Abstract The prognosis of patients with head and neck squamous cell carcinoma has improved only little during the last decades. Clinical markers for the biological aggressiveness of the cancer are few. The most reliable prognostic indicator is the stage of the disease. Research of the significance of the TP53 tumor suppressor gene as a predictive marker for prognosis and response to treatment in head and neck cancer has given discrepant results. One reason is probably the attempt to use p53 immunohistochemistry as a surrogate for TP53 mutations. However, in immunohistochemistry the protein is analyzed and thus the result does not usually correlate with TP53 mutations. The marker for prognosis of the response to treatment has to be reliable, and the analytical method needs to be both sensitive and specific. In addition to a sensitive method for TP53 mutation analysis the localization and quality of the mutations have to be analyzed to reveal the significance of the mutation on the function of the p53 protein. In this study, TP53 mutations were analyzed, using a sensitive PCR-SSCP method, in the tumors of patients with head and neck squamous cell carcinoma. The quality and localization of mutations were analyzed by sequencing. The frequency of the TP53 mutations and the effect on the function of the p53 protein were studied using IARC TP53 mutation database and literature. Correlation of TP53 mutations with chemical exposure and their significance on prognosis and response to radiation treatment was studied. In addition, the significance of cell cycle regulators cyclin D1, p16, p21 as potential markers of biological aggressiveness of tumors was studied. The results of this study showed that the patients carrying in their tumor TP53 mutations in the DNA binding region of the gene had been exposed to chemicals more than patients with no mutation or other types of mutations. These mutations also correlated with biological aggressiveness and prognosis and the response to radiation treatment. It was also shown that a combination of cyclin D1 and p16 analyzed by immunohistochemistry correlated with worse prognosis in head and neck cancer. / Tiivistelmä Pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpää sairastavien potilaiden ennuste ei ole juurikaan parantunut viime vuosikymmeninä. Syövän biologista aggressiivisuutta kuvaavia ennustetekijöitä on vähän, luotettavimpana niistä taudin levinneisyys. Tutkimustulokset TP53-kasvunrajoitegeenin merkityksestä prognostisena ja hoitovastetta kuvaavana, prediktiivisenä merkkiaineena pään ja kaulan alueen syövissä ovat ristiriitaisia. Tämä johtuu muun muassa siitä, että p53-immunohistokemiaa on yritetty käyttää TP53-mutaatioiden analysoimiseen. Immunohistokemiassa analysoidaan proteiinia, eikä tulos siksi yleensä korreloi TP53-mutaatioiden esiintymiseen. Prognostisen tai hoitovastetta ennustavan merkkiaineen tulee mitata haluttua asiaa luotettavasti, ja sen analysoimiseen tulee käyttää herkkää ja spesifistä menetelmää. Herkän mutaatioanalyysimenetelmän lisäksi mutaatioiden paikan ja laadun tarkempi analysoiminen on välttämätöntä, jotta saadaan selville mutaation merkitys p53 proteiinin toiminnalle. Tässä työssä tutkittiin pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpää sairastavien potilaiden kasvaimista TP53- mutaatioiden esiintymistä validoidulla, herkällä PCR-SSCP-menetelmällä. Mutaatioiden laatu ja sijainti geenissä analysoitiin sekvensoimalla. IARC:n TP53-mutaatiotietopankin ja kirjallisuuden tietojen avulla selvitettiin mutaatioiden yleisyys ja niiden vaikutus p53-proteiinin toimintaan. Tutkimuksessa selvitettiin TP53-mutaatioiden korrelaatiota kemialliseen altistumiseen ja niiden merkitystä potilaan ennusteeseen ja sädehoitovasteeseen. Lisäksi tutkittiin solusyklin säätelijöiden sykliini D1-, p16- ja p21-proteiinien merkitystä taudin biologiseen aggressiivisuuteen. Väitöskirjatutkimuksen tulokset osoittivat, että potilaat, joiden kasvaimessa oli TP53-mutaatio DNA-sitoutumisalueella, olivat altistuneet kemikaaleille enemmän kuin potilaat, joiden kasvaimissa oli toisenlaisia mutaatioita tai ei mutaatiota ollenkaan. Tutkimuksessa havaitut mutaatiot liittyivät taudin biologiseen aggressiivisuuteen ja huonoon ennusteeseen sekä heikompaan sädehoitovasteeseen. Lisäksi havaittiin, että sykliini D1- ja p16-proteiinin yhdistelmä immunohistokemiallisesti analysoituna korreloi huonoon ennusteeseen pään ja kaulan syövissä.

Abstract Colorectal cancer is the third most common cancer in the developed countries. Originally, development of CRC was thought to proceed by a sequence of steps known as an adenoma-carcinoma sequence. At present CRC is recognized as a disease developing through diverse pathways. Serrated adenocarcinoma represents an endpoint of tumors developing from serrated pathway. This thesis focuses on studying the molecular alterations in serrated adenocarcinoma. Microsatellite instability, hypermethylation of promoter region in DNA repair genes hMLH1 and MGMT, frequency of KRAS and BRAF mutations and mutation spectrum of PTCH1 was determined in serrated adenocarcinomas (n=42) and compared to non-serrated adenocarcinomas (n=75). MSI, particularly low level of MSI (p=0.02) and methylation of both hMLH1 and MGMT promoters (p=0.004, p=0.026) were found to be more prevalent for serrated CRC. BRAF mutation was frequent and specific to serrated adenocarcinomas (p&lt;0.001) and KRAS mutations were more frequent in serrated adenocarcinomas than in non-serrated cancers (p=0.002). A significant association between BRAF mutation, hMLH1 and MGMT methylation and MSI-H phenotype was found in serrated carcinomas. KRAS mutation was seen in association with MSS/MSI-L phenotype; in fact, if serrated adenocarcinoma presents with MSI-L there always seems to be a KRAS mutation as well. Negative immunohistochemical staining of the hMLH1 enzyme was in association with methylation of the gene and proved reliable in the detection of MSI-H phenotype (p&lt;0.0001). Sequencing analysis of the whole coding regions of the PTCH1 gene did not reveal any truncating mutation to explain the previously detected downregulation of the gene in serrated CRCs. In conclusion, serrated adenocarcinomas proved to be an independent, but heterogeneous subtype of CRCs. High combined mutation rate (79–82%) of KRAS and <I>BRAF</I> in serrated adenomas and adenocarcinomas indicates that MAPK activation is a crucial part of the serrated pathway. BRAF mutations are specific for serrated adenocarcinoma, and identify a subset of serrated adenocarcinomas with gene methylation and a tendency for MSI-H. High frequency of KRAS mutations in serrated adenocarcinomas suggests that a significant proportion of KRAS-mutated CRCs originate from serrated precursors. / Tiivistelmä Paksu- ja peräsuolisyöpä eli kolorektaalisyöpä on Suomessa kolmanneksi yleisin syöpätyyppi. Syöpää edeltävien muutosten tunnistaminen on tärkeää, jotta sen ehkäisy ja seuranta olisi tehokasta. Tavallisia adenoomapolyyppeja on pidetty tärkeimpinä kolorektaalisyövän esiastemuutoksina. 2000-luvulla on havaittu, että nk. sahalaitapolyypit edustavat tärkeää osaa esiastemuutoksista, ja näistä kehittyvää syöpää kutsutaan sahalaitaiseksi syöväksi. Sahalaitaisen syövän kehittymismekanismit eroavat huomattavasti tavallisesta kolorektaalisyövästä. Tässä väitöskirjassa keskityttiin tutkimaan sahalaitaiselle syövälle tyypillisiä morfologisia piirteitä sekä geneettisiä muutoksia. Työssä selvitettiin DNA mikrosatelliitti-instabiliteetin sekä DNA korjausgeenien hMLH1 ja MGMT promoottorialueiden hypermetylaation esiintyminen, nk. MAPK –signaalinsiirtoreitin komponenttien, KRAS ja BRAF -geenien, mutaatioiden yleisyys sekä PTCH1 geenin mutaatiokirjo sahalaitaisissa (n=42) ja tavallisissa kolorektaalisyövissä (n=75). DNA:n mikrosatelliitti-instabiliteetti, erityisesti matala-asteisena (MSI-L) (p=0.02) sekä <I>MLH1</I> ja hMGMT -geenien metylaatio (p=0.004, p=0.026) olivat yleisempiä sahalaitaisissa syövissä. <I>BRAF</I> mutaatio oli yleinen sekä spesifinen sahalaitasyöville (p&lt;0.001). Myös KRAS -mutaatiot olivat yleisempiä sahalaitaisissa syövissä (p=0.002). BRAF mutaatio, hMLH1 sekä MGMT metylaatio ja korkea-asteinen mikrosatelliitti-instabiliteetti (MSI-H) esiintyivät hyvin usein yhdessä sahalaitaisissa syövissä. Sahalaitaisissa syövissä KRAS –mutaatiot liittyivät MSI-L fenotyyppiin. hMLH1 geenin ilmentyminen tutkittiin myös immunohistokemiallisesti. Sahalaitaisissa syövissä MLH1 –proteiinin häviäiminen oli yhteydessä metylaatioon ja liittyi spesifisesti MSI-H:n esiintymiseen (p &lt; 0.0001). PTCH1 geenin sekvensointi ei paljastanut proteiinin toimintaa vahingoittavia muutoksia, eikä tuloksen perusteella pystytä selittämään aikaisemmin havaittua geenin ilmentymisen häviämistä sahalaitaisessa syövässä. Tulosten perusteella sahalaitainen syöpä on oma, mutta heterogeeninen kolorektaalisyövän alatyyppi. KRAS ja BRAF –geenien aktivoivien mutaatioiden yleisyys (79–82%) osoittaa, että MAPK -reitin aktivaatio on tärkeää sahalaitaisen syövän kehityksessä. BRAF -mutaatiot ovat spesifisiä sahalaitaisille syöville, ja yhdessä metylaation sekä MSI-H:n kanssa identifioi osan sahalaitasyövistä omaksi ryhmäkseen. <I>KRAS</I> –mutaatioiden yleisyys sahalaitaisissa syövissä antaa aiheen epäillä, että merkittävä osa KRAS –mutaation sisältävistä kolorektaalisyövistä kehittyy sahalaitapolyypeista.

Abstract Around 5−10% of all breast cancer cases are estimated to result from a strong hereditary predisposition to the disease. However, mutations in the currently known breast cancer susceptibility genes account for only 20−30% of all familial cases. Additional factors contributing to the pathogenesis of breast cancer, therefore, await discovery. Aims of this study were to evaluate variations of the AATF and MRG15 genes as novel potential candidates for breast cancer susceptibility, to further examine the prevalence of the cancer-related PALB2 c.1592delT mutation among BRCA-negative high-risk breast cancer families counselled at the Department of Clinical Genetics, Oulu University Hospital, to identify Finnish Fanconi anaemia patients complementation groups as well as causative mutations, and to evaluate the potential role of these mutations in breast cancer susceptibility. The analysis of 121 familial breast cancer cases revealed altogether seven different sequence changes in the AATF gene. However, none of them were considered pathogenic, suggesting that germline mutations in AATF are rare or absent in breast cancer patients. Investigation of the MRG15 gene among familial breast cancer cases revealed seven previously unreported variants, but in silico analyses revealed that none of these variants appeared to modify the function of MRG15. The results suggest that MRG15 alterations are unlikely to be significant breast cancer susceptibility alleles. A previously identified pathogenic PALB2 mutation, c.1592delT, was identified in three patients from a cohort of 62 high-risk BRCA1/2-negative breast cancer patients from the Department of Clinical Genetics. PALB2 c.1592delT mutation testing should thus be a routine part of the genetic counselling protocol, particularly for BRCA1/2-negative high-risk breast cancer patients. Investigation of the complementation groups of Finnish Fanconi anaemia patients revealed a total of six different causative mutations. These mutations were examined further by analysing their prevalence in large cohorts of breast (n=1840) and prostate (n=565) cancers. However, no significant association emerged between cancer predisposition and these FA mutations. / Tiivistelmä Arviolta 5−10 prosenttia kaikista rintasyöpätapauksista aiheutuu merkittävästä perinnöllisestä alttiudesta sairauteen. Tällä hetkellä tiedossa olevien rintasyövälle altistavien geenivirheiden ajatellaan kuitenkin selittävän vain noin 20−30 prosenttia kaikista perinnöllisistä tapauksista. On todennäköistä, että uusia tekijöitä, jotka osallistuvat rintasyövän patomekanismiin, on vielä löytymättä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida AATF- ja MRG15-geeneissä esiintyvien muutosten mahdollista vaikutusta rintasyöpäalttiuteen, tutkia tarkemmin PALB2 c.1592delT -mutaation esiintymistä BRCA-mutaationegatiivisten korkean rintasyöpäriskin potilaiden joukossa (perinnöllisyyspoliklinikka, Oulun yliopistollinen sairaala) ja määrittää suomalaisten Fanconi-anemiapotilaiden komplementaatioryhmät, sairauden taustalla olevat mutaatiot sekä tutkia näihin mutaatioihin mahdollisesti liittyvää rintasyöpäriskiä. 121 familiaalisen rintasyöpätapauksen analyysissä löytyi yhteensä seitsemän erilaista sekvenssimuutosta AATF-geenissä. Näistä yksikään ei kuitenkaan ollut selvästi patogeeninen. Tuloksen perusteella perinnölliset rintasyövälle altistavat muutokset AATF-geenissä ovat joko erittäin harvinaisia tai niitä ei esiinny lainkaan. MRG15-geenin mutaatioanalyysissä havaittiin seitsemän aikaisemmin raportoimatonta muutosta, mutta in silico -analyysien perusteella millään muutoksista ei ole vaikutusta MRG15-proteiinin toimintaan. Tulosten perusteella on epätodennäköistä, että MRG15-geenin muutokset olisivat merkittäviä rintasyövälle altistavia muutoksia. Jo aiemmin patogeeniseksi todettu PALB2 c.1592delT -mutaatio löydettiin kolmelta niistä perinnöllisyyspoliklinikan korkean syöpäriskin 62 potilaasta, jotka olivat BRCA1/2-geenitestauksessa saaneet normaalin tuloksen. Tulostemme perusteella PALB2 c.1592delT -mutaatiotestaus tulisi Suomessa ottaa osaksi perinnöllisyyspoliklinikoiden tarjomaa tutkimusprotokollaa. Suomalaisten Fanconi-anemiapotilaiden komplementaatioryhmiä selvittävässä tutkimuksessa identifioitiin yhteensä kuusi erilaista tautia aiheuttavaa mutaatiota. Näiden muutosten esiintymistä tutkittiin myös laajoissa rinta- (n=1840) ja eturauhassyöpäaineistoissa (n=565). Tilastollisesti merkittävää assosiaatiota ei kuitenkaan todettu suomalaisten FA-mutaatioiden ja syöpäalttiuden välillä.

Abstract Hereditary mutations in DNA damage response (DDR) genes often lead to genomic instability and ultimately tumor development. However, the molecular mechanism of how these DDR deficiencies promote genomic instability and malignancy is not well understood. Thus, the specific aim of this thesis is to identify the functional and molecular framework behind the elevated breast cancer risk observed in heterozygous PALB2 and ABRAXAS mutation carriers. The heterozygous germline alteration in PALB2 (c.1592delT) causes a haploinsufficiency phenotype in the mutation carrier cells. Due to PALB2 haploinsufficiency, elevated Cdk activity and consequently aberrant DNA replication/damage response was observed in the PALB2 mutation carrier cells. Excessive origin firing that is indicative of replication stress was also seen in the PALB2 mutation carrier cells. In addition to replication stress, PALB2 mutation carrier cells also experience G2/M checkpoint maintenance defects. The increased malignancy risk in females associated with heterozygosity for the Finnish PALB2 founder mutation is likely to be due to aberrant DNA replication, elevated genomic instability and multiple different cell cycle checkpoint defects. The heterozygous germline alteration in ABRAXAS (c.1082G&#62;A) causes a dominant-negative phenotype in the mutation carrier cells. Decreased BRCA1 protein levels as well as reduced nuclear localization and foci formation of BRCA1 and CtIP was observed in the ABRAXAS mutation carrier cells. This causes disturbances in basal BRCA1-A complex localization, which is reflected by a restraint in error-prone DNA double-strand break (DSB) repair pathway usage, attenuated DNA damage response, deregulated G2/M checkpoint control and apoptosis. Most importantly, mutation carrier cells display a change in their transcriptional profile, which we attribute to the reduced nuclear levels of BRCA1. Thus, the Finnish ABRAXAS founder mutation acts in a dominant-negative manner on BRCA1 to promote genome destabilization in the heterozygous carrier cells. / Tiivistelmä Perinnölliset muutokset DNA-vauriovasteen geeneissä johtavat usein genomin epävakauteen ja lopulta syövän kehittymiseen. Molekyylitason mekanismeja, joilla vauriovasteen vajaatoiminta ajaa genomin epävakautta ja syöpää, ei kuitenkaan ymmärretä kunnolla. Tämän väitöskirjan tavoitteena on tunnistaa solutoiminnan ja molekyylitason vaikuttajat heterotsygoottisten PALB2- ja ABRAXAS-geenimuutosten kantajien kohonneen rintasyöpäriskin taustalla. Heterotsygoottinen ituradan suomalainen perustajamuutos PALB2-geenissä (c.1592delT) aiheuttaa haploinsuffisienssin kantajahenkilöiden soluissa. PALB2:n haploinsuffisienssin seurauksena kantajasoluissa havaittiin kohonnutta Cdk-proteiinin aktiivisuutta ja siitä johtuvaa kiihtynyttä DNA:n kahdentumista. PALB2-mutaatiota kantavissa soluissa nähtiin myös liiallista replikaation aloituskohtien käyttöä, mikä viittaa replikaatiostressiin. Replikaatiostressin lisäksi PALB2-mutaation kantajasoluilla havaittiin vaikeuksia ylläpitää solusyklin G2/M-tarkastuspisteen toimintaa. Näiden solutoiminnan poikkeavuuksien takia heterotsygoottisen PALB2 c.1592delT -mutaation kantajilla todettiin genomin epävakautta ja kohonnut syöpäriski. Heterotsygoottinen ituradan mutaatio ABRAXAS-geenissä (c.1082G&#62;A) aiheuttaa dominantti-negatiivisen fenotyypin mutaation kantajasoluissa. ABRAXAS-mutaatiota kantavissa soluissa havaittiin BRCA1-proteiinitasojen laskua sekä BRCA1- ja CtIP-proteiinien vähentynyttä lokalisaatiota tumaan ja DNA-vauriopaikoille. Tämä aiheuttaa häiriöitä BRCA1-A-kompleksin paikallistumisessa, mikä johtaa häiriöihin virhealttiiden DNA-kaksoisjuoste¬katkoksien korjausmekanismien käytössä, DNA-vauriovasteessa, G2/M-tarkastus-pisteen säätelyssä ja ohjelmoidussa solukuolemassa. Tärkeimpänä löydöksenä havaittiin mutaation kantajasoluissa muuttunut transkriptioprofiili, joka johtunee BRCA1-proteiinitasojen laskusta tumassa. Näin ollen suomalainen ABRAXAS-perustajamutaatio toimii dominantti-negatiivisena BRCA1:n suhteen, aiheuttaen genomin epävakautta heterotsygoottisissa kantajasoluissa.

Abstract Mutations in the currently known breast cancer susceptibility genes account for only 25–30% of all familial cases. Novel susceptibility genes can be identified by several methods, including candidate gene re-sequencing and genome-wide microarrays. We have applied microarrays for the detection of a new genomic variation class, copy number variants (CNVs), which potentially could disrupt genes in multiple pathways related to breast cancer susceptibility. The aim of the current study was to evaluate the role of the RNF8, UBC13, MMS2 and RAD51C DNA damage response genes in breast cancer susceptibility as well as to study if rare CNVs are associated with the predisposition to this disease. The analysis of 123 familial breast cancer cases revealed altogether nine different changes in the RNF8 and UBC13 candidate genes. However, none of the observed alterations were considered pathogenic. No alterations were observed in MMS2. The obtained results suggest that breast cancer predisposing alterations in RNF8, UBC13 and MMS2 are rare, or even absent. The RAD51C mutation screening of 147 familial breast cancer cases and 232 unselected ovarian cancer cases revealed two deleterious mutations: c.-13_14del27 was observed in a breast cancer case with familial history of ovarian cancer and c.774delT in an ovarian cancer case. Both mutations were absent in the control cohort. The results of the study support the hypothesis that rare variants of RAD51C predispose predominantly to ovarian cancer. A genome-wide scan of CNVs was performed for 103 familial breast cancer cases and 128 controls. The biological networks of the genes disrupted by CNVs were different between the two groups. In familial breast cancer cases, the observed mutations disrupted genes, which were significantly overrepresented in cellular functions related to maintenance of genomic integrity (P=0.0211). Biological network analysis showed that the disrupted genes were closely related to estrogen signaling and TP53-centered tumor suppressor network, and this result was confirmed by the analysis of an independent young breast cancer cohort of 75 cases. These results suggest that rare CNVs represent an alternative source of genetic variation contributing to hereditary risk for breast cancer. / Tiivistelmä Tunnetut rintasyöpäalttiusgeenien mutaatiot selittävät vain 25–30 prosenttia kaikista perinnöllisistä rintasyöpätapauksista. Uusia alttiusgeenejä voidaan tunnistaa useilla eri menetelmillä, kuten kandidaattigeenien mutaatiokartoituksella ja genomin-laajuisilla mikrosirutekniikoilla. Tässä tutkimuksessa sovelsimme mikrosirutekniikkaa uuden geneettisen variaatioluokan, kopiolukuvariaation (CNV), tutkimiseen. CNV:t voivat vaurioittaa lukuisia rintasyöpäalttiuteen liittyviä biokemiallisia reittejä. Tämän tutkimuksen tarkoitus oli arvioida RNF8-, UBC13-, MMS2- ja RAD51C -DNA- vauriovastegeenien sekä harvinaisten CNV:iden yhteyttä rintasyöpä-alttiuteen. 123 familiaalisen rintasyöpätapauksen analyysissä löytyi yhteensä yhdeksän muutosta RNF8- ja UBC13-geeneistä, joista yksikään ei osoittautunut patogeeniseksi. MMS2-geenissä ei havaittu muutoksia. Tulosten perusteella rintasyövälle altistavat muutokset RNF8-, UBC13- ja MMS2- geeneissä ovat joko erittäin harvinaisia tai niitä ei esiinny lainkaan. RAD51C-geenin mutaatiokartoitus 147 familiaalisesta rintasyöpätapauksesta sekä 232 valikoimattomasta munasarjasyöpätapauksesta paljasti kaksi haitallista mutaatiota. c.-13_14del27 havaittiin rintasyöpäpotilaalla, jonka suvussa esiintyi munasarjasyöpää, ja c.774delT todettiin munasarjasyöpäpotilaalta. Kumpaakaan mutaatiota ei havaittu verrokkiaineistossa. Tulokset vahvistavat hypoteesia RAD51C-geenin harvinaisten varianttien yhteydestä pääasiassa munasarjasyöpäriskiin. CNV:iden genomin-laajuinen skannaaminen suoritettiin 103 familiaaliselle rintasyöpätapaukselle ja 128 verrokille. CNV:iden häiritsemien geenien muodostamat biologiset verkostot olivat erilaiset näiden kahden ryhmän välillä. Familiaalisilla rintasyöpätapauksilla havaitut CNV:t vaikuttivat geeneihin, jotka olivat voimakkaasti korostuneita genomin eheyttä ylläpitävissä tehtävissä (P=0.0211). Biologisten verkostojen analyysi paljasti, että CNV:iden vahingoittamat geenit liittyivät läheisesti estrogeenisignalointiin sekä TP53-tuumorisupressoriverkostoon, ja tämä tulos vahvistettiin analysoimalla riippumatonta nuorista rintasyöpäpotilaista koostuvaa kohorttia (N=75). Tutkimuksen tulosten mukaan harvinaiset CNV:t ovat vaihtoehtoinen geneettisen variaation lähde perinnölliseen rintasyöpäalttiuteen.