GARANTIZADO, F. E. A. Caracterização da família multigênica da proteína desacopladora de plantas (pUCP) e regulação da expressão gênica sob diferentes condições de estresses abióticos em Vigna unguiculata (L.) Walp. 2012. 152 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-22T20:36:03Z
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Previous issue date: 2012 / The plant uncoupling proteins (pUCP) are located in the inner mitochondrial membrane and facilitate the proton translocation across the intermembrane space into the mitochondrial matrix, deflecting the passage of H + by F1-ATPase activity, thus affecting the efficiency of oxidative phosphorylation, i.e decreasing the synthesis of ATP coupled to the operation of the electron transport chain. Therefore, these proteins are responsible for dissipating the electrochemical gradient of H+, generated by respiration, releasing heat to the environment. These proteins belong to family of carriers Mitochondrial Anion (FCAM) and are encoded by multigene families. Their function is not yet fully elucidated, but the literature suggests involvement in adapting to biotic and abiotic stresses and cell protection by avoiding the production of reactive oxygen species (ROS). Their participation in adaptive thermogenesis is unclear. The aim of this work was to characterize the multigene family of pUCP in Vigna unguiculata (L.) Walp and your regulation through gene expression in response to different abiotic stresses. Vigna unguiculata seeds were germinated on paper imbibed water in the dark. Three days after germination the seedlings were transferred to Hoagland solution for 3 days before application of stress. Roots and leaves were collected at 0, 6, 12 and 24 hours after addition of the respective 100 mM NaCl, 200.67 g / L PEG, 10 mM H2O2 and 5 mM salicylic acid to characterize the profile of multigene family expression of genes for pUCP by semiquantitative RT-PCR and real-time PCR (qPCR). Specific primers were designed based on the sequences of cDNA / gene identified in pUCPs Vigna unguiculata using the PerlPrimer tool. Amplification of cDNA of actin was used to normalize the data for RT-PCR semi-quantitative and three constitutive genes were used to normalize the data of qPCR: 2 to actin gene (actin 4 and 5) and a gene for factor alogament 1-α (EF1α). In silico analysis revealed that in Fabales order pUCP is encoded by at least six pUCPs genes presenting a duplication of the gene type 1 (1a, 1b) and a pUCP6 gene deletion. The multigene family of pUCP, consisting of six genes was then identified in Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 and VuUCP5). The alignment of amino acid and nucleotide sequences of the species of Fabales order including Vigna unguiculata, revealed three xv. conserved sequences called signal Energy Transfer Protein (SPTE), and four domains (or regions or sites) existence of specific true pUCPs in Vigna unguiculata. VuUCP1a gene was constitutively expressed in leaves and roots, contrasting with VuUCP1b, whose expression was modulated in a stress and tissue-dependent manner. The VuUCP1b expression increased in response to all treatments (PEG, NaCl, H2O2 and salicylic acid) in roots, whereas the expression in leaves did not increase in response to NaCl. VuUCP2 expression was inhibited in response to PEG in leaves. VuUCP4 showed constitutive expression in response to stresses in both tissues, while VuUCP3 and VuUCP5 showed induction of expression by various stresses depending on the tissue type. The identification of the multigene family of pUCPs in Vigna unguiculata and its gene expression profile in different tissues and stress conditions highlights a possible role of this protein in the adjustment of plants to environmental stresses. / As proteínas desacopladoras de planta (pUCP) estão localizadas na membrana mitocondrial interna e facilitam o transporte de prótons do espaço intermembranar para a matriz mitocondrial, desviando a passagem de H+ através da F1-ATPase, afetando assim a eficiência da fosforilação oxidativa, isto é, diminuindo a síntese de ATP acoplada ao funcionamento da cadeia transportadora de elétrons. Portanto, essas proteínas são responsáveis pela dissipação do gradiente eletroquímico de H+, gerado pela respiração, liberando calor para o ambiente. Tais proteínas pertencem a Família de Carreadores de Ânions Mitocondriais (FCAM) e são codificadas por famílias multigênicas. Sua função ainda não está completamente elucidada, mas a literatura sugere participação na adaptação a situações de estresses bióticos e abióticos e na proteção da célula evitando a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). Sua participação na termogênese adaptativa é questionável. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a família multigênica da pUCP em Vigna unguiculata (L.) Walp bem como sua regulação através da expressão gênica em resposta a diferentes estresses abióticos. Sementes de Vigna unguiculata foram germinadas em papel umedecido com água, no escuro e após 3 dias as plântulas foram transferidas para solução de Hoagland durante 3 dias antes da aplicação dos estresses. As raizes e as folhas foram coletadas com 0, 6, 12 e 24 horas, após respectivas adições de NaCl 100 mM, PEG 200,67 g/L, H2O2 10 mM e ácido salicílico 5 mM, para caracterizar a família multigênica e o perfil de expressão dos genes da pUCP por RT- PCR semiquantitativa e por PCR em tempo real (qPCR). Primers específicos foram desenhados com base nas sequências de cDNAs/genes de pUCPs identificadas em Vigna unguiculata usando a ferramenta PerlPrimer. A amplificação do cDNA da actina foi usada para a normalização dos dados de RT-PCR semi-quantitativa e três genes constitutivos foram usados na normalização dos dados da qPCR: 2 genes para actina (actinas 4 e 5) e 1 gene para o fator de alogamento 1-α (EF1α). Análise in silico revelou que a pUCP na ordem Fabales é codificada por pelo menos seis genes com duplicação do gene pUCP do tipo 1 (1a e 1b) e deleção do gene pUCP6. A família multigênica da pUCP, constituída de 6 genes, então foi identificada em Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 e VuUCP5 ). O alinhamento de sequências nucleotídicas e de aminoácidos das xiii. espécies da ordem Fabales incluindo as de Vigna unguiculata, revelou 3 sequências conservadas denominadas Sinal Protéico de Transferência de Energia (SPTE), além de 4 domínios específicos que caracterizam existência de pUCPs verdadeiras em Vigna unguiculata. O gene VuUCP1a foi expresso constitutivamente em folhas e raízes, contrastando com VuUCP1b, cuja expressão foi modulada em função dos estresses e de tecidos. Em raízes a expressão do VuUCP1b aumentou em resposta a todos os tratamentos (PEG, NaCl, H2O2 e ácido salicílico) enquanto que em folhas a expressão não aumentou em reposta ao NaCl. VuUCP2 teve a expressão inibida em resposta ao PEG em folhas. VuUCP4 apresentou expressão constitutiva em resposta aos estresses em ambos os tecidos, enquanto que VuUCP3 e VuUCP5 apresentaram indução de expressão por vários estresses dependente do tecido. A identificação da família multigênica das pUCPs em Vigna unguiculata e seu perfil de expressão gênica diferencial, em função do estresse aplicado e do tecido estudado, põe em evidência um possível papel dessa proteína nos mecanismos de ajustamento das plantas aos estresses ambientais.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/10620 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Garantizado, Francisco Edson Alves |
| Contributors | Melo, Dirce Fernandes de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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