Abstract Colorectal cancer (CRC) is among the most common cancers in Finland. Prognostic factors are important for predicting disease outcome and adjusting optimal treatment. The currently used prognostic methods for CRC have their limitations and consequently several biomarkers have been studied to find potential prognostic markers, but none have been adapted for routine use so far. In the present study, the relationships between the components of the immune system and other factors modulating tumor growth were assessed and their suitability to be used for use as prognostic tools in CRC were studied. The study material consisted of blood samples and surgical specimens collected from 148 CRC patients operated on in Oulu University Hospital and blood samples of 86 healthy controls. Concentrations of endostatin and 27 cytokines were measured from preoperative serum samples and control samples. Immunohistochemical methods were used for collagen XVIII and inflammatory cell analyses. The levels of several cytokines were altered in CRC patients compared to the controls. The serum cytokine profile achieved an excellent accuracy in discriminating CRC patients from healthy controls. Advanced CRCs were associated with elevated cytokine levels and a metastasized disease was linked to an orientation towards Th2 cytokine milieu. The presence of systemic inflammation, depicted by a modified Glasgow Prognostic Score (mGPS), correlated to CRC progression. The serum endostatin levels were elevated in CRC and correlated with invasion through muscular layer and systemic inflammation, but not with densities of local inflammatory cells. Collagen XVIII was expressed in tumor stroma and in the muscle layer of bowel wall. The serum cytokines and tumor infiltrating immune cells showed relatively weak associations. In conclusion, CRC is associated with significant alterations in serum cytokine milieu, which underlines the relevance of studying several cytokines and their relative alterations. The serum cytokine profile is a promising tool for discriminating CRC patients from healthy controls, but its clinical value needs to be validated. The elevated endostatin levels may result from invasion-related cleavage of collagen XVIII in the bowel wall, but further studies are needed to determine the value of endostatin in CRC prognosis. / Tiivistelmä Paksu- ja peräsuolisyöpä (kolorektaalisyöpä) on yleisimpiä syöpämuotoja Suomessa. Sen ennustetta kuvaavat mittarit ovat tärkeitä taudin etenemisen ennustamisessa ja hoidon suunnittelussa. Käytössä olevat kolorektaalisyövän ennusteen arvioinnin menetelmät eivät ole riittäviä. Uusia merkkiaineita onkin kehitetty ja testattu, mutta rutiinikäyttöön soveltuvia menetelmiä ei ole vielä löydetty. Tässä tutkimuksessa selvitettiin immuunijärjestelmän ja muiden kasvaimen kasvua säätelevien tekijöiden keskinäisiä yhteyksiä ja niiden merkitystä kolorektaalisyövän ennusteen arvioinnissa. Tutkimusmateriaali koostui Oulun yliopistollisessa sairaalassa leikattujen kolorektaalisyöpäpotilaiden (n = 148) leikkaus- ja verinäytteistä ja terveiden verrokkihenkilöiden (n = 86) verinäytteistä. Endostatiinin ja 27 sytokiinin pitoisuudet mitattiin seeruminäytteistä. Kollageeni XVIII:n ja tulehdussolujen analysoimiseen käytettiin immunohistokemiallisia menetelmiä. Useiden sytokiinien pitoisuudet olivat korkeammat potilailla kuin verrokeilla, mutta osassa sytokiineista pitoisuudet olivat alentuneet. Seerumin sytokiiniprofiili erotteli luotettavasti potilaat verrokeista. Pidemmälle edenneeseen tautiin liittyi sytokiinien korkeampia pitoisuuksia ja etäpesäkkeitä muodostanut tauti oli yhteydessä Th1-tyypin sytokiinien esiintymiseen. Systeeminen tulehdusreaktio oli yhteydessä syövän etenemiseen. Endostatiinipitoisuudet olivat kohonneet potilailla ja olivat yhteydessä kasvaimen invaasioon suolen seinämän lihaskerroksen läpi. Endostatiinipitoisuudet korreloivat myös systeemisen tulehdusreaktion kanssa, mutta eivät liittyneet paikallisten tulehdussolujen määrään. Kollageeni XVIII ilmentyi kasvaimen stroomassa ja suolen seinämän lihaskerroksessa. Sytokiineilla ja kasvaimen paikallisilla tulehdussoluilla todettiin olevan vain vähän keskinäisiä yhteyksiä. Kolorektaalisyöpään liittyy useita erisuuntaisia muutoksia seerumin sytokiinipitoisuuksissa, joten on olennaista tutkia eri sytokiinien suhteellisia muutoksia. Seerumin sytokiiniprofiili on lupaava potilaita ja verrokeita erotteleva mittari, jolla voi olla diagnostista arvoa. Kohonneet endostatiinipitoisuudet potilailla voivat johtua kasvaimen invaasioon liittyvästä kollageeni XVIII:n hajoamisesta suolen seinämässä, mutta lisätutkimuksia tarvitaan endostatiinin ennustetta kuvaavan arvon määrittämiseksi.

Abstract Prognostic features of colorectal cancer (CRC) are important for determining the optimal treatment for an individual patient. This study was carried out to evaluate the significance of the prognostic significance of inflammatory cell reaction and tumour budding at the invasive front of the tumour in CRC patients, to study the pattern of alterations in the serum cytokine levels of CRC patients compared to healthy controls, and to evaluate whether the patterns of the cytokine levels alter according to the stage of disease. Study material consists of a series of CRC patients operated in Oulu University Hospital (N=466, studies I-II, and N=148, study III). The intensities of inflammatory cell reaction and tumour budding were estimated and the association of these features with survival was analysed (I-II). Preoperative serum samples were collected from patients and age- and sex-matched controls, and concentrations of 13 cytokines and chemokines were analysed (III). Inflammatory cell reaction and tumour budding at the tumour invasive margin were independent prognostic markers in CRC. In patients with stage I-II disease, high-grade inflammation was associated with better 5-year survival (87.6%) than low-grade inflammation (47.0%). Tumour budding was present in 24.0% of cases and predicted worse 5-year survival (15.4% in contrast to 63.5%). Serum levels of PDGF, IL-6, IL-7, and IL-8 were higher, and levels of MCP-1 were lower in CRC patients compared to controls. A pattern of five most predictive cytokines reached an excellent capacity in discriminating patients from healthy controls and reached an AUC of 0.890 in the ROC analysis. High-stage CRC was associated with increased levels of IL-6, IL-8 and IL-1ra, and metastasised disease was accompanied by an orientation to Th2 cytokine milieu. According to this study, patients with CRC can be stratified into different prognostic groups by assessing inflammatory cell reaction and tumour budding at the invasive front of the tumour. Evaluation of these features may give additional information for making treatment decisions. Serum cytokine profile was shown to change during cancer progression and seems promising in separating CRC patients from healthy controls, but its clinical value is yet to be confirmed. / Tiivistelmä Kasvaimen ennusteeseen vaikuttavien tekijöiden tunteminen on tärkeää syöpäpotilaan yksilöllisen hoidon suunnittelussa. Tässä tutkimuksessa selvitettiin kasvaimen tulehdusreaktion ja kasvaimen reunan silmuilevan kasvutavan merkitystä kolorektaalisyöpäpotilaiden ennusteeseen. Lisäksi tutkimuksessa mitattiin tulehdusreaktion välittäjäaineiden, seerumin sytokiinien, pitoisuuksia potilailla ja verrokeilla sekä näiden pitoisuuksien vaihtelua suhteessa syövän levinneisyyteen. Tutkimusaineisto koostui Oulun yliopistollisessa sairaalassa leikatuista kolorektaalisyöpäpotilaista (N=466, tutkimukset I–II, N=148, tutkimus III). Kasvainnäytteistä tutkittiin kasvaimen tulehdusreaktion ja silmuilevan kasvutavan voimakkuutta ja arvioitiin näitä piirteitä suhteessa potilaiden elinaikatietoihin (tutkimukset I–II). Potilaiden ja verrokkihenkilöiden seeruminäytteistä mitattiin 13 sytokiinin pitoisuudet (tutkimus III). Kasvaimen tulehdusreaktio ja silmuileva kasvutapa osoittautuivat itsenäisiksi ennustetekijöiksi. Potilailla oli parempi 5-vuotisennuste (87.6 %), jos kasvaimen tulehdusreaktio oli voimakas verrattuna tapauksiin, joissa tulehdusreaktio oli heikko (47.0 %). 24 %:ssa kasvaimista kasvutapa oli silmuileva, ja näillä 5-vuotisennuste oli huonompi kuin ei-silmuilevissa (15.4 % vs. 63.5 %). Potilailla todettiin korkeammat seerumin PDGF, IL-6, IL-7, ja IL-8 -pitoisuudet ja matalammat MCP-1 -pitoisuudet kuin verrokeilla. Mittaamalla viiden ennustearvoltaan merkitsevimmän sytokiinin pitoisuudet voitiin potilaat luotettavasti erottaa verrokeista ROC-analyysin avulla, kun ROC-käyrän alle jäävä pinta-ala oli 0.890 %. Pidemmälle levinneissä taudeissa todettiin korkeampia IL-6, IL-8 ja IL-1ra -pitoisuuksia, ja etäpesäkkeisissä taudeissa sytokiinipitoisuudet muuttuivat Th2 -profiilin suuntaiseksi. Tutkimuksen mukaan kasvaimen tulehdusreaktion ja silmuilevan kasvutavan arvioinnilla kolorektaalisyöpäpotilaat voidaan jakaa ennusteellisiin ryhmiin, mitä on mahdollista hyödyntää hoidon suunnittelussa. Seerumin sytokiiniprofiilin osoitettiin muuttuvan taudin edetessä, ja sytokiinien pitoisuudet poikkeavat kolorektaalisyöpäpotilailla verrattuna terveiltä verrokeilta mitattuihin arvoihin.