Arteriosklerose führt zu schwerwiegenden klinischen Komplikationen bei Herz-Kreislauf-erkrankungen, welche die führenden Todesursachen in den westlichen Industrieländern sind. Die Arteriosklerose ist typischerweise eine Erkrankung arterieller Gefäße und betrifft nicht die venöse Gefäßwand. Bei der Entstehung von Arteriosklerose spielen die Endothelzellen als Barrierezellen und Regulatoren der Gefäßfunktion eine Schlüsselrolle. Ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung ist die Differenzierung der Endothelzellen. Arterielle und venöse Endothelzellen weisen schon im frühen Embryonalstadium unterschiedliche Phänotypen auf. Ein besseres Verständnis der arterio-venösen Differenzierung wäre von großer Bedeutung für antiarteriosklerotische Therapien. Darüber hinaus könnte eine Reprogrammierung (z.B. von Vene in Arterie) entscheidend für neue Therapieansätze bei der Senkung der Restenoserate venöser Bypässe von Patienten mit koronarer Herzkrankheit und bei AV-Shunt-Operationen von dialysepflichtigen Patienten sein. In dieser Arbeit wurden differenzierte humane primäre arterielle und venöse Endothelzellen nach Genmodulation untersucht. Der Fokus der Genmodulation wurde auf das arterielle Markergen Hey2 und auf das venöse Markergen COUP-TFII gelegt. Das arterielle Markergen Hey2 ist ein Zielgen der Notch-Signalkaskade, während der molekulare Mechanismus der Rolle von COUP-TFII bei der venösen Differenzierung noch nicht bekannt ist. Daher wurde der Einfluss des arteriellen Markergens Hey2 und des venösen Markergens COUP-TFII auf die Notch-Signalkaskade untersucht, um ein besseres Verständnis über die molekularen Mechanismen der arterio-venösen Differenzierung zu gewinnen. Da humane primäre Endothelzellen mit kommerziell verfügbaren Transfektionsmitteln schwer transfizierbar sind, wurde zunächst ein lentivirales Vektorsystem etabliert. Hiermit wurde eine erfolgreiche und stabile Genexpression bzw. Genrepression in arteriellen und venösen Endothelzellen ermöglicht. Die Genmodulationen in arteriellen Endothelzellen, die durch die Expression des venösen Markergen COUP-TFII bzw. durch die Repression des arterellen Markergen Hey2 verursacht wurden, führten zu der neuen Erkenntnis, dass das venöse Markergen COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen als ein Repressor des arteriellen Markergens Hey2 fungiert. Diese Repression wird durch eine direkte Bindung von COUP-TFII an den Hey2-Promotor vermittelt. Die COUP-TFII Expression bewirkte keine Veränderung in der Expression von Notch4, Dll4 und Nrp1. Dies könnte bedeuten, dass (i) COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen kein Regulator von diesen Genen ist, (ii) Kooperationspartner von COUP-TFII fehlen, die in arteriellen Endothelzellen nicht vorhanden sind, oder (iii) der molekulare Mechanismus dieser Gene aufgrund seiner wichtigen Rolle nicht durch die Modifikation eines einzigen Gens beeinflussbar ist, da die Gene der Notch-Signalkaskade redundant kontrolliert werden. In venösen Endothelzellen wurden Genmodulationen durch Expression des arteriellen Markergens Hey2 bzw. durch die Repression des venösen Markergens COUP-TFII durchgeführt. Eine Expression des arteriellen Markergens Hey2 in venösen Endothelzellen konnte nicht die Expression der Gene der Notch-Signalkaskade aktivieren. Dies bedeutet, dass die Regulation dieser Gene durch einen übergeordneten molekularen Mechanismus gesichert ist. Interessanterweise konnte die Expression von Hey2 eine Reduktion der Hey1 Expression bewirken. Dies ist ein alternativer Effekt von Hey2 im Vergleich zu arteriellen Endothelzellen. Eine Repression des venösen Markergens COUP-TFII konnte die Expression der Gene Dll4, EphrinB2 und EphB4 induzieren. Vermutlich ist die Induktion der EphB4 Expression ein Kompensationsmechanismus auf die reduzierte COUP-TFII Expression. COUP-TFII sichert den venösen Phänotyp wahrscheinlich durch die Repression von EphrinB2 und Dll4, wobei die Reduktion von Dll4 vermutlich eine größere Bedeutung hat. Da Dll4 ein Ligand und Aktivator der Notch-Signalkaskade ist, ist seine Repression entscheidend für venöse Endothelzellen. Das arterielle Markergen Hey2 ist für die normale Embryogenese von großer Bedeutung, jedoch ist Hey2 als eines der Zielgene der Notch-Signalkaskade wahrscheinlich nicht in der Lage, molekulare Mechanismen, die zu unterschiedlichen endothelialen Phänotypen führen, zu aktivieren. Um arterielle Endothelzellen zu einem Reprogramming zu bewegen, wären wahrscheinlich Genmodulationen der Mitglieder der Notch-Signalkaskade, die upstream von Hey2 liegen, nötig. Hingegen ist die Rolle des venösen Markergens COUP-TFII in der Regulation der arterio-venösen Differenzierung von entscheidender Bedeutung. COUP-TFII spielt eine direkte Rolle in der Aufrechterhaltung der venösen Identität. Die Repression von COUP-TFII in venösen Endothelzellen bewirkt, dass sich die Expression des Gens Dll4, das die Notch-Signalkaskade aktiviert, in Richtung des arteriellen Expressionsniveaus bewegt. Für eine Reprogrammierung der venösen Endothelzellen in einen arteriellen Phänotyp ist das venöse Markergen COUP-TFII eines der Zielgene.

Arteriosklerose führt zu schwerwiegenden klinischen Komplikationen bei Herz-Kreislauf-erkrankungen, welche die führenden Todesursachen in den westlichen Industrieländern sind. Die Arteriosklerose ist typischerweise eine Erkrankung arterieller Gefäße und betrifft nicht die venöse Gefäßwand. Bei der Entstehung von Arteriosklerose spielen die Endothelzellen als Barrierezellen und Regulatoren der Gefäßfunktion eine Schlüsselrolle. Ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung ist die Differenzierung der Endothelzellen. Arterielle und venöse Endothelzellen weisen schon im frühen Embryonalstadium unterschiedliche Phänotypen auf. Ein besseres Verständnis der arterio-venösen Differenzierung wäre von großer Bedeutung für antiarteriosklerotische Therapien. Darüber hinaus könnte eine Reprogrammierung (z.B. von Vene in Arterie) entscheidend für neue Therapieansätze bei der Senkung der Restenoserate venöser Bypässe von Patienten mit koronarer Herzkrankheit und bei AV-Shunt-Operationen von dialysepflichtigen Patienten sein. In dieser Arbeit wurden differenzierte humane primäre arterielle und venöse Endothelzellen nach Genmodulation untersucht. Der Fokus der Genmodulation wurde auf das arterielle Markergen Hey2 und auf das venöse Markergen COUP-TFII gelegt. Das arterielle Markergen Hey2 ist ein Zielgen der Notch-Signalkaskade, während der molekulare Mechanismus der Rolle von COUP-TFII bei der venösen Differenzierung noch nicht bekannt ist. Daher wurde der Einfluss des arteriellen Markergens Hey2 und des venösen Markergens COUP-TFII auf die Notch-Signalkaskade untersucht, um ein besseres Verständnis über die molekularen Mechanismen der arterio-venösen Differenzierung zu gewinnen. Da humane primäre Endothelzellen mit kommerziell verfügbaren Transfektionsmitteln schwer transfizierbar sind, wurde zunächst ein lentivirales Vektorsystem etabliert. Hiermit wurde eine erfolgreiche und stabile Genexpression bzw. Genrepression in arteriellen und venösen Endothelzellen ermöglicht. Die Genmodulationen in arteriellen Endothelzellen, die durch die Expression des venösen Markergen COUP-TFII bzw. durch die Repression des arterellen Markergen Hey2 verursacht wurden, führten zu der neuen Erkenntnis, dass das venöse Markergen COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen als ein Repressor des arteriellen Markergens Hey2 fungiert. Diese Repression wird durch eine direkte Bindung von COUP-TFII an den Hey2-Promotor vermittelt. Die COUP-TFII Expression bewirkte keine Veränderung in der Expression von Notch4, Dll4 und Nrp1. Dies könnte bedeuten, dass (i) COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen kein Regulator von diesen Genen ist, (ii) Kooperationspartner von COUP-TFII fehlen, die in arteriellen Endothelzellen nicht vorhanden sind, oder (iii) der molekulare Mechanismus dieser Gene aufgrund seiner wichtigen Rolle nicht durch die Modifikation eines einzigen Gens beeinflussbar ist, da die Gene der Notch-Signalkaskade redundant kontrolliert werden. In venösen Endothelzellen wurden Genmodulationen durch Expression des arteriellen Markergens Hey2 bzw. durch die Repression des venösen Markergens COUP-TFII durchgeführt. Eine Expression des arteriellen Markergens Hey2 in venösen Endothelzellen konnte nicht die Expression der Gene der Notch-Signalkaskade aktivieren. Dies bedeutet, dass die Regulation dieser Gene durch einen übergeordneten molekularen Mechanismus gesichert ist. Interessanterweise konnte die Expression von Hey2 eine Reduktion der Hey1 Expression bewirken. Dies ist ein alternativer Effekt von Hey2 im Vergleich zu arteriellen Endothelzellen. Eine Repression des venösen Markergens COUP-TFII konnte die Expression der Gene Dll4, EphrinB2 und EphB4 induzieren. Vermutlich ist die Induktion der EphB4 Expression ein Kompensationsmechanismus auf die reduzierte COUP-TFII Expression. COUP-TFII sichert den venösen Phänotyp wahrscheinlich durch die Repression von EphrinB2 und Dll4, wobei die Reduktion von Dll4 vermutlich eine größere Bedeutung hat. Da Dll4 ein Ligand und Aktivator der Notch-Signalkaskade ist, ist seine Repression entscheidend für venöse Endothelzellen. Das arterielle Markergen Hey2 ist für die normale Embryogenese von großer Bedeutung, jedoch ist Hey2 als eines der Zielgene der Notch-Signalkaskade wahrscheinlich nicht in der Lage, molekulare Mechanismen, die zu unterschiedlichen endothelialen Phänotypen führen, zu aktivieren. Um arterielle Endothelzellen zu einem Reprogramming zu bewegen, wären wahrscheinlich Genmodulationen der Mitglieder der Notch-Signalkaskade, die upstream von Hey2 liegen, nötig. Hingegen ist die Rolle des venösen Markergens COUP-TFII in der Regulation der arterio-venösen Differenzierung von entscheidender Bedeutung. COUP-TFII spielt eine direkte Rolle in der Aufrechterhaltung der venösen Identität. Die Repression von COUP-TFII in venösen Endothelzellen bewirkt, dass sich die Expression des Gens Dll4, das die Notch-Signalkaskade aktiviert, in Richtung des arteriellen Expressionsniveaus bewegt. Für eine Reprogrammierung der venösen Endothelzellen in einen arteriellen Phänotyp ist das venöse Markergen COUP-TFII eines der Zielgene.

Die Angiogenese ist entscheidend an wichtigen physiologischen Prozessen wie Wachstum, Reproduktion oder Heilung beteiligt. Jedoch spielt sie auch bei der Pathogenese spezifischer Erkrankungen eine wichtige Rolle. Bis jetzt ist der komplexe Mechanismus der physiologischen Angiogenese nur unzureichend verstanden. So wird angenommen, dass humane Endothelzellen über eine autokrine cholinerge Regulation Angiogenese physiologisch beeinflussen und dass dies Teil des non-neuronalen cholinergen Systems ist. Sind humane Endothelzellen in der Lage Acetylcholin zu produzieren? Beeinflusst dieser endogene Ligand über cholinerge Rezeptoren physiologisch Angiogenese und ist dies Teil des non-neuronalen cholinergen Systems? Dazu wurden humane Endothelzellen aus Nabelschnurvenen (HUVEC) für 5 Tage bis zu einer 80%igen Konfluenz kultiviert und anschließend auf ein in vitro Angiogenesis Assay (Matrigel) aufgebracht. Nach ca. 18 h Inkubation konnte die Ausbildung eines Kapillarnetzwerkes beobachtet werden, welches mittels festem Schema bewertet wurde. Während der gesamten Inkubation erfolgte entweder die Hemmung der Acetylcholinesterase mittels Eserin-Hemisulfat zur Steigerung der Acetylcholinkonzentration oder die Blockierung des Re-Uptakes des Cholins zur Senkung der Acetylcholinkonzentration mittels Hemicholinium-3. Zur Untersuchung der verschiedenen Rezeptoren erfolgte stets die Stimulation mit Eserin-Hemisulfat sowie abhängig davon welche Rezeptoren untersucht werden sollten, die Hemmung der muscarinergen Acetylcholinrezeptoren (mAChR) durch Atropin oder die Hemmung der nicotinergen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) durch Mecamylamin. Zur Sub-Spezifizierung der nACh-Rezeptoren erfolgte jeweils die Zugabe von Eserin-Hemisulfat zur Steigerung der Acetylcholinkonzentration, von Atropin zur Blockierung der muscarinergen Acetylcholinrezeptoren und zur Blockierung der jeweiligen Sub-Typen des nicotinergen Acetylcholinrezeptors, entweder α-Bungarotoxin (Blockierung α7-Untereinheit), Lobelin-Hydrochlorid (Blockierung α4/β2-Untereinheit) oder Dihydro-β-Erythroidin (Blockierung α3/β2-Untereinheit und α4/β2-Untereinheit). Zur Quantifizierung der Acetylcholinkonzentration aus dem Zellüberstand kam ein kolorimetrisches Nachweisverfahren zur Anwendung. Des Weiteren wurde eine immunhistologische Färbung zum Nachweis der Cholin-Acetyltransferase (ChAT) durchgeführt. Durch Hemmung der Acetylcholinesterase mittels Eserin-Hemisulfat konnte mittels kolorimetrischem Nachweisverfahren eine signifikant erhöhte Acetylcholinkonzentration im Zellüberstand beobachtet werden. Des Weiteren wurde mittels immunhistologischer Färbung das Enzym Cholin-Acetyltransferase (ChAT) nachgewiesen. Bei Blockierung der verschiedenen Rezeptoren bei gleichzeitig gesteigerter Acetylcholinkonzentration fiel bei der Hemmung der nAChR und Stimulation über die mAChR eine signifikant gesteigerte Komplexität des Kapillarnetzwerks, eine gesteigerte Kapillarlänge sowie eine gesteigerte Zellzahl auf. Dies zeigte sich bei der Wirkung nur über die nicotinergen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) umgekehrt. Eine Hemmung der mAChR sowie α3/β2- und α4/β2-Subtypen des nAChR durch Dihydro-β-Erythroidin bei bevorzugter Stimulation über den α7-Subtyp führte zu einer gesteigerten Kapillarlänge. Wurde der α7-Subtyp des nAChR jedoch durch α-Bungarotoxin blockiert, führte dies nicht zu einer verkürzten Kapillarlänge. Bei der Blockierung des α4/β2-Subtyp des nAChR durch Lobelin-Hydrochlorid ließ sich nahezu kein Effekt auf die endotheliale Angiogenese beobachten. Schlussfolgerung: Insgesamt darf aus diesen Ergebnissen geschlossen werden, dass humane Endothelzellen Acetylcholin produzieren und über die entsprechenden Enzyme zur Herstellung und zum Abbau des Transmitters verfügen. Sie beeinflussen über diesen endogenen Liganden mittels cholinerger Rezeptoren die Angiogenese. Der Effekt scheint sich bei Stimulation aller cholinerger Rezeptoren auszugleichen. Werden nur die mAChR mittels Acetylcholin stimuliert hat dies eine gesteigerte Kapillarlänge, eine gesteigerte Komplexität des Kapillarnetzwerkes sowie eine gesteigerte Zellzahl zur Folge. Bei Stimulation aller nAChRs und Blockierung der mAChRs, zeigt sich insgesamt eine geringere Kapillarlänge mit weniger Abzweigungen. Abhängig vom Subtyp der nAChR bildet sich eine geringere Komplexität des Kapillarnetzwerks mit weniger Abzweigungen bei teilweiser gesteigerter oder geringerer Kapillarlänge aus. Wird der α7-Subtyp des nAChR blockiert, bildeten sich signifikant längere Kapillaren mit signifikant weniger Abzweigungen. Insgesamt ist dieser autokrine Mechanismus des Acetylcholins an den cholinergen Rezeptoren Teil des non-neuronalen cholinergen Systems:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis IV Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Angiogenese 2 1.2 Endothelzellen 4 1.3 Das non-neuronale cholinerge System 6 1.3.1 Acetylcholin 9 1.3.2 Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 10 1.3.3 Acetylcholinesterase 11 1.4 Die cholinergen Rezeptoren 12 1.4.1 Der muscarinerge Acetylcholin-Rezeptor (mAChR) 12 1.4.2 Der nicotinerge Acetylcholinrezeptor (nAChR) 13 1.5 Fragestellung 14 2 Materialliste 16 2.1 Chemikalien 16 2.2 Allgemeine Geräte 17 2.3 Präparierbesteck 20 2.4 Zellkultur 20 2.5 Zellzahlbestimmung 21 2.6 Behandlung der Zellen 22 2.7 In vitro Angiogenesis Assay, Matrigel (3D-Zellkultur) 22 2.8 Immunhistologie Cholin-Acetyltransferase 23 2.9 Acetylcholine Quantification Assay 24 2.10 Software 24 3 Methoden 25 3.1 Gewinnung humaner Endothelzellen aus Nabelschnüren 25 3.2 Behandlung der Zellen 27 3.3 In vitro Angiogenesis Assay, Matrigel (3D-Zellkultur) 29 3.4 Fluoreszenzmikroskopie 31 3.5 Auswertung Fluoreszenzaufnahmen 31 3.6 Immunhistologie Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 32 3.7 Acetylcholine Quantification Assay 34 3.8 Statistische Auswertung 35 4 Ergebnisse 36 4.1 Quantitativer Nachweis von Acetylcholin 36 4.2 Immunhistologischer Nachweis der Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 38 4.3 Effekt von Acetylcholin auf die endotheliale Angiogenese 38 5 Diskussion 49 6 Zusammenfassung 56 7 Literaturverzeichnis VII Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XVII Lebenslauf XVIII Publikationen im Zusammenhang mit dieser Arbeit XXII Danksagung

Die Psoriasis ist mit einer Prävalenz von 1-3% eine der häufigsten chronisch-entzündlichen Erkrankungen. Histopathologisch ist sie gekennzeichnet durch epidermale Hyperkeratose und Akanthose, gesteigerte Angiogenese sowie ein gemischtzelliges leukozytäres Infiltrat. Aus aktueller Sicht wird sie als eine komplexe primär T-Zell vermittelte Autoimmunerkrankung mit genetischer Prädisposition verstanden. Psoriasis kann mit kardiovaskulären, metabolischen und psychiatrischen Erkrankungen assoziiert sein (Komorbidität). Hier wurde erstmals die Wirkung des inositoylierten Plättchen-aktivierenden Faktors (Ino-C2-PAF), eines synthetischen Alkylphospholipids mit geringer Toxizität, in experimentellen Modellen chronisch-entzündlicher (Haut)-Erkrankungen untersucht. Die Wirkung beruht auf Zellmembran-Interaktionen, wodurch der Cholesterol- und Phospholipidmetabolismus verändert und zelluläre Signalkaskaden der Proliferation, Apoptose und Motilität beeinträchtigt werden. Ino-C2- PAF reguliert außerdem entzündungsrelevante Proteine herab. In vitro lag der Schwerpunkt auf der Wirkung von Ino-C2-PAF auf Endothelzellen und Leukozyten. Ino-C2-PAF hemmte die Proliferation humaner Endothelzellen moderat, steigerte allerdings die Apoptose TNFα-stimulierter Endothelzellen sehr deutlich. Diese Wirkung war begleitet von einer Reduktion der durch TNFα stimulierbaren endothelialen Adhäsionsmoleküle VCAM-1, ICAM-1 und E-Selektin sowie der lymphozytären Adhäsionsmoleküle CD49d, CD11a, CD62L und CLA. Funktionell führte dies zu einer signifikanten Abnahme dynamischer Interaktionen (Rollen und feste Adhäsion) von Leukozyten und aktivierten Endothelzellen in Flusskammerexperimenten. Die anti-entzündliche Wirkung von Ino-C2-PAF wurde in zwei komplementären Modellen in vivo bestätigt. Sowohl in K5.hTFGß-transgenen als auch in JunB/c-Jun-defizienten Mäusen bewirkte Ino-C2-PAF eine signifikante Besserung des psoriasiformen Phänotyps sowohl auf makroskopischer als auch auf histopathologischer Ebene. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass Ino-C2-PAF oder verwandte Substanzen zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen wie der Psoriasis eingesetzt werden könnten.

Alternatives Spleißen ist von großer Bedeutung für die Steuerung der Genexpression und Proteindiversität. Die Cdc2-like Kinasen (Clk) und DNA Topoisomerase I (DNA topo I) steuern alternatives Spleißen über die Phosphorylierung von Serine/Arginin-reichen (SR) Proteinen. Tissue Factor (TF) und die endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) beeinflussen maßgeblich die Endothelfunktion. Alternatives Spleißen führt zur Bildung von Isoformen von TF („full length“ (fl)TF, alternativ gespleißter humaner (asH)TF) und eNOS (eNOS, eNOS 13A, B und C). Wie das alternative Spleißen von TF und eNOS gesteuert wird und welchen Einfluss dies auf die Endothelfunktion hat ist unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Die TNF-a-Stimulation der HUVEC erhöhte die Expression beider TF-Isoformen. Die Clk-Inhibition reduzierte die mRNA-Expression von flTF und asHTF. Die DNA topo I-Inhibition erhöhte die asHTF-Expression und verringerte flTF. Die Inhibition der DNA topo I reduzierte ebenfalls die Expression des flTF-Proteins aber nicht von asHTF, verbunden mit einer reduzierten TF-Aktivität. Die Clk-Inhibition reduzierte das flTF-Protein und die TF-Aktivität nur leicht aber asHTF vollständig. Die Inhibition der Kinasen beeinflusste das SR Protein-Phosphorylierungsmuster. Die Inhibition von SF2/ASF und SRp75 mittels siRNAs veränderte die Expression und die Aktivität von TF in HUVEC. Die TNF-a-Stimulation von HUVEC induzierte ferner die mRNA-Expression von eNOS 13A, B und C, nicht aber von eNOS. Dies führte zu einer Reduktion der eNOS-Aktivität. Die Inhibition der DNA topo I, nicht aber der Clks hob diese Effekte auf. Diese Daten zeigen, dass die DNA topo I sowie die Clks an der Regulation der endothelialen TF-Expression und Aktivität beteiligt sind, während die eNOS-Isoformexpression und Aktivität nur durch die DNA topo I beeinflusst wurde.Diese Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation des alternativen Spleißens von TF und eNOS sowie dessen Einfluss auf die Endothelfunktion. / Alternative splicing is an important mechanism to control gene expression and protein diversity. The Cdc2-like kinases (Clk) and DNA topoisomerase I (DNA topo I) control alternative splicing by regulating the phosphorylation state of serine/arginine-rich (SR) proteins. Tissue Factor (TF) and the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) are crucial for the endothelial function. Alternative splicing lead to the formation of different isoforms of TF („full length“ (fl)TF, alternatively spliced human (asH)TF) and eNOS (eNOS, eNOS 13A, B and C). How alternative splicing of TF and eNOS is regulated as well as the impact on endothelial function is still unknown and was investigated in this study. The stimulation of HUVEC with TNF-a induced the expression of both TF isoforms. The inhibition of Clks reduced the mRNA expression of flTF and asHTF. DNA topo I inhibition increased asHTF and reduced flTF mRNA expression. Inhibition of DNA topo I also reduced flTF but not asHTF on protein level in stimulated cells leading to a reduced TF activity. Clk-inhibition slightly reduced flTF protein and TF activity, whereas asHTF was completely blocked. The inhibition of both kinases altered the phosphorylation pattern of SR proteins. The siRNA-mediated inhibition of SF2/ASF and SRp75 modified the TF isoform expression and TF activity in TNF-a-induced HUVEC. Moreover, stimulation of HUVEC with TNF-a induced the mRNA expression of eNOS 13A, B and C, but not of eNOS. This led to a reduction of eNOS activity. The inhibition of DNA topo I but not of Clks abolished these TNF-a-mediated effects in HUVEC. These data indicate DNA topo I and the Clks to be involved in the regulation of endothelial TF expression and activity, whereas, eNOS isoform expression and activity was influenced by DNA topo I, but not Clks in TNF-a-stimulated HUVEC. In conclusion, this study reveals new insights into the regulation of alternative splicing of TF and eNOS and the impact of these processes on endothelial function.

Zusammenfassung in PDF Zielstellung: Der biologische Botenstoff N ist von signifikanter Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des Herz-Kreislauf-Systems. Pathologische Bedingungen sind oft auf eine veränderte Verfügbarkeit von N zurückzuführen. Das Verständnis der Regulierung der N-Bildung durch Endothelzellen (EC) und die nachfolgende N-Chemie im gesunden und kranken Organismus ist deshalb essentiell, jedoch längst nicht vollständig. Das Ziel dieser Dissertation war aus diesem Grund Untersuchungen zum Schutz von N vor der Wechselwirkung mit S (durch SOD-mimetische Nitroxide), sowie zum Effekt des Membranpotentials (Em) und des Zellwachstums (Proliferation) auf die Aktivität der endothelialen N Synthase (eNOS) an Kulturen von Atrium-Endothelzellen des Rindes (BAtEC). Methoden: Zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von N wurde die ozon-vermittelte N-Chemolumineszenz (N-CL) evaluiert, modifiziert und an verschiedene in vitro Systeme angepaßt. Die N-CL wurde auf Grundlage des durch SOD hemmbaren Abbaus von N durch S als ein neuartiger Ansatz zur Bestimmung physiologisch niedriger Konzentrationen an S vorgeschlagen. Ergebnisse: Die Nitroxide -hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl und 3-ethoxycar-bonyl-proxyl erhöhten die N-Konzentration durch ihre SOD-mimetische Wirkung in Modellsystemen von 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) und Kulturen von BAtEC. Mittels ESR-Spin-Trap Untersuchungen an Lösungen von SIN-1 wurde die Bildung von H-Addukten durch Dismutierung von S bestätigt, Peroxynitrit wurde als Quelle ausgeschlossen. Modulierung des Em (durch Veränderung der extrazellulären K + -Konzentration) beeinflußte die endotheliale N-Freisetzung; Hyperpolarisierung erhöhte, Depolarisierung verminderte die N Produktion. Inhibierung der elektrogenen Na + -K + ATPase induzierte synchrone Oszillationen der endothelialen N-Freisetzung. Die systematische Untersuchung zu EC-Wachstum/Proliferation zeigte keine Änderung der N-Produktion (in Gegenwart von SOD). Jedoch war die Menge von verfügbarem N (in der Abwesenheit von SOD) niedrig in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Die Expression der eNOS erhöhte sich mit der Kultivierungsdauer und erreichte ein Maximum bei Konfluenz. Die relative eNOS-Aktivität (N, 2-, und L-citrulline-Produktion pro eNOS-Protein) war am größten in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Schlußfolgerungen: Die Wechselwirkung mit S ist kritisch für die Halbwertszeit von N. Aus der durch diese Studie gezeigten Erhöhung von N in biologischen und chemischen Modellsystemen kann geschlußfolgert werden, daß Nitroxide unter Bedingungen einer S-bedingten Verminderung von verfügbarem N pharmakologische Wirksamkeit besitzen könn-ten. Untersuchungen ergaben den Nachweis zur Em-abhängigen Modulierung der endothelialen N-Freisetzung. Dies liefert eine Erklärung für die Em-bedingten Veränderungen des Gefäßto-nus, nachgewiesen während physiologischer Zellstimulierung, aber auch unter pathologischen Bedingungen. Untersuchungen zu EC-Wachstum/Proliferation lieferten den Beweis für die Ver-minderung von verfügbarem N in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC durch endogen gebildetes S. Die Expremierung von eNOS war proliferationsabhängig. Die spezifische eNOS-Aktivität war in proliferierenden BAtEC erhöht (wahrscheinlich durch post-translationale Verän-derungen) und in ruhenden BAtEC erniedrigt (wahrscheinlich durch Substrat- oder Kofaktormangel). / abstract in pdf Objective: The biological messenger n is of significant importance for the functionality of the cardiovascular system. Pathological conditions are often attributed to an altered availability of n. The understanding of the regulation of n formation by endothelial cells (EC) and the concomitant chemistry of n in health and disease is therefore essential but far from being complete. The objective of this dissertation was therefore to study in culture systems of bovine atrial endothelial cells (BAtEC) the protection of n from the interaction with S by SOD-mimetic nitroxides, and the effect of the membrane potential (Em) and cell growth/proliferation on the activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Methods: For the sensitive and specific detection of n, the ozone-mediated n chemiluminescence (n-CL) was evaluated, modified and adapted to various in vitro systems. Due to the SOD-inhibitable degradation of n by S , the n-CL was proposed as a novel approach to quantify the physiological low levels of S . Results: The nitroxides 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl, and 3-ethoxycarbonyl-proxyl increased the n concentration by their SOD-mimetic action in a model system of 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) and cultures of BAtEC. EPR spin trapping in SIN-1 solution revealed the formation of H adducts due to dismutation of S and not via decomposition of peroxynitrite. Changes in Em (by alteration of the extracellular K + concentration) affected the endothelial n release; membrane hyperpolarization increased, membrane depolarization decreased the n production. Inhibition of the electrogenic Na + -K + ATPase induced synchronous oscillations in endothelial n liberation. The systematic investigations on EC growth/proliferation showed no change in total n production (in the presence of SOD). However, the bioavailable n (in the absence of SOD) was low in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Expression of eNOS increased with culture duration with a maximum at confluence. Relative eNOS activity (n, 2, and L-citrulline production per eNOS protein) was highest in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Conclusions: The interaction of S is critical for the half-life of n. With the increase of n in biological and chemical model systems shown by this study, nitroxides might exert pharmacological potential under conditions of S -mediated diminution of bioavailable n. Experimental evidence was shown for the Em-dependent modulation of endothelial n formation. It supports an explanation for the Em-mediated changes of vascular tone, as demonstrated for physiological cell stimulation but also under pathological conditions. Investigations on the EC growth/proliferation provided evidence that BAtEC-derived S decreases bioavailable n in preconfluent, highly proliferating BAtEC, whereas expression of eNOS is proliferation-dependent. The specific eNOS activity is upregulated in proliferating BAtEC (probably via post-translational modifications) and down-regulated in quiescent BAtEC (probably via substrate or cofactor limitations).

Während die zellulären Mechanismen der Pathogenese der Arteriosklerose intensiv untersucht worden sind, ist über die Mechanismen, die zu einer bevorzugten Lokalisation arteriosklerotischer Läsionen in bestimmten Gefäßarealen führen, weniger bekannt. Zur Untersuchung dieser Mechanismen wurden Endothelzellen aus menschlichen Koronararterien, einem Gefäßbereich, in dem häufig arteriosklerotische Läsionen beobachtete werden, isoliert und kultiviert. Endothelzellen der Mikrozirkulation menschlicher Herzen wurden unter gleichen Bedingungen kultiviert und die Reaktionen beider Zellarten verglichen. Inkubation der Zellen mit den in Bezug auf die Bildung arteriosklerotischer Plaques besonders pathogenen oxidierten LDL induzierte in makrovaskulären koronaren Endothelzellen eine stärkere Zunahme der PAI-1 Aktivität (182%, p / While the cellular mechanisms of atherosclerosis have been intensively studied, the mechanisms leading to preferential localization of atherosclerotic lesions are less well understood. To further define these mechanisms, endothelial cells from coronary arteries, i.e. vessels with frequent atherosclerotic lesions, were isolated and grown in vitro. In order to compare the reactions of both cell types, endothelial cells derived from microvessels of human hearts were isolated and cultured under identical conditions. Incubation of endothelial cells with oxidized LDL (75 µg/ml protein) induced a significant increase in PAI-1 activity (182 %, p

Angiopoietin-2 (Ang-2) wirkt gefäßdestabilisierend und ist Voraussetzung für das Aussprossen von Gefäßen am Anfang der angiogenen Kaskade. Die Expression des Antagonisten der endothelialen Rezeptor-Tyrosin-Kinase Tie-2 ist streng gewebsspezifisch reguliert. Trotz des Zusammenhangs von Ang-2 und pathologischer Angiogenese sind die molekularen Mechanismen der ang-2 Regulation noch unverstanden. Mittels Microarray wurden die genomweiten Expressionsänderungen in endothelialen Zellen nach Behandlung mit dem demethylierenden 5-Aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-dC) untersucht. Unter den induzierten Genen wurde ang-2 mit dem Fokus auf angiogeneserelevante Gene identifiziert. Obwohl die Endothelzellen unter Kontrollbedingungen ang-2 exprimieren, wurde die Expression durch Demethylierung weiter gesteigert. Es wurden jedoch keine potentiellen CpG-Inseln in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts identifiziert. Diese Daten lassen auf einen methylierungsunabhängigen Effekt von 5-Aza-dC auf die ang-2 Expression schließen. Zur molekularen Untersuchung der ang-2 Expression wurden 3kb der 5´-flankierenden Sequenz des humanen ang-2 Gens kloniert und der Transkriptionsstartpunkt (TS) bestimmt. Durch funktionelle 5´-Deletionsanalyse und zielgerichtete Mutagenese wurden regulatorische Promotorelemente identifiziert. Die Promotorregion -105 bis +51 relativ zum TS war ausreichend für die Vermittlung der basalen ang-2 Expression. Mittels Bindungsstudien wurden die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 als Proteine, die primär an den ang-2 Minimalpromotor binden, identifiziert. Die Basen -78 bis -74 relativ zum TS sind eine essentielle Sp-Bindestelle für die Regulation der ang-2 Expression. Durch Mutation von potentiellen Bindungsstellen für Proteine der ETS-Familie wurde die ang-2 Promotoraktivität signifikant reduziert. Jedoch konnte die Spezifität von ETS-Proteinen in Bindungsstudien nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben neue Einblicke in die ang-2 Regulation offenbart und zeigen, dass die Sp1/Sp3-abhängige Aktivierung des proximalen Promotorbereichs (-105/-56) entscheidend für die transkriptionelle ang-2 Regulation in Endothelzellen ist. / Angiopoitein-2 (Ang-2) acts destabilizing on blood vessels and is mandatory for the onset of the angiogenic cascade. The expression of the antagonistic ligand of the endothelial cell tyrosine kinase receptor Tie-2 is tightly regulated. Despite the accumulating evidence confirming the involvement of Ang-2 in pathologic angiogenesis, the molecular mechanisms controlling ang-2 expression are still unclear. Using microarray analysis, the global changes of gene expression were investigated after treatment of endothelial cells with the demethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (5-aza-dC). Focusing on angiogenesis related genes, ang-2 was identified among the upregulated ones. Although endothelial cells expressed ang-2 under control conditions already the expression was further increased by drug-induced demethylation. A screen for CpG-islands revealed no putative islands surrounding the transcription initiation site. These data indicate a methylation-independent effect of 5-aza-dC on the ang-2 expression. To elucidate underlying molecular mechanisms of ang-2 expression, 3kb of the human ang-2 gene were cloned and the transcription start site (TS) determined. Regulatory promoter elements were identified by functional 5’-deletion analysis and site-directed mutagenesis. The promoter region -105 to +51 relative to TS was recognized as sufficient and necessary for the ang-2 gene transcription. Electrophoretic Mobility Shift Assays revealed Sp1 and Sp3 as dominant nuclear proteins binding to the ang-2 promoter. The region spanning -78/-74 was identified as essential Sp1/3 site regulating ang-2 expression. The mutation of potential ETS-binding sites resulted in a significant decrease of ang-2 promoter activity. However, the binding of ETS-proteins could not be confirmed by means of EMSA. The results of this thesis revealed new insights of ang-2 regulation and strongly suggest that Sp1/Sp3-dependent activation of an upstream enhancer at -105 to -56 is crucial for the regulation of ang-2 expression in endothelial cells.

Arterien und Venen sind aufgrund ihrer Funktion im Körper morphologisch, funktionell und genetisch unterschiedlich. Schon die großen Blutgefässe auskleidende Endothelzellen zeigen eine arteriovenöse Determinierung. Ausgehend von einer Mikroarray-Analyse der mRNA-Expression arterieller und venöser Endothelzellen der Nabelschnur wurde im Rahmen dieser Arbeit auf Moleküle des Notch-Signalwegs, Dll-4, Notch-4, Hey-1 und Hey-2 fokussiert, die präferenziell bis exklusiv arteriell exprimiert werden. Weitere Gene mit einem arteriellen Expressionsmuster, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert wurden, sind Angiopoietin-2 und CD44s. Trotz der genetisch definierten Unterschiede ließ der Vergleich physiologisch relevanter Funktionen, wie Proliferation oder die Interaktion mit monozytären Zellen keinen vom endothelialen Zelltyp abhängigen Unterschied erkennen. Die im Matrigel ausgebildeten kapillar-ähnlichen Strukturen sind durch homogene, eng beieinander liegende Netzwerke charakterisiert. Studien über den Einfluss von Wachstumsfaktoren und Schubspannung auf die arteriovenöse Expression von Angiopoietin-2 deuten auf eine schubspannungsvermittelte Regulation der Gefäßstabilität und Differenzierung hin. Die in der Zellkultur durchgeführten Manipulationen, wie der Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren oder die Applikation unterschiedlicher Schubspannungen, erreichten in Bezug auf die Expression der untersuchten Markergene keine tiefer greifende Redifferenzierung des jeweiligen endothelialen Phänotyps. Der evolutionär hoch konservierte Notch-Signalweg ist präferenziell arteriell exprimiert, wobei Hey-2 ausschließlich arteriell exprimiert wird. In adulten Endothelzellen erfolgt die Hey-2-Regulation jedoch Notch-unabhängig. Die arteriovenöse Genexpression von Molekülen des Notch-Signalwegs ist unabhängig von der Schubspannung. Unter hypoxischen Bedingungen verringerte sich die Expression von Dll-4, Hey-1 / 2 dramatisch, ohne das jedoch physiologische Beeinträchtigungen zu beobachten waren. Die Expression des venösen COUP-TF II wird in arteriellen Endothelzellen nicht durch den Notch-Signalweg reguliert. Die Auswertung der Daten in der vorgelegten Arbeit lässt vermuten, dass die einmal festgelegte genetische Determinierung adulter Endothelzellen fixiert und äußeren Einflüssen gegenüber stabil und unumkehrbar ist. Dennoch ist eine gewisse Anpassungsfähigkeit der Endothelzellen an bestimmte Situationen möglich, die zwar die Ausprägung von Merkmalen des jeweilig anderen Phänotyps beinhaltet, jedoch nicht eine vollständige Redifferenzierung.

In den letzten Jahrzehnten haben sich die so genannten Biologika auch zur Therapie der Psoriasis etabliert. Zu diesen Medikamenten gehört auch Adalimumab, welches als vollständig humaner Antikörper eines der Schlüsselzytokine in der Pathogenese der Psoriasis, TNFα, neutralisiert. Allerdings führt die Therapie nicht bei allen Patienten zu ausreichendem Wirkerfolg. Da bisher vor Beginn der Therapie nicht zwischen den Patienten, die von der Therapie profitieren, und denen, die keine ausreichende Wirkung erfahren, unterschieden werden kann, werden die letzteren unnötigerweise den Risiken und Nebenwirkungen dieser Therapie ausgesetzt. In dieser Arbeit wurden die Interaktionen kultivierter Endothelzellen und Lymphozyten ex vivo unter dem Einfluss von Adalimumab untersucht. Insbesondere auf mögliche Unterschiede zwischen „Respondern“ und „Non-Respondern“ wurde im Hinblick auf die mögliche Entwicklung eines prädiktiven Tests für das Ansprechen auf Adalimumab ein Schwerpunkt gelegt. Lymphozyten gesunder Probanden und von Psoriasis-Patienten wurden ex vivo hinsichtlich ihrer Interaktion mit kultivierten Endothelzellen (HUVEC), mit und ohne TNFα-Stimulation, untersucht. Hierbei wurden sowohl frisch isolierte als auch kryokonservierte Lymphozyten verwendet, da sich zwischen diesen keine Unterschiede in den funktionellen Flusskammer-Versuchen zeigten. Nach Stimulation der Endothelzellen mit TNFα kam es zu einem deutlichen Anstieg des Rollens und der festen Adhäsion aller Lymphozyten an den Endothelzellen. Allerdings zeigten sich im Ausmaß dieser Interaktion deutliche inter-individuelle Unterschiede. Obwohl diese auch bei Psoriasis-Patienten auftraten, konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen „Respondern“ und „Non-Respondern“ beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Adalimumab auf TNFα-stimulierte Endothelzellen sowie die Interaktion dieser mit Lymphozyten ex vivo zeigte sich eine deutliche Abhängigkeit der Auswirkung vom Zeitpunkt der Behandlung. Erfolgte die Adalimumab-Behandlung vor oder gleichzeitig mit der TNFα-Stimulation der Endothelzellen, kam es zur Aufhebung der TNFα-induzierten Effekte sowohl in der Transkription der Adhäsionsmoleküle (PCR), der Expression dieser (Immunfluoreszenz-Mikroskopie) sowie der dynamischen Interaktionen mit Lymphozyten (Flusskammer). Eine dem TNFα nachfolgende Behandlung blieb ohne Wirkung, sodass davon auszugehen ist, dass sich die bereits induzierten Prozesse nicht mehr rückgängig machen lassen. Hier könnte eine Erklärung für das späte Eintreten der Adalimumab-Wirkung in vivo liegen. Somit konnten in dieser Arbeit vier zentrale Ergebnisse erzielt werden: Erstens, es wurde erstmals gezeigt, dass wichtige funktionelle Eigenschaften humaner Lymphozyten während der Kryokonservierung erhalten bleiben. Zweitens, es wurden erstmals deutliche inter-individuelle Unterschiede im Ausmaß der Interaktion zwischen Lymphozyten ex vivo mit TNFα-stimulierten Endothelzellen nachgewiesen. Adalimumab unterdrückte diese dynamischen Interaktionen, sofern seine Zugabe vor oder gleichzeitig mit der TNF-Exposition erfolgte. Drittens, diese inter-individuellen Unterschiede bestanden gleichermaßen bei gesunden Probanden und Psoriasis-Patienten. Viertens, die funktionellen Unterschiede erlaubten keine Unterscheidung zwischen Psoriasis-Patienten, deren Erkrankung sich durch Adalimumab besserte („Responder“), und denen, deren Erkrankung nicht auf diese Therapie ansprach („Non-Responder“).