Regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen sind essentiell für das Gleichgewicht des intestinalen Immunsystems. Eine Einschränkung ihrer Suppressionsfunktion wird bei Patienten mit Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX)-Syndrom beobachtet und führt im Tiermodell zu lymphoproliferativen Erkrankungen und intestinalen Entzündungen. Von entscheidender Bedeutung für Homöostase und Suppressionsfunktion regulatorischer T-Zellen ist das Signalmolekül Interleukin-2 (IL-2). Im Gegensatz zu Effektor-T-Zellen exprimieren Foxp3+CD4+ T-Zellen den hochaffinen IL-2-Rezeptor αβγ konstitutiv. IL-2 wird von regulatorischen T-Zellen nicht in relevanten Mengen exprimiert. Sie sind somit auf von anderen Zellen sezerniertes IL-2 angewiesen. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass im Tiermodell regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen durch Applikation eines IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex nicht nur in mesenterialen Lymphknoten und Milz, sondern auch lokal in der Lamina propria mucosae des Kolons der Versuchstiere expandiert werden.
Als relevante Quelle von IL-2 in situ könnten aktivierte proliferierende T-Zellen dienen. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Proteinexpression proliferierender Einzelzellen mittels Matrix assisted laser desorption/ionisation-Time of flight-Massenspektrometrie-Imaging (MALDI-Imaging) analysiert. Es gelang die Identifikation präferentiell in lymphoiden Geweben exprimierter Peptidmassen. Obwohl die Einzelzellanalyse mittels MALDI-Imaging prinzipiell möglich erscheint, ist ein Nachweis von Zytokinen wie IL-2 derzeit aufgrund fehlender Sensitivität im Proteinmassebereich zwischen 10kDa und 20kDa nicht möglich.
Die therapeutischen Möglichkeiten der Expansion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen durch stabile IL-2-Rezeptor-Agonisten und die Rolle von IL-2 für die intestinale Immunregulation sollten weiter untersucht werden.:Bibliographische Beschreibung 3
Inhaltsverzeichnis 4
Abkürzungsverzeichnis 7
1. Einleitung 9
1.1. Störung der Barrierefunktion des intestinalen Immunsystems als Ursache chronisch entzündlicher Darmerkrankungen 9
1.2. Foxp3+ regulatorische T-Zellen 10
1.3. Die Rolle von Interleukin-2 für regulatorische T-Zellen 11
1.4. Signaltransduktion in regulatorischen T-Zellen als Grundlage ihrer selektiven Expansion und Induktion 12
1.5. Möglichkeiten der präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen 15
1.5.1. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Agonisten des hochaffinen IL-2-Rezeptors 15
1.5.2. Induktion regulatorischer T-Zellen durch TGF-β 16
1.5.3. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Rapamycin (Sirolimus) 17
1.5.4. Expansion regulatorischer T-Zellen durch UVB-Bestrahlung bzw. Vitamin D-Rezeptor-Agonisten 18
1.5.5. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Histon-Deacetylaseinhibitoren 19
1.6. Suppression von Effektor-T-Zellen durch regulatorische T-Zellen 20
1.6.1. Zellkontaktabhängige Mechanismen 20
1.6.2. Zellkontaktunabhängige Mechanismen 22
1.7. Matrix assisted laser desorption ionisation-Time of flight-Massenspektromie (MALDI-TOF-MS): Bedeutung und Funktion 23
1.8. Zielstellung 25
2. Materialien und Methoden 26
2.1. Versuchstiere 26
2.2. IL-2/IgG2b-Fusionsprotein-Vorexperiment 26
2.2.1. Induktion von 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS)-Kolitis 26
2.2.2. Durchführung des IL-2/IgG2b-Fusionsprotein-Vorexperimentes 26
2.3. Durchführung des IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex-Experiments 27
2.4. Durchflusszytometrie 27
2.5. Histologische Färbungen 28
2.5.1. Probenvorbereitung 28
2.5.2. Hämatoxylin/Eosin (HE) Färbung 29
2.5.3. Immunfluoreszenz-Färbungen 29
2.5.4. Ki67-Schnellfärbung 30
2.5.5. Mikroskopie und Photographie 30
2.6. Histologische Auswertungen 31
2.6.1. Kolitis-Score 31
2.6.2. Bildanalyse 31
2.6.3. Validierung der automatischen Bildanalyse mittels CellProfiler 33
2.7. MALDI-Imaging 35
2.7.1. Probenvorbereitung für MALDI-Imaging 35
2.7.2. Analyse der Peptidexpression in Gewebeschnitten mittels MALDI-Imaging 36
2.8. Statistische Auswertungen 36
2.8.1. Statistische Tests 36
2.8.2. Berechnung der zu erwartenden Zahl von Kontakten zwischen Ki67+ und Foxp3+ Zellen 36
3. Ergebnisse 38
3.1. Design des IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex Experimentes 38
3.2. Mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex behandelte Tiere zeigen Splenomegalie und Lymphadenomegalie 40
3.3. Behandlung mit einem IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in mesenterialen Lymphknoten und Milz 41
3.4. Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt nicht zu Kolitis 43
3.5. Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in der Lamina propria mucosae 45
3.6. IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex steigert die Proliferation regulatorischer T-Zellen in der Lamina propria mucosae und lymphoiden Follikeln des Kolons 47
3.7. Regulatorische T-Zellen sind nach Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex weiter mit proliferierenden Zellen assoziiert. 50
3.8. MALDI-Imaging als Möglichkeit der Proteinexpressionsanalyse in situ 52
3.8.1. Vergleich der Proteinexpression in verschiedenen Geweben von Ileum und Zäkum mit der Expression in Thymus und mesenterialem Lymphknoten 55
3.8.2. MALDI-Imaging nach Schnellfärbung Ki67+ Zellen mit Streptavidin 63
3.8.3. Analyse der Massenspektren von Einzelzellen mittels MALDI-Imaging 66
4. Diskussion 68
4.1. Applikation von IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex hat keine fatalen Nebenwirkungen 68
4.2. IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in mesenterialen Lymphknoten, Milz und Kolon 70
4.3. IL-10 als wichtiger Vermittler der Suppressionsaktivität durch IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex expandierter regulatorischer T-Zellen 71
4.4. Expansion regulatorischer T-Zellen beim Menschen: Voraussetzungen und Chancen 72
4.5. Regulatorische T-Zellen akkumulieren an proliferierenden Zellen 73
4.6. Nachweis spezifischer Massen in Gewebe und Einzelzellen mittels MALDI-Imaging 74
5. Zusammenfassung 80
Literaturverzeichnis 83
Publikationen 90
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 97
Lebenslauf 98
Danksagungen 99
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:11455 |
| Date | 15 February 2012 |
| Creators | Klein, Emanuela |
| Contributors | Uhlig, Holm H., anonym, anonym, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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