Abstract Colorectal cancer (CRC) is among the most common cancers in Finland. Prognostic factors are important for predicting disease outcome and adjusting optimal treatment. The currently used prognostic methods for CRC have their limitations and consequently several biomarkers have been studied to find potential prognostic markers, but none have been adapted for routine use so far. In the present study, the relationships between the components of the immune system and other factors modulating tumor growth were assessed and their suitability to be used for use as prognostic tools in CRC were studied. The study material consisted of blood samples and surgical specimens collected from 148 CRC patients operated on in Oulu University Hospital and blood samples of 86 healthy controls. Concentrations of endostatin and 27 cytokines were measured from preoperative serum samples and control samples. Immunohistochemical methods were used for collagen XVIII and inflammatory cell analyses. The levels of several cytokines were altered in CRC patients compared to the controls. The serum cytokine profile achieved an excellent accuracy in discriminating CRC patients from healthy controls. Advanced CRCs were associated with elevated cytokine levels and a metastasized disease was linked to an orientation towards Th2 cytokine milieu. The presence of systemic inflammation, depicted by a modified Glasgow Prognostic Score (mGPS), correlated to CRC progression. The serum endostatin levels were elevated in CRC and correlated with invasion through muscular layer and systemic inflammation, but not with densities of local inflammatory cells. Collagen XVIII was expressed in tumor stroma and in the muscle layer of bowel wall. The serum cytokines and tumor infiltrating immune cells showed relatively weak associations. In conclusion, CRC is associated with significant alterations in serum cytokine milieu, which underlines the relevance of studying several cytokines and their relative alterations. The serum cytokine profile is a promising tool for discriminating CRC patients from healthy controls, but its clinical value needs to be validated. The elevated endostatin levels may result from invasion-related cleavage of collagen XVIII in the bowel wall, but further studies are needed to determine the value of endostatin in CRC prognosis. / Tiivistelmä Paksu- ja peräsuolisyöpä (kolorektaalisyöpä) on yleisimpiä syöpämuotoja Suomessa. Sen ennustetta kuvaavat mittarit ovat tärkeitä taudin etenemisen ennustamisessa ja hoidon suunnittelussa. Käytössä olevat kolorektaalisyövän ennusteen arvioinnin menetelmät eivät ole riittäviä. Uusia merkkiaineita onkin kehitetty ja testattu, mutta rutiinikäyttöön soveltuvia menetelmiä ei ole vielä löydetty. Tässä tutkimuksessa selvitettiin immuunijärjestelmän ja muiden kasvaimen kasvua säätelevien tekijöiden keskinäisiä yhteyksiä ja niiden merkitystä kolorektaalisyövän ennusteen arvioinnissa. Tutkimusmateriaali koostui Oulun yliopistollisessa sairaalassa leikattujen kolorektaalisyöpäpotilaiden (n = 148) leikkaus- ja verinäytteistä ja terveiden verrokkihenkilöiden (n = 86) verinäytteistä. Endostatiinin ja 27 sytokiinin pitoisuudet mitattiin seeruminäytteistä. Kollageeni XVIII:n ja tulehdussolujen analysoimiseen käytettiin immunohistokemiallisia menetelmiä. Useiden sytokiinien pitoisuudet olivat korkeammat potilailla kuin verrokeilla, mutta osassa sytokiineista pitoisuudet olivat alentuneet. Seerumin sytokiiniprofiili erotteli luotettavasti potilaat verrokeista. Pidemmälle edenneeseen tautiin liittyi sytokiinien korkeampia pitoisuuksia ja etäpesäkkeitä muodostanut tauti oli yhteydessä Th1-tyypin sytokiinien esiintymiseen. Systeeminen tulehdusreaktio oli yhteydessä syövän etenemiseen. Endostatiinipitoisuudet olivat kohonneet potilailla ja olivat yhteydessä kasvaimen invaasioon suolen seinämän lihaskerroksen läpi. Endostatiinipitoisuudet korreloivat myös systeemisen tulehdusreaktion kanssa, mutta eivät liittyneet paikallisten tulehdussolujen määrään. Kollageeni XVIII ilmentyi kasvaimen stroomassa ja suolen seinämän lihaskerroksessa. Sytokiineilla ja kasvaimen paikallisilla tulehdussoluilla todettiin olevan vain vähän keskinäisiä yhteyksiä. Kolorektaalisyöpään liittyy useita erisuuntaisia muutoksia seerumin sytokiinipitoisuuksissa, joten on olennaista tutkia eri sytokiinien suhteellisia muutoksia. Seerumin sytokiiniprofiili on lupaava potilaita ja verrokeita erotteleva mittari, jolla voi olla diagnostista arvoa. Kohonneet endostatiinipitoisuudet potilailla voivat johtua kasvaimen invaasioon liittyvästä kollageeni XVIII:n hajoamisesta suolen seinämässä, mutta lisätutkimuksia tarvitaan endostatiinin ennustetta kuvaavan arvon määrittämiseksi.

Abstract Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies and causes of cancer deaths in Finland. Increased number of tumor-infiltrating immune cells has been associated with improved survival in CRC. However, accurate, reproducible analysis methods, as well as better understanding of the interrelationships between different inflammatory markers would be important in order to establish a valuable prognostic and potentially predictive tool. In these studies, a computer-assisted method for the analysis of the densities of tumor-infiltrating immune cells and a quantitative method for the evaluation of CRC-associated lymphoid reaction (CLR) were adopted and validated. Utilizing the new methods, the inflammatory cell infiltration was characterized in independent groups of 418 (Cohort 1) and 149 (Cohort 2) CRC patients. Serum matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) levels were measured in Cohort 2 and in a control group of 83 healthy age- and gender-matched controls. The automated cell counting method was found accurate and reproducible. In the tumor samples, there were high positive correlations between different types of immune cells, with the exception of mast cells and CD1a+ immature dendritic cells. High numbers of T cells predicted improved disease-free survival. High CLR density correlated with low tumor stage, but also with better survival regardless of stage. The median serum MMP-8 level of the patients was more than three times higher than that of the healthy controls. In conclusion, the present studies provide insight into the significance of various immune cell types and inflammatory markers in CRC and validate new methods for the analysis of immune cell infiltration in CRC. The results suggest that, especially, the densities of tumor-infiltrating T cells and CLR represent relevant prognostic indicators in CRC. Further studies are needed to evaluate the potential value of serum MMP-8 as an aid for CRC diagnostics, surveillance, or prognostication. / Tiivistelmä Kolorektaalisyöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisista kasvaintaudeista ja syöpäkuolemien aiheuttajista Suomessa. Tulehdussolujen korkean määrän kasvainnäytteissä on havaittu olevan yhteydessä potilaiden parempaan ennusteeseen. Tarkat ja luotettavat analyysimenetelmät sekä tieto eri tulehdusmerkkiaineiden keskinäisistä yhteyksistä olisivat tärkeitä, jotta tulehdussolukon määritystä voitaisiin luotettavasti käyttää potilaiden ennusteen arviointiin. Tutkimuksessa otettiin käyttöön ja validoitiin uusi tietokonepohjainen menetelmä kasvaimen tulehdussolukon arviointiin sekä uusi menetelmä kolorektaalisyövän imukeräsreaktion arviointiin. Kasvainnäytteiden tulehdussolukon määrää ja laatua analysoitiin itsenäisissä 418 (Kohortti 1) ja 149 (Kohortti 2) kolorektaalisyöpäpotilaan aineistoissa uusia menetelmiä hyödyntäen. Lisäksi kohortilta 2 sekä 83 terveeltä ikä- ja sukupuolivalikoidulta verrokilta määritettiin seerumin matriksin metalloproteinaasi-8 (MMP-8) -taso. Tietokonepohjaisen kuva-analyysin tarkkuus ja toistettavuus todettiin erinomaiseksi. Kasvainnäytteistä analysoitujen tulehdussolutyyppien määrät olivat riippuvaisia toisistaan mast-soluja ja CD1a+ epäkypsiä dendriittisoluja lukuun ottamatta. T-solujen runsas määrä oli yhteydessä taudin vähäisempään uusiutumisriskiin. Korkea imukerästiheys kasvainnäytteissä oli yhteydessä matalaan levinneisyysasteeseen sekä potilaiden parempaan ennusteeseen levinneisyysasteesta riippumatta. Seerumin MMP-8-tason mediaani oli potilailla yli kolme kertaa korkeampi kuin terveillä verrokeilla. Tutkimus tuo lisätietoa eri tulehdussolutyyppien ja tulehdusmerkkiaineiden merkityksestä kolorektaalisyövässä, ja sen tuloksena validoitiin uusia tulehdussolukon analysointimenetelmiä. Tulosten perusteella erityisesti kasvaimen alueen T-solujen ja imukerästen tiheys tuovat hyödyllistä tietoa potilaiden ennusteesta. Lisätutkimuksia tarvitaan seerumin MMP-8:n mahdollisesta soveltuvuudesta kolorektaalisyövän diagnostiikan, seurannan tai ennusteen määrittämisen apuvälineeksi.