Memoria para optar el título de Bioquímico / Los receptores tipo Toll (TLR) son proteínas de transmembrana que reconocen
patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). El TLR2 reconoce PAMPs de
bacterias gram positivas, los cuales activan una vía de señalización clásica que
involucra el reclutamiento de la proteína MyD88 y una alternativa donde participa la
Fosfoinositol 3-Quinasa (PI3K). A su vez, los glucocorticoides (GCs) son moléculas que
suprimen la inflamación y la inmunidad adaptativa, que recientemente han sido
reportadas como potenciadoras de la expresión de ciertas moléculas de la inmunidad
innata, tales como el TLR2. La importancia de PI3K y los GC en la regulación de la vía
alternativa del TLR2 no ha sido estudiada aún.
El objetivo general fue determinar la participación de PI3K en la producción de
TNFα inducida por agonistas del TLR2 y GCs. Los objetivos específicos fueron: 1)
Analizar el efecto de Pam3Cys-Ser-Lys4 un lipopéptido sintético análogo a la porción
NH2-terminal de lipoproteínas de bacterias gram positivas, y Dexametasona, sobre la
secreción de TNFα y la activación transcripcional de NFκB, en células A549. 2)
Estudiar la participación de PI3K-Akt en la ruta de señalización del TLR2 inducida por
Pam3Cys-Ser-Lys4 y Dexametasona. 3) Determinar la interacción entre TLR2-PI3K y
GR-PI3K.
Los resultados obtenidos muestran que la activación del TLR2 por Pam3Cys-Ser-
Lys4 provocó un aumento en la expresión de TNFα y la activación transcripcional del
TLR2, sin embargo el co-tratamiento con Dexametasona no alteró el efecto del
agonista del TLR2. Al mismo tiempo, PI3K aumenta la expresión de TNFα e inhibe la
transcripción del TLR2, al usar un dominante negativo para PI3K (p85-DN). PI3K activa
la transcripción de genes que responden a la movilización de NFκB y AP-1, ya que
células expuestas a Pam3Cys-Ser-Lys4 y que expresan el constructo p85-DN,
presentan una disminución significativa de la activación transcripcional de NFκB y APLos
resultados indicaron que Pam3Cys-Ser-Lys4 aumentó significativamente la
fosforilación de Akt, como un indicador indirecto de la actividad de PI3K, y
Dexametasona la revirtió. Por otra parte, se determinó la interacción entre p85 con el GR o el TLR2, siendo la
primera modulada exclusivamente por Dexametasona.
Estos resultados demuestran que PI3K presenta diversos mecanismos de
regulación en la vía de señalización del TLR2 y además proponen mecanismos por los
que los GCs intervienen en la ruta transduccional / Toll-like receptors (TLRs) are transmembrane proteins that recognize pathogenassociated
molecular patterns (PAMPs). TLR2 identify PAMPs from gram positive
bacteria, which activate a classical signaling pathway involving MyD88 recruitment to
the receptor intracellular domain, and an alternative signaling pathway, which
comprises the activation of the phosphoinositol 3-kinase (PI3K). Moreover,
glucocorticoids (GCs) suppress the inflammation and adaptive immune responses, and
have been recently reported to enhance the TNFα-induced expression of TLR2. The
relevance of GCs in the regulation of the alternative pathway has not yet been
described.
The general aim of this thesis was to determine PI3K participation on TNFα
production induced by TLR2 agonists in the presence or absence of GCs. The specific
aims were: 1) To analyze the effect of Pam3Cys-Ser-Lys4, a specific synthetic ligand
analogue to the NH2-terminal portion of gram positive bacterial lipoproteins, and
Dexamethasone, a synthetic GC, on TNFα expression and NFκB transcriptional
activation,in A549 cells. 2) To study the role of PI3K-Akt in the TLR2 signaling pathway
induced by Pam3Cys-Ser-Lys4 in the presence or absence of Dexamethasone. 3) To
determine the interaction between TLR2-PI3K and GR-PI3K.
The results show that TLR2 activation by Pam3Cys-Ser-Lys4 promotes TNFα
expression and TLR2 transcriptional activity, however co-treatment of cells with
Pam3Cys-Ser-Lys4 and Dexamethasone did not revert TNFα increase. In relation to this
pathway, we investigated if PI3K was involved in TNFα expression and TLR2
transcription activity regulation. Pam3Cys-Ser-Lys4 significantly increased Akt
phosphorylation, as an indicator of PI3K activity, and Dexamethasone reverted to it.
Moreover, by using a PI3K regulatory subunit dominant negative mutant cDNA
(p85-DN) transiently expressed in cells, a remarkably decrease in NFκB and AP-1
transcriptional activation was observed. On the other hand, we determined p85 regulatory PI3K subunit interaction with GR
or TLR2, and we were able to identify interaction between p85-GR in the presence of
Dexamethasone. These results demonstrate that PI3K shows different mechanism of
regulation in the TLR2 signaling and propose pathways in which GCs may be
participating
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105556 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Arancibia Zunino, Sergio Andrés |
| Contributors | Miranda Wilson, Dante, Hermoso Ramello, Marcela, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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