Diss. (sammanfattning) Uppsala : Uppsala universitet, 2006. / Härtill 6 uppsatser.

A proteomic approach was applied to examine the protein composition of low-density lipoprotein (LDL) and high-density lipoprotein (HDL) in humans. LDL and HDL were isolated by density gradient ultracentrifugation, and proteins were separated with twodimensional gel electrophoresis (2-DE) and identified with peptide mass fingerprinting, using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, and with amino acid sequencing using electrospray ionization tandem mass spectrometry. To improve the identification of low abundant proteins in silver stained 2-DE gels, 2,5-dihydroxybenzoic acid was used instead of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid as matrix in the peptide mass fingerprinting procedure; this was demonstrated to give more matching peptide peaks, higher sequence coverage, and higher signal to noise ratio. Altogether 18 different proteins were demonstrated in LDL and/or HDL: three of these (calgranulin A, lysozyme C and transthyretin) have not been identified in LDL before. Apo C-II, apo C-III, apo E, apo A-I, apo A-IV, apo J, apo M, serum amyloid A-IV and α1-antitrypsin were found in both LDL and HDL, while apo B-100 (clone), calgranulin A, lysozyme C and transthyretin were found only in LDL, and apo A-II, apo C-I, and serum amyloid A only in HDL. Salivary α-amylase wass identified only in HDL2, and apo L and glycosylated apo A-II only in HDL3. Many of the proteins occurred in a number of isoforms: in all, 47 different isoform identities were demonstrated. A 2-DE mobility shift assay and deglycosylation experiments were used to demonstrate, for the first time, that apo M in LDL and HDL occurs in five isoforms; three that are both N-glycosylated and sialylated, one that is N-glycosylated but not sialylated and one that is neither N-glycosylated nor sialylated. LDL from obese subjects was found to contain more apo J, apo C-II, apo M, α1-antitrypsin and serum amyloid A-IV than LDL from controls,, and also more of an acidic isoform (pI/Mr; 5.2 / 23 100) of apo A-I. In addition, the new LDLassociated protein transthyretin, was found to be significantly more abundant in LDL from obese subjects. On the other hand, the amounts of apo A-IV and the major isoform of apo A-I (pI/Mr; 5.3 / 23 100) were significantly less. Altogether, these findings (i) illustrate the power of 2-DE and mass spectrometry for detailed mapping of the proteins and their isoforms in human lipoproteins; (ii) demonstrate the presence of a number of new proteins in LDL (calgranulin A, lysozyme C and transthyretin); (iii) give precise biochemical clues to the polymorphism of apo M in LDL and HDL, and; (iv) indicate that obesity is associated with significant changes in the protein profile of LDL. It is concluded that new information on lipoproteins can easily be obtained through a proteomic approach, thus facilitating the development of a new proteomic field: lipoproteomics. Much further investigation in this field is warranted, particularly because newly discovered LDL and HDL proteins may play hitherto unknown role(s) in inflammatory reactions of the arterial wall and evolve as useful biomarkers in cardiovascular disease.

Das Glioblastom ist mit 70 % aller Gliome der häufigste humane Hirntumor mit sehr ungünstiger Prognose. Es konnte gezeigt werden, dass das natürlich vorkommende Dipeptid Carnosin (β-Alanyl-L-histidin) die Proliferation von Glioblastomzellen inhibiert. Diese Wirkung des Carnosins konnte ebenfalls in vivo nachgewiesen werden. Da Carnosin auch einen Einfluss auf den ATP-Haushalt der Glioblastomzellen besitzt, war das Ziel dieser Arbeit einen Wirkungsort von Carnosin zu identifizieren, womit die ATP mindernden und proliferationshemmenden Eigenschaften erklärt werden können. Es wurde untersucht, ob Carnosin den Energiemetabolismus der Glioblastome beeinflusst. Dabei konnte mithilfe zellbiochemischer Methoden gezeigt werden, dass die untersuchten Zelllinien nicht von der Energieversorgung durch die mitochondriale oxidative Phosphorylierung abhängen, da sich weder Hemmung (KCN) noch Entkopplung (DNP) der Elektronentransportkette auf den zellulären ATP-Gehalt auswirkten. Carnosin hingegen verringerte den ATP-Spiegel dieser Zellen. Die Hemmung der Glykolyse durch Oxamat (LDH-Hemmung), bewirkte einen starken Abfall des intrazellulären ATP-Spiegels, worauf Carnosin keinen zusätzlichen Effekt mehr besaß. Carnosin konnte eine Wirkung auf die glykolytische ATP-Synthese zugesprochen werden. Da ein direkter, molekularer Wirkungsort auf diesem Weg nicht identifiziert werden konnte, wurde parallel untersucht, ob sich über Proteomanalysen der Glioblastomzelllinie T98G ein Wirkungsort, bzw. -mechanismus bestimmen lässt. Anhand der Methode der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-GE) konnten 31 signifikant differenziell exprimierte Proteine detektiert werden, von denen 6 Proteine (VBP-1, OLA-1, TALDO 1, UROD, BAG-2, GRPEL1) über MALDI-TOF-Analysen identifiziert wurden. In Western-Blot-Analysen konnte ein Protein (VBP-1), neben T98G, auch in primären Glioblastomzelllinien als differenziell exprimiert nachgewiesen werden. Anhand der zellbiologischen und proteinbiochemischen Untersuchungen konnte einerseits eine Verbindung des Carnosins zum HIF1α-Signalweg und andererseits zur generellen posttranslationalen Peptidprozessierung hergestellt werden. Der direkte Nachweis eines Einflusses von Carnosin auf HIF1α wurde aber bisher nicht erbracht.

Mass spectrometry is the primary technology of proteomics. For the analysis of complex proteomes, protein identities and quantities are inferred from their peptides that are generated by cleaving all proteins with the endopeptidase trypsin. But there is one major disadvantage that is due to biophysical differences, different peptides cause different intensities. Miscellaneous approaches have been developed to circumvent this problem based on the chemical or metabolic introduction of heavy stable isotopes. This enables to monitor protein abundance differences of two or more samples on the same tryptic peptides that differ in mass only. Absolute quantification can be achieved similar by spiking-in synthetic isotopical labeled counterparts of a sample’s tryptic peptides. However, labeling technics suffer from high prices, introduced biases, need for extensive manual control, laborious implementation and implementation restrictions. Therefore, a multiplicity of label-free approaches have been developed that profit from instrumental improvements targeting reliability of identifications and reproducibility of quantitative values. No extensive systematic comparison of label-free quantitative parameters has been published so far presumably because of the laborious implementation. An analysis of primary label-free parameters and associated normalization methods is presented here that compares dynamic and linear ranges and accuracies in the estimation of protein amounts. This facilitated the establishment of label-free procedures addressing three fundamental questions in proteomics: what is a sample’s composition, are proteins that share a specific property enriched and what are the differences between two (or more) samples. A new mathematic model is presented that defines and elucidates enrichment. The procedures were applied first to analyze and compare stem cell plasma membrane proteomes. This is an ambitious model for proteomics because of only small amounts of arduous to analyze, partial hydrophobic proteins in a complex proteomic and chemical background. It is of scientific relevance, as membrane proteins are the cell’s communication interface that enable cell type specific processes and hence can be used to define, isolate and quantify those. The success of cell surface proteome enrichment, the quantitative composition of the proteome and the proteomic difference between stem cells isolated from the dental pulp and cultivated in different media is shown. Secondly, the procedures were applied to the analysis of transient protein networks that assemble onto proteo-liposomes in a newly designed recruitment assay that fully recapitulates membrane sorting as seen in vivo. All transmembrane proteins need to be trafficked to other organelles’ membranes by vesicular trafficking. Sorting signals within the cytosolic regions of the protein cargos trigger the formation of trafficking complexes around those. The transient membrane complexes additionally recognize organelle or organelle-domain specific membrane lipids, such as phosphatidylinositol phosphates. Different trafficking ways are characterized by different trafficking complexes. The elucidation of trafficking complexes that form around a transmembrane protein of interest discloses its trafficking routes and involved signaling processes. The synthetic proteo-liposomes were prepared from chemically defined lipids and heterologous expressed cytosolic domains of type I or type II membrane receptors. The proteomic analyses of such samples are challenging because of huge proteomic backgrounds of proteins binding to the liposomes irrespective of the receptor and relatively small amounts and numbers of receptor-specific binders. Though the basic idea is to elucidate sorting machineries and study membrane trafficking processes, such experiments are untargeted and miscellaneous discoveries were achieved. We elucidated that the apical determinant crumbs 2 is a cargo of the retromer complex. This revealed a fameless level of control for the establishment of cell polarity. We found retromer along with the adapter complexes AP 4 and AP 5 trafficking the beta amyloid precursor protein APP. This confirmed recent publications and yielded new insights. Moreover, many more proteins and complexes appeared to associate with the cytosolic part of APP (AICD) in a membrane context-dependent or -independent manner. Among those, some were so far unknown to interact with AICD, like mTORC1 and the PIKFyve complex.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : universitet, 2007. / Härtill 6 uppsatser.

Mass spectrometry is the primary technology of proteomics. For the analysis of complex proteomes, protein identities and quantities are inferred from their peptides that are generated by cleaving all proteins with the endopeptidase trypsin. But there is one major disadvantage that is due to biophysical differences, different peptides cause different intensities. Miscellaneous approaches have been developed to circumvent this problem based on the chemical or metabolic introduction of heavy stable isotopes. This enables to monitor protein abundance differences of two or more samples on the same tryptic peptides that differ in mass only. Absolute quantification can be achieved similar by spiking-in synthetic isotopical labeled counterparts of a sample’s tryptic peptides. However, labeling technics suffer from high prices, introduced biases, need for extensive manual control, laborious implementation and implementation restrictions. Therefore, a multiplicity of label-free approaches have been developed that profit from instrumental improvements targeting reliability of identifications and reproducibility of quantitative values. No extensive systematic comparison of label-free quantitative parameters has been published so far presumably because of the laborious implementation. An analysis of primary label-free parameters and associated normalization methods is presented here that compares dynamic and linear ranges and accuracies in the estimation of protein amounts. This facilitated the establishment of label-free procedures addressing three fundamental questions in proteomics: what is a sample’s composition, are proteins that share a specific property enriched and what are the differences between two (or more) samples. A new mathematic model is presented that defines and elucidates enrichment. The procedures were applied first to analyze and compare stem cell plasma membrane proteomes. This is an ambitious model for proteomics because of only small amounts of arduous to analyze, partial hydrophobic proteins in a complex proteomic and chemical background. It is of scientific relevance, as membrane proteins are the cell’s communication interface that enable cell type specific processes and hence can be used to define, isolate and quantify those. The success of cell surface proteome enrichment, the quantitative composition of the proteome and the proteomic difference between stem cells isolated from the dental pulp and cultivated in different media is shown. Secondly, the procedures were applied to the analysis of transient protein networks that assemble onto proteo-liposomes in a newly designed recruitment assay that fully recapitulates membrane sorting as seen in vivo. All transmembrane proteins need to be trafficked to other organelles’ membranes by vesicular trafficking. Sorting signals within the cytosolic regions of the protein cargos trigger the formation of trafficking complexes around those. The transient membrane complexes additionally recognize organelle or organelle-domain specific membrane lipids, such as phosphatidylinositol phosphates. Different trafficking ways are characterized by different trafficking complexes. The elucidation of trafficking complexes that form around a transmembrane protein of interest discloses its trafficking routes and involved signaling processes. The synthetic proteo-liposomes were prepared from chemically defined lipids and heterologous expressed cytosolic domains of type I or type II membrane receptors. The proteomic analyses of such samples are challenging because of huge proteomic backgrounds of proteins binding to the liposomes irrespective of the receptor and relatively small amounts and numbers of receptor-specific binders. Though the basic idea is to elucidate sorting machineries and study membrane trafficking processes, such experiments are untargeted and miscellaneous discoveries were achieved. We elucidated that the apical determinant crumbs 2 is a cargo of the retromer complex. This revealed a fameless level of control for the establishment of cell polarity. We found retromer along with the adapter complexes AP 4 and AP 5 trafficking the beta amyloid precursor protein APP. This confirmed recent publications and yielded new insights. Moreover, many more proteins and complexes appeared to associate with the cytosolic part of APP (AICD) in a membrane context-dependent or -independent manner. Among those, some were so far unknown to interact with AICD, like mTORC1 and the PIKFyve complex.

Das Glioblastom ist eine hochmaligne Tumorerkrankung des zentralen Nervensystems und geht trotz intensiver Forschungsbemühungen mit einer eingeschränkten Prognose und einer Überlebenszeit im Rahmen von einigen Monaten nach Diagnosestellung einher. Cerebrale Metastasen maligner Tumoren treten in Abhängigkeit vom Primärtumor auf, und beschränken nach Erreichen des ZNS die Überlebenszeit ebenfalls auf wenige Monate. Etwa 10% der Glioblastome weisen zystische Veränderungen auf, cerebrale Metastasen maligner Tumoren präsentieren sich ebenfalls nicht selten mit einer zystischen Konfiguration. Streng histologisch gesehen handelt es sich hierbei um Pseudozysten, in denen sich eine zellarme Flüssigkeit befindet, die tumorzellassoziierte Proteine in einer geringen Konzentration enthält. Aufgrund der engen Beziehung der Zysten zu den Tumorzellen gibt die Proteinanalyse der Zystenflüssigkeit über Tumorgenese und Metabolismus Aufschluss. Bereits in einer vorangegangenen Promotionsarbeit der neuroonkologischen Arbeitsgruppe war es gelungen, Proben zystischer Glioblastome und Metastasen im Vergleich zu Liquorproben tumorfreier Patienten mittels SELDI (surface enhanced laser desorption / ionisation) TOF (time of flight) MS (Massenspektrometrie) zu vermessen. Hierbei wurden Alleinstellungsmerkmale im Sinne von isoliert auftretenden Protein-Massenpeaks sowohl in den neoplastischen Proben, als auch in den Liquorproben detektiert. Der theoretische Teil der vorliegenden Arbeit widmet sich der Charakterisierung möglicher Tumorsuppressorproteine, mittels einer Evidenzanalyse / Literaturrecherche unter Verwendung der SELDI-TOF-MS Daten. Da mittlerweile mehrere Bestandteile der SELDI-TOF Hardware kommerziell nicht mehr verfügbar sind, bestand die Notwendigkeit, ein Alternativverfahren zur Proteinbestimmung von Zystenflüssigkeiten zu etablieren. Hierzu wurde in dieser Dissertation die Methode der MALDI (matrix assisted laser desorption / ionisation) TOF-MS zur Messung eines Sets neuer Proben angewendet. Die MALDI-TOF-MS war bereits in mehreren Publikationen zur Massenspektroskopie von Liquorproben beschrieben worden, wohingegen zur Untersuchung cerebraler Zystenflüssigkeiten bisher keine Berichte zu finden sind. Dementsprechend wurde im praktischen Teil ein Aufbereitungs- und Untersuchungsprotokoll eigenständig etabliert. Hiermit konnten Massenspektren der Proben abgeleitet werden, welche in den drei Diagnosegruppen (GBM, Metastasen, Liquorproben) untereinander verglichen wurden. Ergebnisse: Anhand von 20 Massenpeaks aus der SELDI-TOF Untersuchung wurden mittels Datenbanksuche in Expasy Tagident (UniProt) initial 792 Kandidatenproteine ermittelt, welche in Vergleichsliquorproben gesunder Probanden nachweisbar, in Glioblastomzysten aber absent waren, und somit eine tumorsuppressive Aktivität besitzen können. Mittels Evidenzanalyse und erweiterter Literaturrecherche wurde ein Bewertungsalgorithmus erstellt, und es konnte die Anzahl auf 54 Kandidaten reduziert werden. Unter diesen befinden sich bereits bekannte Tumorsuppressoren wie Tumor-Nekrose-Faktoren und Kinase-Inhibitoren, aber auch beispielsweise Ciliary neurotrophic factor und Inhibitor of growth protein als mögliche Tumorsuppressoren, deren Bezug zu Glioblastomen in aktuellen Veröffentlichungen diskutiert wird. Im experimentellen Teil wurde festgestellt, dass die massenspektrometrische MALDI-TOF Messung von nativer Hirntumorzystenflüssigkeit oder nativem Liquor keine verlässlichen Spektren liefert, sodass ein standardisiertes Aufarbeitungsprotokoll notwendig wurde. Nach Einsatz verschiedener Aufreinigungsverfahren, Verdünnungsreihen und Matrices erwiesen sich die Aufreinigung per magnetic beads mit schwachem Kationen-Austausch (WCX) und die Verwendung von 4mg/ml HCCA-Matrix als reliabel. Zusätzlich erfolgte eine 1:5 Vorverdünnung der neoplastischen Proben mit TRIS Puffer pH 6,8, während Liquorproben unverdünnt blieben. Insgesamt wurden 62 Proben untersucht, 25 aus Glioblastomzysten, 15 aus zystischen Hirnmetastasen und 22 Liquorproben als Kontrollgruppe. Im Schnitt konnten 20 Peaks pro Probe abgebildet werden; die jeweils 10 intensitätsstärksten hiervon wurden zur statistischen Aufarbeitung innerhalb der jeweiligen Diagnosegruppe herangezogen. Hierbei zeigten sich signifikante Unterschiede des Auftretens bestimmter Proteinbanden im Vergleich von Tumorproben zu Liquor, zum Teil auch zwischen Metastasen und Glioblastomen. Besonders hervorzuheben sind: - Der in Glioblastomproben signifikant häufig auftretende Peak bei 6433 Dalton entspricht dem Protein LuzP6 oder einer Splice-Variante des Apo-C1. o Für LuzP6 werden in der Literatur Assoziationen mit Neoplasien wie myeloproliferative Erkrankungen und Prostatakarzinom beschrieben. Das Gen für LuzP6 befindet sich auf Chromosom 7q33 und sein Translationsprodukt ist als Self-Tumor-Antigen beschrieben worden. o Apo-C1 wird als Mediator des Lipidstoffwechsels in der Leber synthetisiert und kann immunhistochemisch in Liquor und Gehirngewebe nachgewiesen werden. Eine weitere Splicevariante besitzt eine Größe von 6632 Dalton, dieser Peak liegt ebenfalls signifikant häufiger in Glioblastomen als in Liquor vor. - Der Peak 4303 Dalton wird in Metastasen signifikant häufig nachgewiesen. Als Kandidat findet sich unter anderen der angiogenetische Faktor Adrenomedullin 2, dessen protoonkogene Funktion in mehreren Publikationen beschrieben wird. - In über 95% der Vergleichsliquorproben und in unter 10% der neoplastischen Diagnosegruppen findet sich die Bande 3513 Dalton. In der UniProt Datenbank gibt es hierfür jedoch keine Entsprechung. Auch für ein möglicherweise doppelt geladenes Protein mit 7026 Dalton sind bis dato keine bekannt tumorsuppressiv wirkenden Kandidaten hinterlegt. Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten besteht somit in der Identifizierung des zugrundeliegenden Proteins. - Als ubiquitäre Bande in allen drei Diagnosegruppen lässt sich 11725 Dalton beispielsweise dem beta-2-Mikroglobulin zuordnen, das auf allen Körperzellen vorhanden ist und die Antigenpräsentation an das Immunsystem vermittelt. Aufgrund einer Vielzahl weiterer möglicher Kandidatenproteine dieser Größe steht auch hier die eindeutige Identifizierung aus. Antworten auf die Problemstellung 1. Sowohl MALDI, als auch SELDI TOF MS sind geeignet um Flüssigkeiten aus Glioblastomzysten massenspektrometrisch zu analysieren. Um eine verlässliche Messung per MALDI-TOF zu erreichen, müssen die Proben zuvor eine Aufreinigung erfahren. Die Ergebnisse innerhalb der Diagnosegruppen sind reproduzierbar; die MALDI-TOF MS bildet insbesondere niedrige m/z (1.500Da - 20.000Da) ab, und verschiebt somit im Vergleich zur SELDI-TOF MS (4.000Da - 145.000Da) den Messbereich in Richtung kleinerer Molekulargewichte. 2. Unter Anwendung des Aufreinigungsprotokolls gelingt die Abbildung aussagekräftiger Spektren auch bei Proben zystischer Hirnmetastasen. 3. Für lediglich in den Liquor-Vergleichsproben nachweisbare Massenpeaks lassen sich in den verfügbaren Datenbanken sowohl Proteine finden, welche nachgewiesenermaßen tumorsuppressive Aktivität besitzen, als auch solche, bei denen diese noch diskutiert wird. Eine eindeutige Zuordnung eines Peaks zu einem Protein ist mittels MALDI-TOF MS nicht möglich. Hierzu müssen weitere proteomische Methoden wie Proteinsequenzierung, Immunhistochemie oder mRNA-Analysen eingesetzt werden. 4. Aufgrund der Heterogenität der Messergebnisse und der geringen Fallzahl untersuchter Proben lässt sich eine Massenpeak-Tumorsignatur nicht erstellen. Dies betrifft die Glioblastomsubtypisierung und die Primärtumorbestimmung bei Metastasen, aber auch die Unterscheidung von Tumor- und Liquorprobe. Aus heutiger Sicht steht die eindeutige Identifizierung der zu den Peaks korrespondierenden Proteine mittels supplementärer proteomischer, histologischer und molekularbiologischer Verfahren an. Somit kann, ausgehend von dem hier vorgestellten „discovery oriented approach“ als langfristiges Ziel die Beschreibung von Tumormetabolismus und Proteinregulation verbunden mit der Etablierung von Biomarkern angestrebt werden, um neue therapeutische Ansätze zu ermöglichen.:Inhaltsverzeichnis 2 Tabellenverzeichnis 4 Abbildungsverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis 6 1. Einleitung 8 1.1 Hirneigene Tumore 8 1.1.1 Diagnostik 10 1.1.2 Operatives Vorgehen 11 1.1.3 Postoperative Weiterbehandlung – Adjuvante Therapie 12 1.2 Metastasen 14 1.3 Zystische Tumore 16 1.4 Proteomik 20 1.4.1 Proteomanalyse 21 1.4.2 Protein-Analyseverfahren 21 1.4.3 MALDI TOF 23 1.4.4 SELDI TOF 25 2. Problemstellung 26 3. Material und Methoden 27 3.1 Materialliste 27 3.2 Internetbasierte Recherche möglicher Tumorsuppressorgene 27 3.2.1 Evidenzlevel (gemäß der Internet Datenbank UniProt) 30 3.2.2 Proteincharakteristika 30 3.2.3 Schlagwortbezogene Literatursuche 31 3.3 Massenspektrometrische Untersuchungen 31 3.3.1 Probengewinnung und Aufbewahrung 31 3.3.2 Verwendung und Aufreinigung der Proben 32 3.3.3 Messverfahren 36 4. Ergebnisse 41 4.1 Recherche möglicher Tumorsuppressoren 41 4.2 Probenaufbereitung 48 4.2.1 Ergebnisse der verschiedenen Adaptationsversuche Probe / Matrix ohne weitere Aufreinigung 48 4.2.2 Kit-basierte Aufreinigung 50 4.3 Messergebnisse 52 4.3.1 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks bei Glioblastomen 54 4.3.2 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks bei Metastasen 55 4.3.3 Häufigkeit der intensitätsstärksten Peaks der Liquorproben 56 4.3.4 Automatisierte Kontrolle 56 4.3.5 Entitätenvergleich 57 4.4 statistische Aufarbeitung 60 4.4.1 Glioblastom 60 4.4.2 Metastasen 60 4.4.3 Liquor 60 4.5 Nachbetrachtung ausgewählter Peaks (Top 3 jeder Entität) 61 4.5.1 Glioblastom 61 4.5.2 Metastasen 61 4.5.3 Vergleichsproben 62 4.5.4 Exemplarische Vorstellung möglicher Proteinkandidaten 62 5. Diskussion 66 5.1 Diskussion möglicher Tumorsuppressoren 66 5.2 Diskussion der Probenaufbereitung und des Messverfahrens 68 5.3 Diskussion der Messergebnisse 72 5.4 Antworten auf die Problemstellung 76 6. Zusammenfassung 79 Literaturverzeichnis 84 Anlagen 94 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 101 Lebenslauf 102 Danksagung 104

Das Glioblastom ist mit 70 % aller Gliome der häufigste humane Hirntumor mit sehr ungünstiger Prognose. Es konnte gezeigt werden, dass das natürlich vorkommende Dipeptid Carnosin (β-Alanyl-L-histidin) die Proliferation von Glioblastomzellen inhibiert. Diese Wirkung des Carnosins konnte ebenfalls in vivo nachgewiesen werden. Da Carnosin auch einen Einfluss auf den ATP-Haushalt der Glioblastomzellen besitzt, war das Ziel dieser Arbeit einen Wirkungsort von Carnosin zu identifizieren, womit die ATP mindernden und proliferationshemmenden Eigenschaften erklärt werden können. Es wurde untersucht, ob Carnosin den Energiemetabolismus der Glioblastome beeinflusst. Dabei konnte mithilfe zellbiochemischer Methoden gezeigt werden, dass die untersuchten Zelllinien nicht von der Energieversorgung durch die mitochondriale oxidative Phosphorylierung abhängen, da sich weder Hemmung (KCN) noch Entkopplung (DNP) der Elektronentransportkette auf den zellulären ATP-Gehalt auswirkten. Carnosin hingegen verringerte den ATP-Spiegel dieser Zellen. Die Hemmung der Glykolyse durch Oxamat (LDH-Hemmung), bewirkte einen starken Abfall des intrazellulären ATP-Spiegels, worauf Carnosin keinen zusätzlichen Effekt mehr besaß. Carnosin konnte eine Wirkung auf die glykolytische ATP-Synthese zugesprochen werden. Da ein direkter, molekularer Wirkungsort auf diesem Weg nicht identifiziert werden konnte, wurde parallel untersucht, ob sich über Proteomanalysen der Glioblastomzelllinie T98G ein Wirkungsort, bzw. -mechanismus bestimmen lässt. Anhand der Methode der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-GE) konnten 31 signifikant differenziell exprimierte Proteine detektiert werden, von denen 6 Proteine (VBP-1, OLA-1, TALDO 1, UROD, BAG-2, GRPEL1) über MALDI-TOF-Analysen identifiziert wurden. In Western-Blot-Analysen konnte ein Protein (VBP-1), neben T98G, auch in primären Glioblastomzelllinien als differenziell exprimiert nachgewiesen werden. Anhand der zellbiologischen und proteinbiochemischen Untersuchungen konnte einerseits eine Verbindung des Carnosins zum HIF1α-Signalweg und andererseits zur generellen posttranslationalen Peptidprozessierung hergestellt werden. Der direkte Nachweis eines Einflusses von Carnosin auf HIF1α wurde aber bisher nicht erbracht.

No description available.

Masspektrometri (MS) är en analysmetod som indikerar provers kemiska sammansättning. Provernas innehåll fragmenteras och joniseras, varefter jonernas förhållande mellan massa och laddning (m/z) och sammanlagda intensiteter mäts i form av ett masspektrum. Tandem-masspektrometri (MS/MS eller MS2) innebär att prover utsätts för MS i två omgångar, där den första resulterar i s.k precursor-joner med skilda m/z och den följande MS omgången analyserar masspektrum från varje precursor-jon. MS2 leder till masspektrum med hög upplösning vilket är användbart vid analys av komplexa prover. Proteinsammansättning i biologiska prover är ett exempel på en typ av vetenskapligt- och kliniskt viktig provtyp samt en mycket komplex sådan. Analysmetoder där MS2 används för sådan analys kallas shotgun-proteomik, vilka tar hänsyn till det extremt stora antalet möjliga peptider genom att använda specifika algoritmer för databehandling. Målet är att identifiera peptid-spektrum matchningar (PSMs), d.v.s att uppskatta vilka peptider som gett upphov till de observerade MS2-spektrumen. I detta syfte används sökmotorer som uppskattar vilka peptider som bäst matchar de precursor-jonerna som för varje MS-spektrum, och bibliotekssökning där MS2-spektrum jämförs med dokumenterade MS2-spektrum som härstammar från diverse peptider för att hitta bäst matchning. I detta projekt utnyttjas en nyligen utvecklad algoritm, en spektrumprediktor, för att skapa en workflow där peptiders masspektrum predikeras utifrån PSMs som hittats av en sökmotor. Därefter jämförs predikerade spektrum med de experimentella spektrumen som användes av sökmotorn, och likheten mellan paren av spektrum räknas ut. Projektet har som mål att kombinera fördelarna med sökmotorer och med bibliotekssökning genom att använda de uträknade likheterna mellan spektrum för att öka antalet PSMs som kan identifieras för den experimentella datan. Genom att använda PSM post-processorn Percolator så kan den uträknade likheten mellan par av spektrum leda till fler PSM-identifikationer då likheten implementeras som features i Percolator. Resultaten av detta visar att Percolator kan identifiera PSMs utifrån features baserade på likhet mellan par av spektrum, varav vissa har q-värden under 0.01 och vissa inte kunde identifieras då Percolator användes i kombination med sökmotorn Crux. Om metoden kan förbättras genom att öka den genomsnittliga likheten mellan par av spektrum, samt om fler mått på likhet implementeras, så kan metoden som beskrivs i projektet bidra till att öka antalet PSM-identifikationer utifrån sökmotorresultat. / Mass spectrometry (MS) is an analysis method revealing chemical composition of samples by fragmenting and ionizing the sample contents and measuring the mass-to-charge ratio (m/z) and cumulative intensity of each produced ion as an ion mass spectrum. Tandem mass spectrometry (MS/MS or MS2) uses two round of MS, the first to produce a set of precursor ions with distinct m/z, and then sequentially analyzing the ionization pattern of each precursor ion with a second round of MS. For complex samples, MS2 provides vastly increased ability to resolve the sample contents. Protein contents of biological samples represents both a critically important analysis target and a highly complex sample type. Analysis of such samples using MS2 is known as shotgun proteomics. The vast number of possible peptides in these samples necessitates the use of specialized algorithms when interpreting MS2 results data which aim to find peptide-spectrum matches (PSMs) between spectra and peptides identities. This includes search engines that predict which peptides best match each MS2 precursor ion, as well as library searching which match known peptide spectra to the MS2 spectral data. This project uses a recent advancement in shotgun proteomics, spectrum predictors, in a workflow that predicts peptide fragment spectra based on peptide identities suggested by a search engine, and calculates spectral similarity between the predicted peptide spectra and the experimental spectra which were assigned these peptides. This method aims to combine the strengths of both search engines and library searching, and to use the similarity score between experimental and predicted spectra to increase the number of spectra that can be confidently matched to a peptide identity. This project utilizes the PSM post-processor Percolator to rescore PSMs after introducing predicted spectrum similarity as a feature of the PSMs. The results indicate that the predicted spectrum similarity score is able to identify additional PSMs when used as a Percolator feature, when compared to the default Percolator PSM features. When using a combination of three similarity scores as a Percolator feature set, a number of PSMs are identified with q-values below 0.01 which were not identified by the corresponding Crux followed by Percolator workflow. If the average spectral similarity of predicted- and experimental spectra can be increased, and additional effective similarity scores can be added, this workflow could provide a useful tool for increasing PSM identifications from search engine results.