Kolorektalcancer (CRC) är en av de vanligaste förekommande cancerformerna i världen och är även den näst dödligaste typen. Vid immunohistokemiska (IHC) analyser använder man sig av markörer som cytokeratin 20 (CK20) och caudal-typ homeobox 2 (CDX2) för diagnostisering av CRC. En ytterligare markör som kan användas är special AT-rikt sekvensbindningsprotein 2 (SATB2). SATB2 är ett DNA-bindande protein som finns mellan 70-97% hos CRC-fall. Ett automatiserat färgningsinstrument, BenchMark Ultra använder IHC, där analysprincipen går ut på att den inmärkta sekundära antikroppen med pepparrotsperoxidas (HRP) binder till den primära antikroppen och dess antigen. I närvaro av 3’3-diaminobenzindine (DAB) bildas en brun färgprodukt tillsammans med väteperoxidaset (H2O2) i HRP. Syftet med arbetet var att framställa ett färgningsprotokoll för SATB2 och se hur detta protokoll fungerar vid riktiga patientfall. Två klossar med två tarmvävnader på varje och en testkontroll snittades, färgades med BenchMark Ultra och monterades för mikroskopi. Samma procedur utfördes med patientfallen. Resultatet visade att preparaten med SATB2-antikroppsspädningen 1:200 fungerade bäst med värmebehandling vid både ultraView respektive OptiView DAB. Proteasbehandling gav ospecifik infärgning. Det valda optimala protokollet med SATB2-antikroppsspädning på 1:200, värmebehandling 36 min i ultraView DAB kördes på patientfallen. Resultatet jämfördes med tidigare genomförda IHC-analyser med positivitet för CK20 och CDX2. SATB2 utföll positiv för båda patientfallen, vilket indikera på att protokollet fungerar. Slutsatsen kom blev att optimala protokollet för SATB2 är spädning på 1:200 och värmebehandling 36 min i ultraView DAB. Med detta kan SATB2 införas som ett tillägg till CK20 och CDX2 vid diagnostisering av CRC i rutinverksamheten. / Colorectal cancer (CRC) is a common and the second most deadly cancer form in the world. With immunohistochemistry (IHC) analyses, biomarkers as cytokeratine 20 (CK20) and caudal type homeobox 2 (CDX2) are used for diagnosing CRC. Another biomarker that can be used is special AT-rich sequence binding protein 2 (SATB2). SATB2 is a DNA-binding protein that is found in 70-90% of CRC cases. BenchMark Ultra is an automatic staining instrument which uses IHC. The principle is that a marked secondary antibody with horse radish peroxidase (HRP) binds to the primary antibody and it’s antigen. Peroxidase (H2O2) in HRP produces a brown color with 3’3-diaminobenzindine (DAB). The aim of this study was to create a protocol for SATB2 and see how it can be used in real cases. Two embedded colon samples and a test control were cut, stained and mounted on slides for microscopy. Same process was carried out with the patient cases. Results showed samples with SATB2-antibody dilution 1:200 worked best with heat treatment in both detection kits. The protease treatment gave non-specific staining. The optimal protocol with SATB2-antibody dilution 1:200 and heat treatment for 36 min with ultraView DAB were tested on patient cases. The results of the patient cases were compared with previous conducted staining with CK20 and CDX2, SATB2 was positive for both cases. In conclusion, the protocol with dilution 1:200 and heat treatment for 36 min with ultraView DAB suited best for SATB2. SATB2 will be introduced as an additional antibody for diagnosis of CRC.

Prostatacancer utgör idag den vanligaste cancerformen bland män i västvärlden och enbart i Sverige diagnostiseras cirka 10 000 män årligen med sjukdomen. Immunförsvaret och mer specifikt CD8+ T-cellerna spelar en viktig roll i förmågan att eliminera tumöromvandlade celler innan en klinisk relevant cancer uppstår. T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and tyrosine-based inhibitory motif domain (TIGIT) är ett inhibitoriskt checkpoint protein som har visat sig ha en dämpande effekt på CD8+ T-celler vilket tumörceller utnyttjar för att öka sin tillväxt. Detta protein har identifierats i hög grad i flera olika cancertyper samt kan användas som prognostisk markör för ett antal olika cancersjukdomar. Ett immunohistokemiskt protokoll optimerades och användes för att detektera TIGIT-uttryck i formalinfixerad och paraffininbäddad prostatatumörer från män med eller utan lymfkörtelmetastas vid diagnostillfället. Resultatet var att av patienter med lymfkörtelmetastas hade 17 (77,3 %) TIGIT-uttryck i sin primärtumör och för män utan lymfkörtelmetastas hade 27 (79,4 %) TIGIT-uttryck. Fisher’s exact test användes för att studera associationen mellan TIGIT-uttryck i primärtumören hos prostatacancerpatienter och lymfkörtelmetastas. Testet visade ingen signifikant skillnad mellan dessa grupper, p = 1,00. Vår slutsats är att TIGIT inte kan användas som prognostisk markör för prostatacancermetastasering, men ytterligare studier krävs för att definitivt kunna dra några slutsatser. / Prostate cancer constitutes the most common form of cancer among men in the western world today and, in Sweden alone, about 10,000 men are diagnosed with the disease annually. The immune system and specifically CD8+ T cells play an important role in the ability to eliminate tumour cells before a clinically significant cancer occurs. T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and tyrosine-based inhibitory motif domain (TIGIT) is an inhibitory checkpoint protein that has been shown to have a suppressing effect on CD8+ T cells in which tumour cells exploit to increase in size. This protein has been identified in several types of cancer and can be used as a prognostic biomarker in a range of different cancer diseases.  A protocol for immunohistochemistry was optimized and used for detecting TIGIT expression in formalin-fixed and paraffin-embedded tissues of prostate tumour from men either with lymph node metastases or not by the time of diagnosis.  The results from patients with lymph node metastases was that 17 (77,3 %) had TIGIT expression in their primary tumour while for men without lymph node metastases 27 (79,4 %) had TIGIT expression. Fisher’s exact test was used to study the association between TIGIT expression in the primary tumour of prostate cancer patients and lymph node metastases. The test showed no significant difference between these groups, p = 1,00. Our conclusion is that TIGIT can not be used as a prognostic biomarker for prostate cancer metastases, but further study is needed to definitely draw any conclusions.

Wilms tumör (WT) är en malign snabbväxande tumör och den vanligaste solida buktumören hos barn under sex år. En kombination av operation, cytostatika och strålbehandling har lett till att 90 % av barnen idag blir helt botade. Enligt ett enhetligt europeiskt morfologiskt klassifikationssystem och behandlingsprotokoll behandlas alla barnpatienter med WT med cytostatika pre-operativt innan nefrektomi. Den histologiska tumörtypen, klassad efter operation, är helt avgörande för vidarebehandling av WT. Tumören består av tre celltyper, stromala epiteliala och blastemala, där de blastemala har en stor likhet med mesenkymala celler i njuren hos embryot. Tumörer med mer än 2/3 blastem klassificeras som högrisktumörer som följs upp med ytterligare, extra intensiv kemoterapi. I dagsläget görs en histologisk bedömning av tumörens riskgrupp endast på hematoxylin-eosin färgning. Proteinet SIX1 har nyligen rapporterats fungera som lämplig biomarkör för blastem. Med hjälp av immunohistokemi undersöktes i detta arbete om SIX1-färgning på blastem kan tillämpas kliniskt för säkrare riskbedömning av WT. Efter omfattande utvecklingsarbete med testning av olika varianter av förbehandling och detektionsmetod kunde ett fullgott protokoll för kliniskt bruk utformas. Detta kommer nu att implementeras inom klinisk patologi i Skåne. / Wilms tumor (WT) is a malign fast growing tumor and the most common solid abdominal tumor amongst children under the age of 6. A combination of surgery, chemotherapy and radiotherapy has led to a 90 % cured rate among children affected by WT. According to a uniform European morphological classification system and treatment protocol, all WTs receive pre-operative chemotherapy prior to nephrectomy. Histological tumor type, determined after surgery, is crucial for further treatment of WT. The tumor consists of three cell types: stromal elements, epithelial elements and blastema, of which the blastema has a great similarity to embryonic mesenchymal cells. Tumors that consist of more than 2/3 blastema are classified as high risk tumors, recieving additional intensive chemotherapy. Today, an assesment of WT histology is performed on hematoxylin-eosin stained specimens only. Recently, the SIX1 protein has been reported to function as a suitable biomarker for blastema. Using immunohistochemistry, it was investigated if SIX1 detection could be applied clinically for classification of WT. After several modifications of pre-treatment and primary antibody detection methodology, a clinically robust immunohistochemical staining protocol was finally developed. This will now be implemented in the clinic.

Immunohistokemi (IHK) är en metod som används för att undersöka närvaron av specifika biomarkörer i vävnad. Metoden utnyttjar antikroppars affinitet till antigen och dess närvaro visualiseras. Caldesmon är ett protein associerat med cytoskelettet som förekommer i glatta muskelceller och i icke-muskelceller. Det används inom IHK som en glatt muskelmarkör men även som en markör för myoepiteliet. Syftet med studien var att utveckla ett nytt protokoll för caldesmon och att jämföra den med SMMS-1, även den en markör för glatt muskulatur och myoepiteliet. Jämförelsen utfördes på fibroadenom vävnad, en bröstcancerform som utvecklats ur epitelialvävnad och stroma, då den innehåller mycket myoepitelial celler. För att effektivisera processen användes tissue microarray tekniken, där vävnad från flera olika preparat (klotsar) stansades ut och sammanfördes till en ny klots. Instrumentet Ventana Benchmark Ultra användes för att utveckla ett nytt protokoll för caldesmon. Det nya protokollet användes sedan vid jämförelsen med SMMS-1. Resultatet visade att SMMS-1 gav en tydligare infärgning av det myoepiteliala lagret då det enbart färgade in det, medan caldesmon även färgade in stroma. Då fibroadenom vävnad innehöll mycket stroma var det svårare att urskilja det myoepiteliala lagret från dess omgivning med caldesmon infärgningen. / Immunohistochemistry (IHC), is a method used for examining the presence of specific biomarkers in tissue. It uses antibodies affinity for antigens and their presence can then be visualized. Caldesmon is a protein that is associated with the cytoskeleton in smooth muscle and non-smooth muscle cells. It is used within IHC as a marker for smooth muscle but also as a marker for the myoepithelium. The intent of this study was to develop a new protocol for caldesmon and to compare it with SMMS-1, also a marker for smooth muscle and the myoepithelium. The comparison was performed on tissue from fibroadenoma, a type of breast cancer that evolved from epithelial tissue and stroma, due to its high content of myoepithelial cells. For optimal effectiveness, the tissue microarray technique was used, where tissue from several blocks are extracted and brought together into a single new block. A Ventana Benchmark Ultra was used to develop a new protocol for the new antibody, caldesmon. The new protocol was used in the comparison with SMMS-1 on fibroadenoma tissue. The results were that SMMS-1 had a clearer and sharper staining of the myoepithelial layer, due to the fact that it only stained the layer. While caldesmon also stained the stroma in the tissue. Because fibroadenom tissue contained so much stroma the staining done with caldesmon made it harder to separate the myoepithelial layer from its surroundings.

Crohns sjukdom (CS) är en svårdiagnosticerad tarmsjukdom som kan medföra risk för näringsbrist, smärtsamma åkommor och allmänt nedsatt livskvalité för patienten. CS kan visa extraintestinala manifestationer till exempel i munhålan som är lättillgänglig för biopsitagning vid behov samt visuell undersökning, som rutinmässigt utförs av tandvårdspersonal. Studien avser att besvara hur Crohns sjukdom yttras histopatologiskt i orala biopsier och dess eventuella betydelse för fastställning av diagnos. Syftet är att med hjälp av monoklonala antikroppar mot CD68 granska den histopatologiska inflammationsbilden av Crohns sjukdom i munhålan hos 17 patienter som anknutits till den patologanatomiska diagnosen epiteloidcellig granulomatos (ECG). Detta i försök att förtydliga den specifika inflammationsbilden och för att indikera orala manifestationers och biopsiers möjliga användning för att underlätta diagnostiken av Crohns sjukdom.Resultatet visade att den för CS representativa inflammationsbilden förekommer i munhålan, vilken förtydligades av den immunohistokemiska infärgningstekniken. Hur sjukdomen yttrar sig makroskopiskt och framförallt histopatologiskt samt betydelsen av och kunskapen om dessa symtom har belysts.Diagnos av CS kan inte enbart ställas utifrån den orala inflammationsbilden. Däremot skulle tandläkares och oralpatologers kunskap om dess orala manifestationer och histopatologiska sjukdomsbild kunna bistå läkare för fastställning av diagnos. Detta skulle därmed kunna medföra tidigare insatt behandling och möjlighet till lindrat lidande för patienten.

Vid cancerdiagnostisering av Lynch syndrom används immunohistokemisk färgning för undersökning av eventuell defekt hos mismatch repair-generna MLH1, MSH2, MSH6 och PMS2. Färgningen använder sig av antikroppar som undersöker om cellkärnor i vävnad har intakta eller förlorade proteinuttryck hos respektive gen. Syftet med studien var att utföra en antikroppsvalidering för att granska om de nuvarande Dako Link Ready-to-Use-antikropparna (Link RTU) och koncentrerade antikroppen Dako PMS2 1:40 kunde bytas ut till Dako Omnis Ready-to-Use-antikroppar (Omnis RTU). Omnis RTU-antikropparna är optimerade för det automatiserade analysinstrumentet Dako Omnis som används vid patologavdelning på Universitetssjukhuset Örebro. Tolv vävnader med colorektalcancer och två externa positiva kontroller färgades med samtliga antikroppar för respektive gen och en jämförelse mellan Link RTU samt Dako PMS2 1:40 gjordes mot Omnis RTU-antikropparna. De nya färgningarna med Omnis RTU bedömdes som sämre, likvärdig eller bättre infärgad. Om antikroppen färgade rätt målceller och med stark färgintensitet bedömdes den och motsvarande protokoll som godkänd. Resultatet visade att Omnis RTU för MLH1 gav en förbättrad färgning. Omnis RTU för MSH2 gav i majoritet en förbättrad färgning med något mer bakgrundsfärg än önskvärt. Omnis RTU för MSH6 gav en svagare infärgning i majoriteten av fallen och Omnis RTU för PMS2 gav i majoritet en förbättrad färgning, men med för mycket bakgrundsfärg. Slutsatsen var att Omnis RTU för MSH6 och PMS2 kräver vidare optimering av protokoll innan de används i laboratoriets rutinfärgning. Protokollet för Omnis RTU för MSH2 kan behöva en mindre justering för minskad bakgrundsfärg och Omnis RTU för MLH1 fungerar väl med det nuvarande protokollet. / Immunohistochemistry staining is used in diagnostics of Lynch Syndrome to investigate possible defects in the mismatch repair genes MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2. Antibodies is used to examine whether cell nuclei in cancer tissue have intact or loss of protein expression in said genes. The aim of the study was to perform an antibody validation to examine if the current Dako Link Ready-to-Use antibodies (Link RTU) and the concentrated PMS2 antibody can be replaced with Dako Omnis Ready-to-Use antibodies (Omnis RTU) that are optimized for the analytical instrument Dako Omnis, which is used in Universitetssjukhuset Örebro. Twelve tissues with colorectal cancer and two external positive controls was stained with all antibodies for each gene. A comparison was done between the old antibodies and Omnis RTU, where Omnis RTU was judged to be worse, equivalent or better. The antibody and used protocol were approved of laboratory use if it stained the target cells with a strong intensity. The results showed that Omnis RTU MLH1 had an improved staining. Omnis RTU MSH2 had in majority an improved staining, but with slightly more background staining than preferred. Omnis RTU MSH6 had in majority a weak staining while Omnis RTU PMS2 had an improved staining but with too much background staining. The conclusion was that the protocols for Omnis RTU MSH6 and PMS2 needed further optimization before laboratory use. The protocol for Omnis RTU MSH2 may need a minor adjustment to reduce background staining, while Omnis RTU MLH1 works well with the current protocol.

Urinary bladder cancer is a heterogeneous disease appearing in different forms, e.g. non-muscle invasive and muscle invasive. For all variants, the expression of proteins is interesting to analyze for diagnostic, predictive, prognostic and drug targeting purposes, since it reflects the altered gene expression causing the cancer. Since urothelial cells of the bladder are in direct contact with urine it is likely that this body fluid contains cancer-related proteins. In Paper I, unbiased analysis of proteins in urine from urinary bladder cancer patients and controls, using label-free quantification by mass spectrometry, was applied and four interesting proteins APOE, FGB, LRG and SERPINA1 were selected and further analyzed with western and dot blot. In Paper II, two more proteins, POLR1E and TOP2A, were validated as relevant proteins in bladder cancer urine. In Paper III and IV, the proteins GAL1 and STMN1 were investigated for their prognostic and therapeutic target potential in bladder cancer. In Paper II, III and IV, the expression of seven of the proteins were analyzed on tissue microarrays representing tumour tissue from 360 patients with different tumour stages. For the proteins identified by the urine screening approach, their protein expressions were confirmed in bladder cancer tissue. The expression level in tissue of five of the proteins, APOE, FGB, POLR1E (Paper II), GAL1 (Paper III) and STMN1 (Paper IV), increased with tumour stage, showing diagnostic relevance and three of the proteins, SERPINA1 (Paper II), STMN1 (Paper IV) and GAL1 (Paper III) had prognostic potential in urinary bladder cancer. In addition, GAL1 and STMN1 were demonstrated to be highly expressed in metastatic disease and inhibition of STMN1 reduced cell growth (Paper III and IV), indicating that these proteins are promising drug targets in urinary bladder cancer. In conclusion, the approach of this thesis has generated several candidate protein biomarkers in urine and tissue, validated with independent methods, which have the potential to improve the care for bladder cancer patients.