Abstract The prognosis of patients with head and neck squamous cell carcinoma has improved only little during the last decades. Clinical markers for the biological aggressiveness of the cancer are few. The most reliable prognostic indicator is the stage of the disease. Research of the significance of the TP53 tumor suppressor gene as a predictive marker for prognosis and response to treatment in head and neck cancer has given discrepant results. One reason is probably the attempt to use p53 immunohistochemistry as a surrogate for TP53 mutations. However, in immunohistochemistry the protein is analyzed and thus the result does not usually correlate with TP53 mutations. The marker for prognosis of the response to treatment has to be reliable, and the analytical method needs to be both sensitive and specific. In addition to a sensitive method for TP53 mutation analysis the localization and quality of the mutations have to be analyzed to reveal the significance of the mutation on the function of the p53 protein. In this study, TP53 mutations were analyzed, using a sensitive PCR-SSCP method, in the tumors of patients with head and neck squamous cell carcinoma. The quality and localization of mutations were analyzed by sequencing. The frequency of the TP53 mutations and the effect on the function of the p53 protein were studied using IARC TP53 mutation database and literature. Correlation of TP53 mutations with chemical exposure and their significance on prognosis and response to radiation treatment was studied. In addition, the significance of cell cycle regulators cyclin D1, p16, p21 as potential markers of biological aggressiveness of tumors was studied. The results of this study showed that the patients carrying in their tumor TP53 mutations in the DNA binding region of the gene had been exposed to chemicals more than patients with no mutation or other types of mutations. These mutations also correlated with biological aggressiveness and prognosis and the response to radiation treatment. It was also shown that a combination of cyclin D1 and p16 analyzed by immunohistochemistry correlated with worse prognosis in head and neck cancer. / Tiivistelmä Pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpää sairastavien potilaiden ennuste ei ole juurikaan parantunut viime vuosikymmeninä. Syövän biologista aggressiivisuutta kuvaavia ennustetekijöitä on vähän, luotettavimpana niistä taudin levinneisyys. Tutkimustulokset TP53-kasvunrajoitegeenin merkityksestä prognostisena ja hoitovastetta kuvaavana, prediktiivisenä merkkiaineena pään ja kaulan alueen syövissä ovat ristiriitaisia. Tämä johtuu muun muassa siitä, että p53-immunohistokemiaa on yritetty käyttää TP53-mutaatioiden analysoimiseen. Immunohistokemiassa analysoidaan proteiinia, eikä tulos siksi yleensä korreloi TP53-mutaatioiden esiintymiseen. Prognostisen tai hoitovastetta ennustavan merkkiaineen tulee mitata haluttua asiaa luotettavasti, ja sen analysoimiseen tulee käyttää herkkää ja spesifistä menetelmää. Herkän mutaatioanalyysimenetelmän lisäksi mutaatioiden paikan ja laadun tarkempi analysoiminen on välttämätöntä, jotta saadaan selville mutaation merkitys p53 proteiinin toiminnalle. Tässä työssä tutkittiin pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpää sairastavien potilaiden kasvaimista TP53- mutaatioiden esiintymistä validoidulla, herkällä PCR-SSCP-menetelmällä. Mutaatioiden laatu ja sijainti geenissä analysoitiin sekvensoimalla. IARC:n TP53-mutaatiotietopankin ja kirjallisuuden tietojen avulla selvitettiin mutaatioiden yleisyys ja niiden vaikutus p53-proteiinin toimintaan. Tutkimuksessa selvitettiin TP53-mutaatioiden korrelaatiota kemialliseen altistumiseen ja niiden merkitystä potilaan ennusteeseen ja sädehoitovasteeseen. Lisäksi tutkittiin solusyklin säätelijöiden sykliini D1-, p16- ja p21-proteiinien merkitystä taudin biologiseen aggressiivisuuteen. Väitöskirjatutkimuksen tulokset osoittivat, että potilaat, joiden kasvaimessa oli TP53-mutaatio DNA-sitoutumisalueella, olivat altistuneet kemikaaleille enemmän kuin potilaat, joiden kasvaimissa oli toisenlaisia mutaatioita tai ei mutaatiota ollenkaan. Tutkimuksessa havaitut mutaatiot liittyivät taudin biologiseen aggressiivisuuteen ja huonoon ennusteeseen sekä heikompaan sädehoitovasteeseen. Lisäksi havaittiin, että sykliini D1- ja p16-proteiinin yhdistelmä immunohistokemiallisesti analysoituna korreloi huonoon ennusteeseen pään ja kaulan syövissä.

Abstract Free flap surgery (FFS) is used for the reconstruction of head and neck defects after tumor resection. Compared to many other cancers requiring operative care, postoperative complications are frequent and the long-term outcome is poor in this patient group. The impact of postoperative complications on outcome, quality of life (QOL) and causes of death has not been well studied. The aim of this thesis was to study the factors associated with postoperative complications after FFS for cancer of the head and neck, as well as the impact of complications on QOL and long-term outcomes. The thesis includes one prospective and three retrospective studies. The study population was 146 head and neck patients undergoing FFS in Oulu University Hospital from 2008 to 2016. The impact of goal-directed fluid management using SVV (stroke volume variation) analysis on postoperative outcome was evaluated retrospectively. It led to a significant reduction in intraoperative fluid administration (6070 ml vs. 8185 ml) and length of stay (LOS) in hospital (11.5 vs. 14.0 days) but had no impact on the rate of postoperative complications. Postoperative complications were recorded in 60% of the patients and were related to alcohol abuse, complicated intraoperative course and fibular flap surgery. The patients with late complications (occurring after the fourth postoperative day) had higher mortality compared to those without. The QOL of 53 patients undergoing operations during 2013-2016 was evaluated using four questionnaires. Patients with medical complications (n=12, 22.6%) had significantly lower QOL in most domains of RAND-36 but QOL for those without complications was comparable to the general population. A total of 62/146 patients (42.5%) died by the end of 2016, and in 72.6% of cases the cause of death was the primary disease. In multivariate analysis male gender, low BMI, ASA above 2 and late medical complications were indicative for long-term mortality. In conclusion, postoperative complications have an impact on outcome after FFS for cancer of the head and neck in terms of QOL and long-term mortality. Patient-related factors were associated with unfavorable outcomes when intraoperative factors did not have as significant a role. Prevention of medical complications and adequate patient selection are essential when aiming to improve outcome after FFS. / Tiivistelmä Mikrovaskulaarikielekkeitä käytetään korjaamaan kasvaimen poiston vuoksi syntyneitä kudospuutoksia pään ja kaulan alueen syöpäpotilailla. Näihin toimenpiteisiin liittyy merkittävä komplikaatioriski ja myös itse syövän pitkäaikaisennuste on huono. Komplikaatioiden vaikutusta toipumisvaiheen elämänlaatuun ja kuolleisuuteen ei ole tutkittu. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli selvittää tekijöitä, jotka liittyvät leikkauksen jälkeisiin komplikaatioihin, ja niiden merkitystä potilaiden elämänlaatuun ja pitkäaikaisennusteeseen. Tutkimuskokonaisuus koostuu kolmesta retrospektiivisestä tutkimuksesta ja yhdestä prospektiivisesta haastattelututkimuksesta. Tutkimukseen kuului 146 vuosina 2008–2016 Oulun yliopistollisessa sairaalassa leikattua pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta. Tutkimuksessa selvitettiin tavoiteohjatun nestehoidon vaikutusta välittömään toipumisvaiheeseen, mutta tällä ei todettu olevan vaikutusta komplikaatioiden ilmaantumiseen. Sen sijaan potilaiden saama nestemäärä väheni merkitsevästi (6070 ml vs. 8185 ml) ja sairaalahoitojakson pituus lyheni (11,5 päivää vs. 14 päivää). Komplikaatioita todettiin 60 % leikkauksista ja useimmin komplikaation sai potilas, jolla oli alkoholin liikakäyttöä, ongelmia toimenpiteen aikana ja luullinen siirre. Neljännen leikkauksen jälkeisen päivän jälkeen ilmenneisiin komplikaatioihin liittyi korkeampi pitkäaikaiskuolleisuus. Elämänlaatu arvioitiin 53 potilaalta, jotka oli leikattu vuosina 2013–2016. Ei-kirurgisia komplikaatioita esiintyi 12 potilaalla ja heidän raportoimansa elämänlaatu oli merkitsevästi alentunut verrattuna muihin potilaisiin. Ilman komplikaatioita toipuneiden elämänlaatu oli verrattavissa väestöarvoihin. 42,5 % leikatuista potilaista oli kuollut vuoden 2016 loppuun mennessä ja 72,6 % heistä kuolema johtui hoidetusta syövästä. Monimuuttujamallissa pitkäaikaiskuolleisuuden riskitekijöitä olivat miessukupuoli, matala BMI, ASA-luokka yli 2 sekä todetut ei-kirurgiset komplikaatiot. Yhteenvetona voidaan todeta, että komplikaatioilla on merkitystä toipumisvaiheen elämänlaatuun ja pitkäaikaiskuolleisuuteen tässä potilasryhmässä. Potilaslähtöiset tekijät vaikuttavat merkittävästi komplikaatioiden ilmaantumiseen ja myös huonoon ennusteeseen. Ei-kirurgisten komplikaatioiden estäminen kuten myös oikea potilasvalinta ovat keskeisessä asemassa, kun tämän potilasryhmän hoidon tuloksia halutaan parantaa.

Abstract Matrix metalloproteinases (MMPs) are the zinc-dependent endopeptidases which belong to a large family of proteases. MMPs are responsible for degradation and remodeling of extracellular matrix proteins during growth, organogenesis and tissue turnover. Besides their role in physiological processes, MMPs also influence various pathological processes, i.e., inflammatory diseases and cancers, in which MMPs may ultimately lead to unwanted tissue destruction. One of the most widely studied MMPs is MMP-8. MMP-8 was previously thought to be expressed only by neutrophils. Presently, it is evident that MMP-8 can be expressed in a wide range of cells such as macrophages, plasma cells, T-cells, endothelial cells, smooth muscle cells, oral epithelial cells, fibroblasts etc. MMP-8 has been previously studied in inflammation and malignancies. High serum MMP-8 concentration is associated with the presence of atherosclerosis and poor cardiovascular disease prognosis, while higher plasma MMP-8 levels protect against lymph node metastasis. Certain MMP-8 gene variations can alter promoter activity and subsequent gene expression. MMP-8 gene variation influences obstetrical outcomes, and lung and breast cancer prognosis. For our study, we hypothesized that systemic levels of MMP-8 correlate with its genetic variations and appear as novel risk markers for disease. We aimed to address the potential role of MMPs and their regulators with a special focus on MMP-8 in distinct sets of inflammatory and malignant diseases, i.e. arterial diseases, and head and neck squamous cell cancer (HNSCC). We demonstrated that the combination of high serum MMP-8 and low myeloperoxidase (MPO) levels is an important risk marker for arterial disease. Further, we demonstrated that MMP-8 gene variation is protective against arterial diseases. Interestingly, we were able to demonstrate an association between MMP-8 gene variation and serum MMP-8 concentration in a healthy population. On the other hand, we showed that plasma tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMP-1) concentration is associated with survival in HNSCC patients and TIMP-1 genotype is associated with plasma TIMP-1 levels in women only. Collectively, our study showed that serum MMP-8 levels can be used as an important risk marker in arterial disease and TIMP-1 levels in HNSCC patients. Based on our results, the hypothesis raised has been widely confirmed. Additionally, our study has warranted the need for further investigation involving a larger number of patients. If our results are replicable, serum MMP-8 and plasma TIMP-1 could be used to develop diagnostic tools as well as treatment regimes in clinics. / Tiivistelmä Matriksin metalloproteinaasit (MMP:t) ovat sinkkiriippuvaisia endopeptidaaseja, jotka kuuluvat laajaan proteiineja pilkkovaan proteolyyttiseen entsyymi perheeseen. MMP:ien tehtävä on pilkkoa ja uudelleen muokata soluväliaineen proteiineja kasvun, elinten kehityksen ja kudosten uusiutumisen aikana, mutta MMP:t toimivat aktiivisesti myös patologisissa prosesseissa, kuten tulehdustiloissa ja syövissä. Syövissä MMP:en vaikutus voi johtaa ei-toivottuun kudostuhoon. Yksi laajimmin tutkituista MMP-ryhmän entsyymeistä on MMP-8, jonka alunpitäen ajateltiin ilmenevän vain neutrofiileissä. Nykytietämyksen mukaan MMP-8:aa ilmentyy myös mm. makrofaageissa, plasmasoluissa, T-soluissa, endoteelisoluissa, sileälihassoluissa, suun limakalvon epiteelisoluissa ja fibroplasteissa. MMP-8:aa on aikaisemmin tutkittu erityisesti tulehdustiloissa ja pahanlaatuisissa kasvaimissa. Korkean MMP-8 seerumipitoisuuden on havaittu liittyvän valtimokovettumatautiin ja huonoon ennusteeseen sydän- ja verisuonisairauksissa, kun taas kohonnut MMP-8:n pitoisuus plasmassa suojaa imusolmuke-etäpesäkkeiltä. Tiedetään, että tietyt muutokset MMP-8:n geenissä voivat muuttaa sen promoottoriaktiviteettia ja täten säädellä geenin ilmentymistä. MMP-8:n geenimuutokset vaikuttanevat raskaudenkulkuun sekä keuhko- ja rintasyövän ennusteeseen. Tutkimushypoteesimme mukaan MMP-8:n seerumipitoisuudet riippuvat vaihtelusta MMP-8:aa koodaavassa geenissä ja niitä voidaan pitää uusina riskinarvioinnin merkkiaineina tautitiloissa. Tavoitteenamme oli osoittaa yleisesti MMP:ien ja erityisesti MMP-8:n sekä näiden proteinaasien säätelytekijöiden merkitys tietyissä tulehdustiloissa ja maligniteeteissa, kuten sepelvaltimotaudissa ja pään ja kaulan alueen syövissä. Havaitsimme, että korkea MMP-8 seerumipitoisuus ja alhainen myeloperoksidaasitaso yhdistyvät vahvasti valtimotautiriskiin. Lisäksi osoitimme, että tietty MMP-8:n geenimuunnos on suojaava tekijä valtimotaudille ja että MMP-8:n seerumikonsentraatio on siitä riippuvainen terveillä tutkituilla. Tämän lisäksi todensimme, että MMP:n kudosestäjän (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMP-1) plasmapitoisuus liittyy pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpää sairastavien potilaiden eloonjääntiin ja että TIMP-1:n genotyyppi liittyy sen plasmapitoisuuteen ainoastaan naisilla. Tulostemme mukaan seerumin MMP-8-pitoisuutta voidaan pitää hyvänä riskinarviointivälineenä verisuonitaudeissa sekä TIMP-1-pitoisuutta vastaavasti pään ja kaulan alueen levyepiteelisyövissä. Saadut tulokset tukevat olettamustamme, jonka mukaan MMP-8 on tärkeä tautimarkkeri. Tämä on lisännyt kiinnostusta selvittää MMP:ien merkitystä laajemmin muissa tulehdustiloissa ja syövissä. Jos tulokset saadaan toistetuksi laajemmassa tutkimusaineistossa, seerumin MMP-8:sta voidaan kehittää kliinisten ja analyyttisten laboratorioiden käyttöön sopiva diagnostinen menetelmä.