Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Modifizierung von Beschichtungen auf Basis von diamantähnlichem Kohlenstoff (DLC). Die Modifizierung erfolgte mittels Elektronenstrahl (eBeam) und sollte der Oberflächenfunktionalisierung durch die Steuerung der Zelladhäsion dienen. Das Anwendungsfeld der modifizierten DLC-Schichten findet sich im biomedizinischen Bereich. Als Anwendungsbeispiel wurden Aktoren aus Formgedächtnislegierung (FGL) herangezogen. Diese sollen in Hüftendoprothesen genutzt werden. Ihre Aufgabe ist es, bei Implantatlockerung eine Wiederverankerung im Knochen, ohne äußeren Eingriff zu ermöglichen. Die Aktoren stellen an eine Beschichtung besondere Herausforderungen hinsichtlich Schichtstabilität und -flexibilität, Zelladhäsion sowie Barrierefunktion. Im Folgenden werden die untersuchten Schwerpunkte mit Bezug auf dieses Anwendungsbeispiel zusammenfassend dargestellt. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden vier Abscheidemethoden für DLC-Beschichtungen verglichen: die plasmaaktivierte chemische Gasphasenabscheidung (PA CVD), das Magnetronsputtern (PVD-Spu), und die Lichtbogenverdampfung ungefiltert und -gefiltert (PVD-Arc bzw. PVD-Arcfil). Aus diesen Abscheidemethoden sollte eine für das medizintechnische Einsatzgebiet geeignete Methode zur DLC-Abscheidung ausgewählt werden. Dafür wurden folgende Kriterien untersucht: Schichtmorphologie und stabilität, Biokompatibilität und die Möglichkeit zur Modifizierung mittels eBeam. Es zeigte sich, dass mittels Magnetronsputtern homogene DLC-Schichten abgeschieden werden können. Diese Beschichtungen zeigen im Vergleich zu den Beschichtungen der anderen Abscheideverfahren die beste Biokompatibilität. Die Modifizierung der Schichten mittels eBeam ermöglicht eine gezielte Verringerung der Zelladhäsion auf den Oberflächen, ohne zelltoxische Nebenwirkungen. Mit diesem Resultat wird die ausgewählte Beschichtung den Funktionsansprüchen des Anwendungsbeispiels gerecht. Als Anwendungsbeispiel wurden Aktoren einer intelligenten Hüftendoprothese herangezogen. Die Aktoren bestehen aus FGL-Material und sollen im Anwendungsfall eine intrakorporale Verformung durchführen. Die DLC-Beschichtung soll den Austritt von toxischen Nickelionen aus diesem Material verringern. Daher ist die Stabilität der DLC-Schichten auf den Aktoren für den zielgerechten Einsatz von grundlegender Bedeutung. Die Formflexibilität von DLC-Schichten ist aus der Literatur bekannt, womit sie eine geeignete Barrierebeschichtung für verformbare Bauteile darstellen, ohne dabei die Funktion des Substratmaterials zu beeinträchtigen. Grundlage für diese Formflexibilität stellen eine gute Schichthaftung und Langzeitstabilität dar. Auch an dieser Stelle zeigten die mittels Magnetronsputtern abgeschiedenen DLC-Schichten sehr gute Ergebnisse. Selbst die Beanspruchung durch wiederholte Desinfektion und Sterilisation führte bei dieser Beschichtung zu keiner Veränderung. Im Anwendungsbeispiel Hüftendoprothese kann es an der Implantat-Knochen-Schnittstelle zu Mikrobewegungen kommen. Durch die im Vergleich zu den anderen Beschichtungen sehr guten Ergebnisse der PVD-Spu-Schichten bei der tribologischen Charakterisierung, stellen diese Schichten eine für das Anwendungsbeispiel geeignete Beschichtung dar. Ein geringer Reibwert gewährleistet dabei eine ungestörte Gewebsintegration. Das Magnetronsputtern wurde basierend auf diesen Ergebnissen als geeignete Abscheidemethode für die DLC-Beschichtung von Implantatmaterialien ausgewählt. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurden die Modifizierung der Beschichtung, die Reaktion im biologischen Kontakt und die Barrierefunktion der Schichten bewertet. Durch die eBeam-Modifizierung der DLC-Beschichtung wird eine Hydrophilierung erzielt, die mit einer signifikanten Verringerung der Zellzahl auf der Oberfläche verbunden ist. Nach Beurteilung der Schichtmorphologie von unbehandelten und modifizierten DLC-Oberflächen konnte ausgeschlossen werden, dass die Hydrophilierung auf Veränderungen der Oberflächenmorphologie zurück zu führen ist. Vielmehr wurden chemisch-energetische Veränderungen als Ursache identifiziert, wobei die indirekte eBeam-Wirkung während der Modifizierung zum Tragen kommt. Die Intensität der Hydrophilierung ist dosisabhängig und zeigt eine Art Sättigungsverhalten ab 500 kGy. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Modifizierung der Anteil stickstoff- und sauerstoffhaltiger Funktionalitäten auf der DLC-Oberfläche zunimmt. Die Verringerung der Zellzahl, welche ebenfalls eine Art Sättigung bei 500 kGy zeigt, steht über die Proteinadhäsion mit diesen Veränderungen in direktem Zusammenhang. In Korrelation mit der Literatur scheint es durch die Zunahme der sauerstoffhaltigen Funktionalitäten zu einer veränderten Proteinadhäsion zu kommen. Dabei wird die Proteinkonformation verändert, was die anschließende Zelladhäsion verringert. Mittels eBeam können sehr feine Strukturen bis in den Mikrometerbereich modifiziert werden, was bedeutet, dass damit die Zelladhäsion in den aneinander angrenzenden Bereichen des Aktors gezielt eingestellt werden kann. Damit wird die DLC-Beschichtung mit dieser Modifizierung den Funktionsansprüchen des Aktorbauteiles gerecht. Die Analyse der Langzeitstabilität zeigte, dass die Modifizierung sowohl an Luft als auch in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) über einen Zeitraum von mindestens zwei Monaten stabil ist. Somit kann für das Anwendungsbeispiel die Modifizierung bereits langfristig vor dem Einsatz eines Implantates erfolgen. Bisher wurden derartige Modifizierungen hauptsächlich mittels Plasmabehandlung durchgeführt. Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit können damit jedoch keine zeitlich stabilen Effekte erzielt werden. Weitere Nachteile der Plasmamethoden ergeben sich durch Materialveränderungen und verhältnismäßig lange Prozesszeiten. Weiterhin wird laut Literatur bei der Plasmabehandlung von DLC-Oberflächen eine Steigerung der Zelladhäsion erzielt. In der vorliegenden Arbeit besteht das Ziel jedoch in der Verringerung der Zelladhäsion, wodurch sich auch unter diesem Aspekt die eBeam-Modifizierung gegenüber der Plasmamodifizierung als vorteilhaft erweist. Zusätzlich wurde neben der Langzeitstabilität für die eBeam-modifizierten DLC-Beschichtungen auch eine Stabilität gegenüber chemisch-mechanischer Reinigung mit anschließender Dampfsterilisation belegt. Da jedoch die FGL-Aktoren im Anwendungsbeispiel durch thermischen Energieeintrag aktiviert werden, könnte die herkömmliche Anwendung der Dampfsterilisation ein Problem darstellen. Auch dafür bietet die eBeam-Behandlung als alternative Sterilisationsmethode einen Lösungsansatz. Mit einer Sterilisationsdosis von lediglich 25 kGy ist die Anwendung des eBeams sowohl zur Sterilisation von unbehandelten als auch modifizierten DLC-Oberflächen möglich, ohne deren Eigenschaften oder die des beschichteten Substrates zu beeinflussen. Die eBeam-Modifizierung der DLC-Oberflächen bietet basierend auf den vorliegenden Ergebnissen eine Möglichkeit zur Steuerung der Zelladhäsion, da in den modifizierten Bereichen eine signifikante Verringerung der Zellzahl erzielt wird. Eine Verringerung der Zellzahl ist für die beweglichen Bereiche der FGL-Aktoren besonders wichtig, um deren Funktion zu gewährleisten (s. Abbildung 1). Für die modifizierten Schichten werden dabei keine Beeinträchtigung der Zellvitalität oder Veränderungen der Phasen des Zellzyklus festgestellt. Weiterhin ist belegt, dass von diesen Beschichtungen kein erhöhtes Entzündungspotential ausgeht, was den uneingeschränkten Einsatz der modifizierten DLC-Beschichtungen im biomedizinischen Bereich ermöglicht. Die unbehandelten DLC-Oberflächen hingegen sollen im Anwendungsbeispiel eine schnelle Implantatintegration gewährleisten. Auch diesem Anspruch wird die Beschichtung gerecht, da die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen auf diesen Oberflächen uneingeschränkt verläuft. Die Analyse des Calciumgehaltes als späten Differenzierungsmarker lässt sogar auf einen stimulierenden Effekt durch die Schichten schließen. Folglich kann für den Anwendungsfall der Hüftendoprothese eine beschleunigte Osseointegration erwartet werden. Die größte Herausforderung für die DLC-Beschichtungen bestand in der Verringerung des Nickelaustrittes aus dem FGL-Material. Die Ergebnisse der Extraktionsversuche belegen, dass aus unbeschichteten FGL Nickelionen austreten und die Stoffwechselaktivität von Osteoblasten beeinflussen. Auf DLC-beschichteten Proben hingegen kann kein messbarer Austritt von Nickelionen festgestellt werden. Im Direktkontakt mit humanen Osteoblasten zeigt sich auf den unbeschichteten FGL eine unnatürliche Zellmorphologie, was auf den Nickelaustritt zurückgeführt werden kann. Dahingegen erscheinen die Zellen auf den DLC-beschichteten Oberflächen in vitaler Morphologie. Diese Ergebnisse demonstrieren die Wirksamkeit der DLC-Beschichtung als Barriere gegenüber dem Austritt von Nickelionen. Zusammenfassend wird festgestellt, dass das Magnetronsputtern die Abscheidung von DLC-Schichten ermöglicht, die dem Anwendungsbeispiel Hüftendoprothese mit FGL-Aktor sowohl hinsichtlich Barrierefunktion als auch Biokompatibilität gerecht werden. Die Modifizierung mittels eBeam gewährleistet dabei die gezielte Steuerung der Zellzahl, wodurch die DLC-Beschichtungen auch die biofunktionalen Ansprüche des Anwendungsbeispiels bedienen. DLC-Beschichtungen weisen aufgrund ihrer großen Variabilität hinsichtlich Materialeigenschaften und der sehr guten Biokompatibilität ein breites Spektrum für biomedizinische Anwendungen auf. Die eBeam-Modifizierung der Beschichtungen eröffnet aufgrund ihrer Langzeitstabilität darüber hinaus weitere Einsatzfelder. Vor allem die Option einer partiellen Oberflächenmodifizierung ermöglicht es, variierenden Funktionsansprüchen zahlreicher Anwendungen gerecht zu werden und die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnen Erkenntnisse auf weitere Einsatzfelder zu übertragen.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Modifizierung von Beschichtungen auf Basis von diamantähnlichem Kohlenstoff (DLC). Die Modifizierung erfolgte mittels Elektronenstrahl (eBeam) und sollte der Oberflächenfunktionalisierung durch die Steuerung der Zelladhäsion dienen. Das Anwendungsfeld der modifizierten DLC-Schichten findet sich im biomedizinischen Bereich. Als Anwendungsbeispiel wurden Aktoren aus Formgedächtnislegierung (FGL) herangezogen. Diese sollen in Hüftendoprothesen genutzt werden. Ihre Aufgabe ist es, bei Implantatlockerung eine Wiederverankerung im Knochen, ohne äußeren Eingriff zu ermöglichen. Die Aktoren stellen an eine Beschichtung besondere Herausforderungen hinsichtlich Schichtstabilität und -flexibilität, Zelladhäsion sowie Barrierefunktion. Im Folgenden werden die untersuchten Schwerpunkte mit Bezug auf dieses Anwendungsbeispiel zusammenfassend dargestellt. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden vier Abscheidemethoden für DLC-Beschichtungen verglichen: die plasmaaktivierte chemische Gasphasenabscheidung (PA CVD), das Magnetronsputtern (PVD-Spu), und die Lichtbogenverdampfung ungefiltert und -gefiltert (PVD-Arc bzw. PVD-Arcfil). Aus diesen Abscheidemethoden sollte eine für das medizintechnische Einsatzgebiet geeignete Methode zur DLC-Abscheidung ausgewählt werden. Dafür wurden folgende Kriterien untersucht: Schichtmorphologie und stabilität, Biokompatibilität und die Möglichkeit zur Modifizierung mittels eBeam. Es zeigte sich, dass mittels Magnetronsputtern homogene DLC-Schichten abgeschieden werden können. Diese Beschichtungen zeigen im Vergleich zu den Beschichtungen der anderen Abscheideverfahren die beste Biokompatibilität. Die Modifizierung der Schichten mittels eBeam ermöglicht eine gezielte Verringerung der Zelladhäsion auf den Oberflächen, ohne zelltoxische Nebenwirkungen. Mit diesem Resultat wird die ausgewählte Beschichtung den Funktionsansprüchen des Anwendungsbeispiels gerecht. Als Anwendungsbeispiel wurden Aktoren einer intelligenten Hüftendoprothese herangezogen. Die Aktoren bestehen aus FGL-Material und sollen im Anwendungsfall eine intrakorporale Verformung durchführen. Die DLC-Beschichtung soll den Austritt von toxischen Nickelionen aus diesem Material verringern. Daher ist die Stabilität der DLC-Schichten auf den Aktoren für den zielgerechten Einsatz von grundlegender Bedeutung. Die Formflexibilität von DLC-Schichten ist aus der Literatur bekannt, womit sie eine geeignete Barrierebeschichtung für verformbare Bauteile darstellen, ohne dabei die Funktion des Substratmaterials zu beeinträchtigen. Grundlage für diese Formflexibilität stellen eine gute Schichthaftung und Langzeitstabilität dar. Auch an dieser Stelle zeigten die mittels Magnetronsputtern abgeschiedenen DLC-Schichten sehr gute Ergebnisse. Selbst die Beanspruchung durch wiederholte Desinfektion und Sterilisation führte bei dieser Beschichtung zu keiner Veränderung. Im Anwendungsbeispiel Hüftendoprothese kann es an der Implantat-Knochen-Schnittstelle zu Mikrobewegungen kommen. Durch die im Vergleich zu den anderen Beschichtungen sehr guten Ergebnisse der PVD-Spu-Schichten bei der tribologischen Charakterisierung, stellen diese Schichten eine für das Anwendungsbeispiel geeignete Beschichtung dar. Ein geringer Reibwert gewährleistet dabei eine ungestörte Gewebsintegration. Das Magnetronsputtern wurde basierend auf diesen Ergebnissen als geeignete Abscheidemethode für die DLC-Beschichtung von Implantatmaterialien ausgewählt. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurden die Modifizierung der Beschichtung, die Reaktion im biologischen Kontakt und die Barrierefunktion der Schichten bewertet. Durch die eBeam-Modifizierung der DLC-Beschichtung wird eine Hydrophilierung erzielt, die mit einer signifikanten Verringerung der Zellzahl auf der Oberfläche verbunden ist. Nach Beurteilung der Schichtmorphologie von unbehandelten und modifizierten DLC-Oberflächen konnte ausgeschlossen werden, dass die Hydrophilierung auf Veränderungen der Oberflächenmorphologie zurück zu führen ist. Vielmehr wurden chemisch-energetische Veränderungen als Ursache identifiziert, wobei die indirekte eBeam-Wirkung während der Modifizierung zum Tragen kommt. Die Intensität der Hydrophilierung ist dosisabhängig und zeigt eine Art Sättigungsverhalten ab 500 kGy. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Modifizierung der Anteil stickstoff- und sauerstoffhaltiger Funktionalitäten auf der DLC-Oberfläche zunimmt. Die Verringerung der Zellzahl, welche ebenfalls eine Art Sättigung bei 500 kGy zeigt, steht über die Proteinadhäsion mit diesen Veränderungen in direktem Zusammenhang. In Korrelation mit der Literatur scheint es durch die Zunahme der sauerstoffhaltigen Funktionalitäten zu einer veränderten Proteinadhäsion zu kommen. Dabei wird die Proteinkonformation verändert, was die anschließende Zelladhäsion verringert. Mittels eBeam können sehr feine Strukturen bis in den Mikrometerbereich modifiziert werden, was bedeutet, dass damit die Zelladhäsion in den aneinander angrenzenden Bereichen des Aktors gezielt eingestellt werden kann. Damit wird die DLC-Beschichtung mit dieser Modifizierung den Funktionsansprüchen des Aktorbauteiles gerecht. Die Analyse der Langzeitstabilität zeigte, dass die Modifizierung sowohl an Luft als auch in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) über einen Zeitraum von mindestens zwei Monaten stabil ist. Somit kann für das Anwendungsbeispiel die Modifizierung bereits langfristig vor dem Einsatz eines Implantates erfolgen. Bisher wurden derartige Modifizierungen hauptsächlich mittels Plasmabehandlung durchgeführt. Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit können damit jedoch keine zeitlich stabilen Effekte erzielt werden. Weitere Nachteile der Plasmamethoden ergeben sich durch Materialveränderungen und verhältnismäßig lange Prozesszeiten. Weiterhin wird laut Literatur bei der Plasmabehandlung von DLC-Oberflächen eine Steigerung der Zelladhäsion erzielt. In der vorliegenden Arbeit besteht das Ziel jedoch in der Verringerung der Zelladhäsion, wodurch sich auch unter diesem Aspekt die eBeam-Modifizierung gegenüber der Plasmamodifizierung als vorteilhaft erweist. Zusätzlich wurde neben der Langzeitstabilität für die eBeam-modifizierten DLC-Beschichtungen auch eine Stabilität gegenüber chemisch-mechanischer Reinigung mit anschließender Dampfsterilisation belegt. Da jedoch die FGL-Aktoren im Anwendungsbeispiel durch thermischen Energieeintrag aktiviert werden, könnte die herkömmliche Anwendung der Dampfsterilisation ein Problem darstellen. Auch dafür bietet die eBeam-Behandlung als alternative Sterilisationsmethode einen Lösungsansatz. Mit einer Sterilisationsdosis von lediglich 25 kGy ist die Anwendung des eBeams sowohl zur Sterilisation von unbehandelten als auch modifizierten DLC-Oberflächen möglich, ohne deren Eigenschaften oder die des beschichteten Substrates zu beeinflussen. Die eBeam-Modifizierung der DLC-Oberflächen bietet basierend auf den vorliegenden Ergebnissen eine Möglichkeit zur Steuerung der Zelladhäsion, da in den modifizierten Bereichen eine signifikante Verringerung der Zellzahl erzielt wird. Eine Verringerung der Zellzahl ist für die beweglichen Bereiche der FGL-Aktoren besonders wichtig, um deren Funktion zu gewährleisten (s. Abbildung 1). Für die modifizierten Schichten werden dabei keine Beeinträchtigung der Zellvitalität oder Veränderungen der Phasen des Zellzyklus festgestellt. Weiterhin ist belegt, dass von diesen Beschichtungen kein erhöhtes Entzündungspotential ausgeht, was den uneingeschränkten Einsatz der modifizierten DLC-Beschichtungen im biomedizinischen Bereich ermöglicht. Die unbehandelten DLC-Oberflächen hingegen sollen im Anwendungsbeispiel eine schnelle Implantatintegration gewährleisten. Auch diesem Anspruch wird die Beschichtung gerecht, da die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen auf diesen Oberflächen uneingeschränkt verläuft. Die Analyse des Calciumgehaltes als späten Differenzierungsmarker lässt sogar auf einen stimulierenden Effekt durch die Schichten schließen. Folglich kann für den Anwendungsfall der Hüftendoprothese eine beschleunigte Osseointegration erwartet werden. Die größte Herausforderung für die DLC-Beschichtungen bestand in der Verringerung des Nickelaustrittes aus dem FGL-Material. Die Ergebnisse der Extraktionsversuche belegen, dass aus unbeschichteten FGL Nickelionen austreten und die Stoffwechselaktivität von Osteoblasten beeinflussen. Auf DLC-beschichteten Proben hingegen kann kein messbarer Austritt von Nickelionen festgestellt werden. Im Direktkontakt mit humanen Osteoblasten zeigt sich auf den unbeschichteten FGL eine unnatürliche Zellmorphologie, was auf den Nickelaustritt zurückgeführt werden kann. Dahingegen erscheinen die Zellen auf den DLC-beschichteten Oberflächen in vitaler Morphologie. Diese Ergebnisse demonstrieren die Wirksamkeit der DLC-Beschichtung als Barriere gegenüber dem Austritt von Nickelionen. Zusammenfassend wird festgestellt, dass das Magnetronsputtern die Abscheidung von DLC-Schichten ermöglicht, die dem Anwendungsbeispiel Hüftendoprothese mit FGL-Aktor sowohl hinsichtlich Barrierefunktion als auch Biokompatibilität gerecht werden. Die Modifizierung mittels eBeam gewährleistet dabei die gezielte Steuerung der Zellzahl, wodurch die DLC-Beschichtungen auch die biofunktionalen Ansprüche des Anwendungsbeispiels bedienen. DLC-Beschichtungen weisen aufgrund ihrer großen Variabilität hinsichtlich Materialeigenschaften und der sehr guten Biokompatibilität ein breites Spektrum für biomedizinische Anwendungen auf. Die eBeam-Modifizierung der Beschichtungen eröffnet aufgrund ihrer Langzeitstabilität darüber hinaus weitere Einsatzfelder. Vor allem die Option einer partiellen Oberflächenmodifizierung ermöglicht es, variierenden Funktionsansprüchen zahlreicher Anwendungen gerecht zu werden und die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnen Erkenntnisse auf weitere Einsatzfelder zu übertragen.

Surface engineering of tailored materials with adjustable characteristics in relation to biological environment, is one of the main prerequisites for biotechnological applications. In recent years, advanced surface coatings in the nanometer range have drawn big attention. A special category of this group are stimuli responsive polymers tethered by one functional end to the surface. When the surface grafting density is big enough, the polymer chains are forced to stretch away from the interface due to excluded volume effects, creating a so called polymer brush. Nano-scaled polymer brushes are advantageous due to their nanostructure, which can be comparable to biological species, and their collaborative response to external stimuli. Moreover, the material design parameters such as chemistry, surface topography, charge, and surface wettability can be adjusted by using the appropriate polymer, or a combination of polymers with respect to the desired material performance. In case of binary polymer brushes, the materials' properties are switched between the properties of two constituent polymers. Besides, upon switching of external stimuli, biomodified binary polymer brushes can hide or expose biofunctionalities, on demand. Hence, they are classified as smart biomaterials' surface coatings.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein modulares Nukleinsäure-basiertes System zur Immobilisierung von verschiedenen bioaktiven Molekülen untersucht. Zur Verankerung nutzt das System komplementäre Nukleinsäurestränge. Einer der beiden Stränge wird durch anodische Polarisation partiell in die anodische Oxidschicht eingebaut, an den komplementären Strang wird das biologische Molekül konjugiert. Der Vorteil des hier weiter entwickelten Immobilisierungssystems bildet dessen Vielseitigkeit. Es kann auf alle titanbasierenden Implantate übertragen werden und dadurch, dass ein universelles Verankerungssystem verfügbar ist, können verschiedene bioaktive Moleküle aufgebracht werden. Für die Übertragung des Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems auf reale Implantatoberflächenzustände konnten optimale Prozessbedingungen festgelegt werden. Weiterhin konnten verschiedene Ankerstrangsequenzen hinsichtlich ihres Einflusses auf Adsorption und Hybridisierungseffizienz beurteilt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode entwickelt werden, die es ermöglicht, das Immobilisierungssystem mit 25 kGy Standarddosis Gammastrahlung zu sterilisieren. Hierbei wurden verschiedene Strategien (Trocknung, Schutzgas, Opferstränge) untersucht und hinsichtlich ihrer Ankerstrangschutzfähigkeit bewertet. In Zell- und Tierversuchen konnte die biologische Aktivität der über das Immobilisierungssystem aufgebrachten Wachstumsfaktoren VEGF und BMP-2 gezeigt werden. Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein wichtiger Beitrag zur Weiterentwicklung eines Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems im Hinblick auf eine klinische Anwendung geleistet werden.

Surface engineering of tailored materials with adjustable characteristics in relation to biological environment, is one of the main prerequisites for biotechnological applications. In recent years, advanced surface coatings in the nanometer range have drawn big attention. A special category of this group are stimuli responsive polymers tethered by one functional end to the surface. When the surface grafting density is big enough, the polymer chains are forced to stretch away from the interface due to excluded volume effects, creating a so called polymer brush. Nano-scaled polymer brushes are advantageous due to their nanostructure, which can be comparable to biological species, and their collaborative response to external stimuli. Moreover, the material design parameters such as chemistry, surface topography, charge, and surface wettability can be adjusted by using the appropriate polymer, or a combination of polymers with respect to the desired material performance. In case of binary polymer brushes, the materials' properties are switched between the properties of two constituent polymers. Besides, upon switching of external stimuli, biomodified binary polymer brushes can hide or expose biofunctionalities, on demand. Hence, they are classified as smart biomaterials' surface coatings.

Die Entwicklung und Erprobung von metallischen Implantatwerkstoffen mit biologischen Beschichtungen für den Einsatz im menschlichen Knochen verlangt, neben der Untersuchung grundlegender zellbiologischer Wechselwirkungen, eine ganzheitliche Betrachtung ihrer Wirkungsweise im lebenden Organismus. Die vorwiegend angewandte Methode zur Quantifizierung des Potentials von Biofunktionalisierungen metallischer Implantate ist dabei die histologische Auswertung. Diese stützt sich aber auf Informationen aus nur wenigen und eher zufälligen Schnittlagen im Probenvolumen, was mit einer hohen Anzahl an Tierexperimenten ausgeglichen wird. Mit der Mikrocomputertomographie steht neben der klassischen Histologie eine zerstörungsfreie Methode zur Verfügung, welche eine detaillierte dreidimensionale Darstellung des neugebildeten Knochengewebes ermöglicht. Die Abbildungsqualität des mineralischen Knochengewebes um Titanimplantate, als Grundlage für eine Vergleichbarkeit von Tomographie und Histologie, wurde anhand von drei Mikrofokus-Computertomographen und einem Synchrotron-Computertomographen am HASYLAB untersucht. Die tomographische Untersuchung von Hartgewebe einschließlich metallischer Implantate zeigte mit Hilfe von Synchrotronstrahlung die beste qualitative Übereinstimmung zur histologischen Bildgebung. Für die Quantifizierung der Knochenneubildung wurden interaktive Analysemodelle erarbeitet, welche eine vereinheitlichte Auswertung von histologischen und tomographischen Informationen erlaubt. Auf Grundlage der entwickelten Analyseprozeduren war es erstmals möglich, die statistische Belastbarkeit der Ergebnisse aus der histologischen und tomographischen Analyse zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass hinsichtlich der Herausstellung von Unterschieden bei der Osseointegration modifizierter Titanimplantate mit beiden Methoden ähnliche Ergebnistrends gefunden werden. Eine Signifikanz (p < 0,01) der Unterschiede bei der Knochenneubildung konnte jedoch ausschließlich mit der mikrotomographischen Analyse herausgestellt werden. Die Ergebnisse bei der Darstellung und Analyse des mineralischen Gewebes durch die Nutzung der Synchrotrontomographie gehen weit über die Grenzen der histologischen Untersuchungen hinaus. Durch den dreidimensionalen Charakter der Informationen ergeben sich dabei neue Bewertungsmodelle zur Beurteilung der Osseointegration von biofunktionalisierten Implantaten. Die mikrotomographische Analyse führt gegenüber der histologischen Auswertung durch die geringe Irrtumswahrscheinlichkeit der Ergebnisse bei deutlich verminderter Probenanzahl zu einer erheblichen Verringerung von Tierversuchen.

Ein Schlüsselfeld der gegenwärtigen Biomaterialforschung ist die Modifizierung von Oberflächen mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix (EZM) oder Molekülen, die bestimmte Funktionen nachahmen. Trotz einer Reihe positiver Ergebnisse in vitro und in vivo ist es mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Immobilisierungsmethoden nicht möglich, unterschiedliche Komponenten in einem Prozessschritt zu immobilisieren, definierte Freisetzungscharakteristika für gleiche und/oder unterschiedliche Moleküle zu realisieren und die Beschichtung der Oberflächen nach Sterilisation der Implantate vorzunehmen, um empfindliche bioaktive Substanzen, wie Proteine, vor Schädigung zu bewahren. An diesem Punkt setzt die vorliegende Arbeit mit dem Ziel an, ein nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem für Titanwerkstoffe zu entwickeln. Es wird zunächst am Beispiel eines Peptids mit der Aminosäuresequenz Arginin–Glyzin–Asparaginsäure (RGD) nachgewiesen, dass an der Grenzfläche Passivschicht/Elektrolyt von Titanwerkstoffen vorliegende Moleküle in durch anodische Polarisation verdickte Oxidschichten partiell eingebaut werden können und dabei ihre Funktionalität erhalten bleibt. Diese Immobilisierungsmethode wird zum Immobilisierungssystem erweitert, indem Nukleinsäureeinzelstränge mit der beschriebenen Methode als Ankerstränge (AS) in anodisch formierte Oxidschichten fixiert und in einem zweiten Prozessschritt mit komplementären Gegensträngen (GS) hybridisiert werden. In der Arbeit wird gezeigt, dass das Peptid in einem weiten Parameterbereich der elektrochemischen Bedingungen immobilisiert werden kann. Demgegenüber führen im Falle des nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystems die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die Photoaktivität der Oxidschicht sowie mehrfache Trocknungen und Wiederbenetzungen zu einer Schädigung gebundener AS bis hin zu einem vollständigen Verlust der Hybridisierbarkeit. Durch Zugabe von Ethanol in hoher Konzentration während des Immobilisierungsschritts, Arbeit unter Lichtausschluss sowie Vermeidung mehrerer Trocknungen und Wiederbenetzungen können die Nebenwirkungen soweit eingeschränkt werden, dass alle immobilisierten AS hybridisierbar sind. Nach dessen Etablierung im Rahmen dieser Arbeit ist es in nachfolgenden Projekten möglich, das nukleinsäurebasierte Immboilisierungssystem zu einem modularen, nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystem zu erweitern, um die eingangs beschriebenen Grenzen etablierter Methoden zu umgehen. Dazu müssen im zweiten Prozessschritt Konjugate aus GS und bioaktiven Molekülen, wie z. B. Peptide oder Wachstumsfaktoren, eingesetzt werden. Weiterhin können durch die Nutzung verschiedener Längen und Basensequenzen die Hybridstabilität und damit die Freisetzungskinetik beeinflusst werden. / Surface functionalization with bioactive molecules is a main field in current biomaterial research. However, in vitro and in vivo results are heterogeneous. This may be at least partially attributed to the limits of the applied immobilization methods. With established immobilization methods possibilities are limited to immobilize different molecules in one step, to implement defined release kinetics for similar and/or different substances, or to carry out the immobilization after sterilization of the implant to save sensitive molecules from damage. Therefore in this thesis a nucleic acid based immobilization system for bioactive molecules is developed for titanium based materials. Using a peptide with the amino acid sequence arginine–glycine–aspartic acid (RGD) it is demonstrated at first, that small molecules, being present at the interface electrolyte/passive layer, can be immobilized by their partial incorporation in anodically formed oxide layers. The immobilization can be carried out in a wide range of electrochemical parameters and the peptide preserves its biological function under all conditions. This immobilization method is enhanced by utilizing single-stranded nucleic acids as anchor strands (AS), which can be hybridized by complementary strands (CS) in a second step. Contrary to the peptide, bound AS are damaged by the formation of reactive oxygen species during anodic polarization of the substrate, the photoyctivity of the titanium oxide layer and multiple drying and wetting cycles. These side effects must be constrained by adding ethanol in a high concentration to the electrolyte during the immobilization procedure, excluding light during preparation and avoiding multiple drying and wetting cycles. Applying these conutermeasures, a 100% hybridization of immobilized AS can be achieved. After establishing the nucleic acid based immobilization system it can be developed further to a modular, nucleic acid based immobilization system to overcome limitations of established immobilization methods. At first, conjugates of CS and bioactive molecules, such as peptides or growth factors, should be used in the hybridization step for a true functionalization of the surface. Furthermore, hybrid stability and thus release kinetics can be adjusted by using CS of different length and base sequences.

Die Entwicklung und Erprobung von metallischen Implantatwerkstoffen mit biologischen Beschichtungen für den Einsatz im menschlichen Knochen verlangt, neben der Untersuchung grundlegender zellbiologischer Wechselwirkungen, eine ganzheitliche Betrachtung ihrer Wirkungsweise im lebenden Organismus. Die vorwiegend angewandte Methode zur Quantifizierung des Potentials von Biofunktionalisierungen metallischer Implantate ist dabei die histologische Auswertung. Diese stützt sich aber auf Informationen aus nur wenigen und eher zufälligen Schnittlagen im Probenvolumen, was mit einer hohen Anzahl an Tierexperimenten ausgeglichen wird. Mit der Mikrocomputertomographie steht neben der klassischen Histologie eine zerstörungsfreie Methode zur Verfügung, welche eine detaillierte dreidimensionale Darstellung des neugebildeten Knochengewebes ermöglicht. Die Abbildungsqualität des mineralischen Knochengewebes um Titanimplantate, als Grundlage für eine Vergleichbarkeit von Tomographie und Histologie, wurde anhand von drei Mikrofokus-Computertomographen und einem Synchrotron-Computertomographen am HASYLAB untersucht. Die tomographische Untersuchung von Hartgewebe einschließlich metallischer Implantate zeigte mit Hilfe von Synchrotronstrahlung die beste qualitative Übereinstimmung zur histologischen Bildgebung. Für die Quantifizierung der Knochenneubildung wurden interaktive Analysemodelle erarbeitet, welche eine vereinheitlichte Auswertung von histologischen und tomographischen Informationen erlaubt. Auf Grundlage der entwickelten Analyseprozeduren war es erstmals möglich, die statistische Belastbarkeit der Ergebnisse aus der histologischen und tomographischen Analyse zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass hinsichtlich der Herausstellung von Unterschieden bei der Osseointegration modifizierter Titanimplantate mit beiden Methoden ähnliche Ergebnistrends gefunden werden. Eine Signifikanz (p < 0,01) der Unterschiede bei der Knochenneubildung konnte jedoch ausschließlich mit der mikrotomographischen Analyse herausgestellt werden. Die Ergebnisse bei der Darstellung und Analyse des mineralischen Gewebes durch die Nutzung der Synchrotrontomographie gehen weit über die Grenzen der histologischen Untersuchungen hinaus. Durch den dreidimensionalen Charakter der Informationen ergeben sich dabei neue Bewertungsmodelle zur Beurteilung der Osseointegration von biofunktionalisierten Implantaten. Die mikrotomographische Analyse führt gegenüber der histologischen Auswertung durch die geringe Irrtumswahrscheinlichkeit der Ergebnisse bei deutlich verminderter Probenanzahl zu einer erheblichen Verringerung von Tierversuchen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein modulares Nukleinsäure-basiertes System zur Immobilisierung von verschiedenen bioaktiven Molekülen untersucht. Zur Verankerung nutzt das System komplementäre Nukleinsäurestränge. Einer der beiden Stränge wird durch anodische Polarisation partiell in die anodische Oxidschicht eingebaut, an den komplementären Strang wird das biologische Molekül konjugiert. Der Vorteil des hier weiter entwickelten Immobilisierungssystems bildet dessen Vielseitigkeit. Es kann auf alle titanbasierenden Implantate übertragen werden und dadurch, dass ein universelles Verankerungssystem verfügbar ist, können verschiedene bioaktive Moleküle aufgebracht werden. Für die Übertragung des Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems auf reale Implantatoberflächenzustände konnten optimale Prozessbedingungen festgelegt werden. Weiterhin konnten verschiedene Ankerstrangsequenzen hinsichtlich ihres Einflusses auf Adsorption und Hybridisierungseffizienz beurteilt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode entwickelt werden, die es ermöglicht, das Immobilisierungssystem mit 25 kGy Standarddosis Gammastrahlung zu sterilisieren. Hierbei wurden verschiedene Strategien (Trocknung, Schutzgas, Opferstränge) untersucht und hinsichtlich ihrer Ankerstrangschutzfähigkeit bewertet. In Zell- und Tierversuchen konnte die biologische Aktivität der über das Immobilisierungssystem aufgebrachten Wachstumsfaktoren VEGF und BMP-2 gezeigt werden. Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein wichtiger Beitrag zur Weiterentwicklung eines Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems im Hinblick auf eine klinische Anwendung geleistet werden.

Ein Schlüsselfeld der gegenwärtigen Biomaterialforschung ist die Modifizierung von Oberflächen mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix (EZM) oder Molekülen, die bestimmte Funktionen nachahmen. Trotz einer Reihe positiver Ergebnisse in vitro und in vivo ist es mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Immobilisierungsmethoden nicht möglich, unterschiedliche Komponenten in einem Prozessschritt zu immobilisieren, definierte Freisetzungscharakteristika für gleiche und/oder unterschiedliche Moleküle zu realisieren und die Beschichtung der Oberflächen nach Sterilisation der Implantate vorzunehmen, um empfindliche bioaktive Substanzen, wie Proteine, vor Schädigung zu bewahren. An diesem Punkt setzt die vorliegende Arbeit mit dem Ziel an, ein nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem für Titanwerkstoffe zu entwickeln. Es wird zunächst am Beispiel eines Peptids mit der Aminosäuresequenz Arginin–Glyzin–Asparaginsäure (RGD) nachgewiesen, dass an der Grenzfläche Passivschicht/Elektrolyt von Titanwerkstoffen vorliegende Moleküle in durch anodische Polarisation verdickte Oxidschichten partiell eingebaut werden können und dabei ihre Funktionalität erhalten bleibt. Diese Immobilisierungsmethode wird zum Immobilisierungssystem erweitert, indem Nukleinsäureeinzelstränge mit der beschriebenen Methode als Ankerstränge (AS) in anodisch formierte Oxidschichten fixiert und in einem zweiten Prozessschritt mit komplementären Gegensträngen (GS) hybridisiert werden. In der Arbeit wird gezeigt, dass das Peptid in einem weiten Parameterbereich der elektrochemischen Bedingungen immobilisiert werden kann. Demgegenüber führen im Falle des nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystems die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die Photoaktivität der Oxidschicht sowie mehrfache Trocknungen und Wiederbenetzungen zu einer Schädigung gebundener AS bis hin zu einem vollständigen Verlust der Hybridisierbarkeit. Durch Zugabe von Ethanol in hoher Konzentration während des Immobilisierungsschritts, Arbeit unter Lichtausschluss sowie Vermeidung mehrerer Trocknungen und Wiederbenetzungen können die Nebenwirkungen soweit eingeschränkt werden, dass alle immobilisierten AS hybridisierbar sind. Nach dessen Etablierung im Rahmen dieser Arbeit ist es in nachfolgenden Projekten möglich, das nukleinsäurebasierte Immboilisierungssystem zu einem modularen, nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystem zu erweitern, um die eingangs beschriebenen Grenzen etablierter Methoden zu umgehen. Dazu müssen im zweiten Prozessschritt Konjugate aus GS und bioaktiven Molekülen, wie z. B. Peptide oder Wachstumsfaktoren, eingesetzt werden. Weiterhin können durch die Nutzung verschiedener Längen und Basensequenzen die Hybridstabilität und damit die Freisetzungskinetik beeinflusst werden.:1 Einleitung 1 2 Grundlagen 7 2.1 Titanbasislegierungen als Implantatwerkstoff 7 2.2 Biochemische Modifizierung von Titanoberflächen 22 2.3 Modulares Immobilisierungssystem 38 3 Materialien und Methoden 45 3.1 Werkstoffe 45 3.2 Biologisch aktive Moleküle 46 3.3 Elektrochemische Versuchsanordnung 51 3.4 Untersuchungsmethoden 52 4 Experimentelle Ergebnisse 69 4.1 Immobilisierung des RGD-Peptids 69 4.2 Nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem 118 5 Diskussion der Ergebnisse 143 5.1 Wechselwirkung zwischen Molekülen und Oberfläche 143 5.2 Fixierung adsorbierter Moleküle 155 6 Zusammenfassung und Ausblick 169 Literaturverzeichnis 175 Anhänge A Kodierung der Aminosäuren 209 B XPS-elementspektren ausgewählter Zustände 211 c Allgemeine Arbeitsvorschriften 215 D Geräte 221 / Surface functionalization with bioactive molecules is a main field in current biomaterial research. However, in vitro and in vivo results are heterogeneous. This may be at least partially attributed to the limits of the applied immobilization methods. With established immobilization methods possibilities are limited to immobilize different molecules in one step, to implement defined release kinetics for similar and/or different substances, or to carry out the immobilization after sterilization of the implant to save sensitive molecules from damage. Therefore in this thesis a nucleic acid based immobilization system for bioactive molecules is developed for titanium based materials. Using a peptide with the amino acid sequence arginine–glycine–aspartic acid (RGD) it is demonstrated at first, that small molecules, being present at the interface electrolyte/passive layer, can be immobilized by their partial incorporation in anodically formed oxide layers. The immobilization can be carried out in a wide range of electrochemical parameters and the peptide preserves its biological function under all conditions. This immobilization method is enhanced by utilizing single-stranded nucleic acids as anchor strands (AS), which can be hybridized by complementary strands (CS) in a second step. Contrary to the peptide, bound AS are damaged by the formation of reactive oxygen species during anodic polarization of the substrate, the photoyctivity of the titanium oxide layer and multiple drying and wetting cycles. These side effects must be constrained by adding ethanol in a high concentration to the electrolyte during the immobilization procedure, excluding light during preparation and avoiding multiple drying and wetting cycles. Applying these conutermeasures, a 100% hybridization of immobilized AS can be achieved. After establishing the nucleic acid based immobilization system it can be developed further to a modular, nucleic acid based immobilization system to overcome limitations of established immobilization methods. At first, conjugates of CS and bioactive molecules, such as peptides or growth factors, should be used in the hybridization step for a true functionalization of the surface. Furthermore, hybrid stability and thus release kinetics can be adjusted by using CS of different length and base sequences.:1 Einleitung 1 2 Grundlagen 7 2.1 Titanbasislegierungen als Implantatwerkstoff 7 2.2 Biochemische Modifizierung von Titanoberflächen 22 2.3 Modulares Immobilisierungssystem 38 3 Materialien und Methoden 45 3.1 Werkstoffe 45 3.2 Biologisch aktive Moleküle 46 3.3 Elektrochemische Versuchsanordnung 51 3.4 Untersuchungsmethoden 52 4 Experimentelle Ergebnisse 69 4.1 Immobilisierung des RGD-Peptids 69 4.2 Nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem 118 5 Diskussion der Ergebnisse 143 5.1 Wechselwirkung zwischen Molekülen und Oberfläche 143 5.2 Fixierung adsorbierter Moleküle 155 6 Zusammenfassung und Ausblick 169 Literaturverzeichnis 175 Anhänge A Kodierung der Aminosäuren 209 B XPS-elementspektren ausgewählter Zustände 211 c Allgemeine Arbeitsvorschriften 215 D Geräte 221