclusterwachstum wirken können. Das ist eine Konsequenz des starken Donor-Charakters der organischen Liganden, in derer Anwesenheit stärkere Metall-Metall-Bindungen als frei in der Lösung gebildet werden können. In der Tat, in Metallisierungsexperimenten können 5 Nanometer dünne, mehrere Mikrometer lange, regelmässige Clusterkette erzeugt werden, die rein heterogen auf das Biomolekulare Templat gewachsen sind. / In this thesis we investigate the molecular mechanisms of platinum cluster nucleation and growth in solution and on biopolymers by means of first-principles molecular dynamics. In contrast with a classical picture where clusters nucleate by aggregation of metallic Pt(0) atoms, we find that Pt--Pt bonds can form between dissolved Pt(II) complexes already after a single reduction step. Furthermore, we observe that small clusters grow by addition of unreduced PtCl2(H2O)2 complexes, consistently with an autocatalytic growth mechanism. Moreover Pt(II) ions covalently bound to biopolymers are found to act as preferred nucleation sites for the formation of clusters. This is a consequence of the strong donor character of the organic ligands which induce the formation of stronger metal-metal bonds than those obtained in solution. In fact, in metallization experiments we obtain a clean and purely heterogeneous metallization of single DNA molecules leading to thin and uniform Pt cluster chains extended over several microns.

Flocktechnologie ist eine im Bereich der Textiltechnik angewandte Methode, bei der kurze Fasern nahezu senkrecht auf ein vorher mit Klebstoff beschichtetes Substrat aufgebracht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die elektrostatische Beflockung als Methode zur Herstellung von porösen, dreidimensionalen Scaffolds für das Tissue Engineering von Knorpel und Knochen etabliert. Dieser neuartige Scaffoldtyp wurde eingehend charakterisiert und in Zellversuchen im Hinblick auf seine Biokompatibilität untersucht. Dabei zeigte sich, dass verschiedene Zellen im Scaffold proliferieren und differenzieren können. Die in der Arbeit beschriebenen Flockscaffolds stellen somit eine vielversprechende Matrix für die Therapie von Gelenkknorpeldefekten dar.

Für die Behandlung von Knochendefekten überkritischer Größe stehen seit einigen Jahren zahlreiche resorbierbare Materialien zur Verfügung, die eine Defektheilung bis hin zur vollständigen knöchernen Regeneration erlauben. Im Fall systemischer Knochenerkrankungen, insbesondere im osteoporotischen Knochen, ist jedoch die Selbstheilungskapazität des Gewebes stark eingeschränkt, was neben der Defektbehandlung eine knochenanabole sowie resorptionshemmende Therapie erfordert. Diese kann beispielsweise durch die Gabe von Strontium-haltigen Präparaten erreicht werden, da der duale Wirkmechanismus der Strontium-Ionen zu vermehrter Knochenneubildung bei gleichzeitig verminderter Knochenresorption führt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Strontium-haltigen Knochenzements, welcher eine Freisetzung von Strontium-Ionen spezifisch im jeweiligen Knochendefekt und somit eine lokale Stimulation der Knochenneubildung ermöglicht. Basierend auf einem etablierten Calciumphosphat-Knochenzement wurden Strontium-haltige Zementvarianten hergestellt und ausgiebig charakterisiert. Im Gegensatz zu den meisten bislang verfolgten Methoden konnten Zemente mit deutlich verbesserten mechanischen Eigenschaften hergestellt werden, welche weiterhin Strontium-Ionen in physiologisch relevanten Konzentrationen freisetzen. Durch Zellkulturuntersuchungen an humanen Zellen sowohl der osteoblastären- als auch osteoklastären Linie konnte eine Stimulation der für den Knochenaufbau verantwortlichen Zellen sowie eine Hemmung der den Knochen resorbierenden Zellen durch die entwickelten Zemente nachgewiesen werden.

Abstract der Posterpräsentation: Xerogele basierend auf Silikat und Kollagen wurden als lasttragendes Knochenersatzmaterial entwickelt. Das Materialkonzept [1] wurde durch den Zusatz verschiedener Calciumphosphate modifiziert. Das Ziel der Arbeit – die Bioaktivität der Komposite und somit das Zellverhalten zu beeinflussen – wird in Verbindung gesetzt zur derzeitigen kritischen Diskussion der Bioaktivität von Biomaterialien [2]. Die Xerogele wurden durch Nutzung eines Sol-Gel-Prozesses hergestellt, der durch die Änderung des pH-Wertes beim Mischen von Kieselsäure und einer Kollagenlösung initiiert wird. Hydroxylapatit (HAp), a-Tricalciumphosphat (TCP), Brushit und ein selbst entwickelter organisch modifizierter HAp wurden als Pulver sowie Ostim® als pastöse Komponente zur Kollagensuspension hinzugefügt. Die Xerogele wurden in Medien verschiedener Calciumkonzentrationen inkubiert. Die Charakterisierung erfolgte durch biochemische Methoden und Rasterelektronenmikroskopie. Der Einfluss der Xerogelbioaktivität auf die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen wurde biochemisch und durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Die Zugabe von HAp, Ostim® oder TCP führte zu einer beschleunigten Apatitabscheidung auf den Xerogelen aus simulierter Körperflüssigkeit ebenso wie aus Zellkulturmedium (a-MEM). Im Gegensatz dazu verursachen organisch modifizierter HAp oder Brushit eine initiale Calciumfreisetzung aus den Xerogelen. Diese Freisetzung kompensiert das bioaktive Verhalten in gewissem Maße, was durch die Einlagerung in Calcium-freiem a-MEM bestätigt wurde. Die gesteigerte Bioaktivität der Xerogele entspricht einem verringerten Calciumgehalt im Medium, der wiederum einen nachteiligen Effekt auf die Proliferation hat und zur Inhibierung der Matrixmineralisation führt.

In drei inhaltlich abgeschlossen Teilen werden Fragestellungen bearbeitet, die sich mit dem Einsatz von Polyhydroxybutyraten als Scaffoldmaterialien für das Tissue Engioneering von Knochen beschäftigen. Zunächst wird ein Prozess optimiert, in dem mittels Verpressen und Auslösen von Platzhaltern (Porogen) poröse Träger (Scaffolds) aus Poly-3-hydroxybuttersäure (P3HB) sowie aus P3co4HB hergestellt werden. Diese Scaffolds werden in der Folge mechanisch und strukturell charakterisiert, wobei Druckfestigkeit, Dauerfestigkeit und Viskoelastizität untersucht werden. Im Ergebnis finden sich mehrere Kandidaten, die für die weitere Testung im Tierversuch in Frage kommen. Weiter wird das Abbauverhalten von schmelzgeponnenen P3HB-Fäden untersucht. Dabei wird ein beschleunigtes Modellsystem gewählt, das noch möglichst nahe am physiologischen Fall aber ohne biologisch aktive Komponente (zB. Enzyme) definiert wurde. Die Charakterisierung bedient sich hier der Gelpermeationschromatographie (GPC), des gasgestützten Elektronenrastermikroskops (ESEM), der differentiellen Thermoanalyse (DSC) und der Rasterkraftmikroskopie. Als Ergebnis zeichnete sich ab, dass neben der hydrolytischen Degradation im Gegensatz zu PHB mit kleinerer spezifischer Oberfläche bei den Fäden auch Erosion zum Abbau beiträgt. Eine partikuläre Freisetzung wird nicht beobachtet. Im dritten Teil werden textile Scaffolds aus P3HB mit einer künstlichen extrazellulären Matrix aus Chondroitinsulfaten (CS) und Kollagen versehen. Dem CS kann hier ein positiver Einfluss auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) nachgewiesen werden. Dies wird zum einen durch die verstärkte Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) sowie durch die Hochregulation von Proteinen ersichtlich, die bei der osteogenen Differenzierung essentiell sind. In wenigen Gene-Arrays lässt sich ebenfalls erkennen, dass die osteogene Differenzierung durch CS positiv beeinflusst wird. Insbesondere frühe Marker wie ZBTB16 und IGFBPs werden hier identifiziert. Basierend auf den Teilergebnissen wird am Ende ein Beitrag geliefert, der das Tissue Engineering insbesondere für überkritische Röhrenknochendefekte als Methode interessant erscheinen lässt. Dabei werden mechanische Lasten durch konventionelle Fixateure aufgenommen und der Defektraum durch den mehrfachen Einsatz von bio-funktionalisierten flachen Scaffolds gefüllt.

Die Entwicklung und Erprobung von metallischen Implantatwerkstoffen mit biologischen Beschichtungen für den Einsatz im menschlichen Knochen verlangt, neben der Untersuchung grundlegender zellbiologischer Wechselwirkungen, eine ganzheitliche Betrachtung ihrer Wirkungsweise im lebenden Organismus. Die vorwiegend angewandte Methode zur Quantifizierung des Potentials von Biofunktionalisierungen metallischer Implantate ist dabei die histologische Auswertung. Diese stützt sich aber auf Informationen aus nur wenigen und eher zufälligen Schnittlagen im Probenvolumen, was mit einer hohen Anzahl an Tierexperimenten ausgeglichen wird. Mit der Mikrocomputertomographie steht neben der klassischen Histologie eine zerstörungsfreie Methode zur Verfügung, welche eine detaillierte dreidimensionale Darstellung des neugebildeten Knochengewebes ermöglicht. Die Abbildungsqualität des mineralischen Knochengewebes um Titanimplantate, als Grundlage für eine Vergleichbarkeit von Tomographie und Histologie, wurde anhand von drei Mikrofokus-Computertomographen und einem Synchrotron-Computertomographen am HASYLAB untersucht. Die tomographische Untersuchung von Hartgewebe einschließlich metallischer Implantate zeigte mit Hilfe von Synchrotronstrahlung die beste qualitative Übereinstimmung zur histologischen Bildgebung. Für die Quantifizierung der Knochenneubildung wurden interaktive Analysemodelle erarbeitet, welche eine vereinheitlichte Auswertung von histologischen und tomographischen Informationen erlaubt. Auf Grundlage der entwickelten Analyseprozeduren war es erstmals möglich, die statistische Belastbarkeit der Ergebnisse aus der histologischen und tomographischen Analyse zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass hinsichtlich der Herausstellung von Unterschieden bei der Osseointegration modifizierter Titanimplantate mit beiden Methoden ähnliche Ergebnistrends gefunden werden. Eine Signifikanz (p < 0,01) der Unterschiede bei der Knochenneubildung konnte jedoch ausschließlich mit der mikrotomographischen Analyse herausgestellt werden. Die Ergebnisse bei der Darstellung und Analyse des mineralischen Gewebes durch die Nutzung der Synchrotrontomographie gehen weit über die Grenzen der histologischen Untersuchungen hinaus. Durch den dreidimensionalen Charakter der Informationen ergeben sich dabei neue Bewertungsmodelle zur Beurteilung der Osseointegration von biofunktionalisierten Implantaten. Die mikrotomographische Analyse führt gegenüber der histologischen Auswertung durch die geringe Irrtumswahrscheinlichkeit der Ergebnisse bei deutlich verminderter Probenanzahl zu einer erheblichen Verringerung von Tierversuchen.