Existe una gran cantidad de patologías que afectan al esqueleto, en las que se ve comprometido el balance entre la formación y la resorción ósea. Generalmente, las alternativas terapéuticas apuntan a la modulación de la resorción ósea actuando a nivel del osteoclasto. Sin embargo, estos abordajes terapéuticos no resultan suficientes, generando la necesidad de implementar nuevas estrategias farmacológicas con blanco de acción en la fisiología de la célula formadora de hueso, el osteoblasto. Para ello, un extensivo y detallado conocimiento tanto de la función como de los procesos de proliferación, migración y diferenciación, de la citada célula, son necesarios.
El sistema de señalización purinérgico, donde los nucleótidos son liberados por las células, de manera controlada, y actúan como mensajeros extracelulares activando receptores purinérgicos en la membrana plasmática de la célula blanco es conocido desde hace unos 45 años. Desde entonces, se ha reportado un número creciente de células capaces de liberar nucleótidos, de manera controlada, al medio extracelular, lo que sumado al hecho de que, virtualmente, todas las células del cuerpo poseen algún tipo de receptor purinérgico (purinoceptor), hace de este sistema de señalización uno de los más importantes respecto de la regulación de la homeostasis del cuerpo.
El papel de los nucleótidos y sus receptores en los procesos de proliferación y diferenciación de los osteoblastos ha sido estudiado desde hace unos 25 años. Sin embargo, aún no se ha alcanzado la dilucidación completa de los mecanismos regulatorios de estos procesos.
El objetivo de esta tesis fue determinar los efectos de la activación de receptores purinérgicos, por nucleótidos extracelulares, en los procesos de migración, proliferación y diferenciación celular de cultivos primarios de calvaria de rata neonata. Se investigó también, el efecto de una concentración elevada de calcio extracelular en la proliferación y diferenciación celular y su influencia en la regulación de dichos procesos por la estimulación purinérgica. Además, se evaluó el rol de la enzima GSK3 (por inhibición con Litio), en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. Por último, se examinó el efecto de los agonistas mencionados sobre la expresión y localización de β-catenina.
La migración celular fue evaluada mediante “ensayo de la herida”. El tratamiento con los nucleótidos mostró estimular la migración de las células calvariales.
Para estudiar el proceso de proliferación se recurrió a citometría de flujo, recuento en cámara de Neubauer y tinción con Cristal Violeta. Los resultados obtenidos le atribuyen efectos positivos a los nucleótidos extracelulares. Por otro lado, el tratamiento con Litio provocó disminuciones en la capacidad proliferativa de las células. Mientras que no se observaron cambios en la proliferación por incubación de las células en un medio con elevada concentración de Calcio extracelular.
El análisis de la diferenciación de las células a un fenotipo osteoblástico se llevó a cabo mediante mediciones de actividad enzimática de Fosfatasa Alcalina, cuantificación de ARNm de marcadores de maduración/diferenciación osteoblástica por QRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa) y detección de mineralización por tinción con rojo de Alizarina. Al respecto, el tratamiento con ATPγS exhibió un rol pro-osteogénico, al elevar la actividad enzimática de FAL, la expresión génica de marcadores de diferenciación y la capacidad mineralizante. En cambio, el agonista UTP no indujo cambios en la actividad de la enzima y, en la mayoría de los casos, reprimió la transcripción de genes osteogénicos.
Por su parte, la exposición a Litio incrementó la actividad de FAL pero reprimió la expresión de genes osteogénicos y disminuyó la mineralización de los cultivos.
Una elevada concentración de Calcio extracelular mostró efectos positivos a nivel de diferenciación, al incrementar la actividad FAL y la mineralización de los osteoblastos.
Finalmente, el tratamiento de los cultivos con nucleótidos extracelulares, en un medio conteniendo elevada concentración de Calcio, mostró leves efectos aditivos/sinergísticos en la estimulación de la diferenciación a células formadoras de hueso.
La expresión de β-catenina resultó aumentada bajo tratamiento con nucleótidos extracelulares, Litio o Calcio. Asimismo, la translocación a núcleo se vio incrementada por dichos tratamientos.
De acuerdo a los resultados obtenidos en esta tesis, puede atribuirse un rol regulatorio sobre la fisiología osteoblástica al sistema de señalización purinérgico y GSK3/ β-catenina. / There are a great number of pathologies that affect the skeleton, in which the balance between formation and bone resorption is compromised. Generally, the therapeutic alternatives point to the modulation of the bone resorption acting at the level of the osteoclast. However, these therapeutic approaches are not enough, generating the need to implement new pharmacological strategies targeting the physiology of the bone-forming cell, the osteoblast. To this end, an extensive and detailed knowledge of both the function and processes of proliferation, migration and differentiation of the aforementioned cell are necessary.
Purinergic signaling system, wherein nucleotides are released by cells in a controlled manner, and act as extracellular messengers activating purinergic receptors in the plasma membrane of the target cell is known for about 45 years. Since then, it has been reported an increasing number of cells capable of releasing nucleotides, in a controlled manner, to the extracellular medium, which together with the fact that virtually all cells in the body have some type of purinergic receptor (purinoceptor), makes of this signaling system one of the most important regarding the regulation of body homeostasis.
The role of nucleotides and their receptors in the proliferation and differentiation processes of osteoblasts has been studied for about 25 years. However, the complete elucidation of the regulatory mechanisms of these processes has not yet been reached.
The aim of this work was to determine the effects of the activation of purinergic receptors by extracellular nucleotides in the processes of cell migration, proliferation and differentiation in neonatal rat calvaria primary cultures. We also investigated the effect of a high concentration of extracellular calcium on cell proliferation and differentiation and its influence on the regulation of these processes by purinergic stimulation. In addition, the role of the GSK3 enzyme (by inhibition with lithium) was evaluated in the regulation of cell proliferation and differentiation. Finally, the effect of the mentioned agonists on the expression and localization of β-catenin was examined.
Cell migration was assessed by "wound assay". Treatment with nucleotides showed to stimulate the migration of the calvaria cells.
The proliferation process was studied by using flow cytometry, Neubauer chamber count and Crystal Violet staining. The results obtained attribute positive effects to the extracellular nucleotides. On the other hand, treatment with Lithium caused decreases in the proliferative capacity of the cells. While no changes in proliferation were observed by incubation of the cells in medium with high concentration of extracellular calcium.
The analysis of cell differentiation to an osteoblastic phenotype was carried out by measurements of Alkaline Phosphatase (FAL) enzyme activity, quantification of mRNA of osteoblastic maturation / differentiation markers by QRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction) and detection of mineralization by Alizarin red staining. In this regard, treatment with ATPγS exhibited a pro-osteogenic role, by raising the enzymatic activity of FAL, the gene expression of differentiation markers and the mineralizing capacity. In contrast, the UTP agonist did not induce changes in enzyme activity and, in most cases, repressed the transcription of osteogenic genes.
On the other hand, exposure to lithium increased FAL activity but repressed the expression of osteogenic genes and decreased the mineralization of the cultures.
A high concentration of extracellular calcium showed positive effects at the level of differentiation, increasing the FAL activity and mineralization of osteoblasts.
Finally, the treatment of cultures with extracellular nucleotides in medium containing high calcium concentration showed slight additive / synergistic effects in the stimulation of differentiation into bone-forming cells.
Expression of β-catenin was increased under treatment with extracellular nucleotides, Lithium or Calcium. Also nucleus translocation was increased by these treatments.
According to the results obtained in this work, a regulatory role on osteoblastic physiology can be attributed to the purinergic signaling system and GSK3 / β-catenin.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/3402 |
| Date | 30 March 2017 |
| Creators | Laiuppa, Juan Andrés |
| Contributors | Santillán, Graciela Edith |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 2 |
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