DNA repair and gene expression are two major cellular processes that are fundamental for the maintenance of biological life. Both processes require the enzymatic activity of the super family 2 helicase XBP, which is an integral subunit of the general transcription factor TFIIH. During transcription initiation, XPB catalyzes the initial melting of promoter DNA enabling RNA polymerase II to engage with the coding DNA strand and start gene transcription. In nucleotide excision repair, XPB acts in concert with the other TFIIH helicase XPD causing strand separation around a lesion site. Mutations within the genes encoding XPB or other TFIIH subunits are associated with different cancer types as well as with the autosomal recessive disorders Xeroderma Pigmentosum and trichothiodystrophy and rarely combined features of Xeroderma Pigmentosum and Cockayne syndrome.
In the last few years, great progress has been made towards unraveling the structure of TFIIH and its individual subunits including XPB. These structural insights tremendously improved our understandings with respect to the molecular interactions within this intriguing protein complex. However, the underlying regulation mechanisms that functionally control XPB during transcription and repair remained largely elusive. We thus executed the biochemical characterization of this protein to investigate the functional network that regulates XPB within the scaffold of TFIIH. Due to their enhanced stability compared to the human proteins, we utilized the proteins that originate from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum for this purpose as a model organism for eukaryotic TFIIH.
The present work provides novel insights into the enzymatic function and regulation of XPB. We could show that both, DNA and the TFIIH subunit p52 stimulate XPB’s ATPase activity and that the p52-mediated activity is further boosted by p8, another subunit within TFIIH. Surprisingly, DNA can activate XPB’s ATPase activity to a greater extent than its TFIIH interaction partners p52/p8, but when both, i.e. p52/p8 and DNA are present at the same time, p52 dominates the activation and the enzymatic speed is maintained at the level observed through the sole activation of p52/p8. We thus defined p52 as the master regulator of XPB that simultaneously activates and represses XPB’s enzymatic activity. Based on a correlative mutagenesis study of the main interface between p52 and XPB that was set into context with recent structural data, a model for the p52-mediated activation and speed limitation of XPB’s ATPase was proposed. The research on XPB’s ATPase was expanded with the investigation of the inhibition mechanism of XPB’s ATPase via the natural compound Triptolide. Furthermore, we investigated XPB’s DNA translocase function and could observe that XPB can only perform its translocase movement when it is fully incorporated into core TFIIH and this translocase movement is further enhanced by the nucleotide excision repair factor XPA. Fluorescence polarization measurements with nucleotide analogues revealed that XPB displays the highest affinity towards DNA in the ADP + Pi bound state and its binding is weakened when ADP is bound or the nucleotide is dissociated from the enzyme, suggesting a movement on the DNA during the distinct states of the ATPase cycle. Finally, the well-known and highly conserved RED motif was found to be the crucial element in XPB to enable this translocase movement. Combined, the data presented in this work provide novel insights into the intricate regulation network that controls XPB’s enzymatic activity within TFIIH and furthermore show that XPB’s enzymatic activity is tightly controlled by various factors. / DNA Reparatur und Genexpression sind zwei fundamentale zelluläre Prozesse die unabdingbar für die Aufrechterhaltung des biologischen Lebens sind. Beide Prozesse benötigen die Enzymaktivität der Superfamilie 2 Helikase XPB, welche eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors TFIIH darstellt. Während der Transkriptions-Initiation katalysiert XPB das initiale Aufschmelzen der Promoter-DNA und befähigt dadurch die
RNA-Polymerase II dazu an den codierenden DNA Strang zu binden und die Genexpression zu starten. In der Nukleotid-Exzisions-Reparatur agiert XPB zusammen mit der zweiten TFIIH Helikase, XPD, und bewirkt die Öffnung des DNA Stranges an der Stelle des DNA-Schadens. Mutationen des XPB-Gens oder der Gene der anderen TFIIH
Untereinheiten sind mit verschiedenen Krebsarten, sowie den autosomal rezessiv vererbten Krankheiten Xeroderma Pigmentosum und Trichothiodystrophie assoziiert. In seltenen Fällen kann eine kombinierte Form von Xeroderma Pigmentosum und Cockayne Syndrom auftreten.
In den letzten Jahren wurde mittels der Cryo-EM die Strukturaufklärung von TFIIH und seinen Untereinheiten einschließlich XPB signifikant vorangebracht. Diese neuen
strukturellen Einsichten haben unser Verständnis über den molekularen Aufbau des TFIIH Komplexes entscheidend verbessert. Jedoch sind die Regulationsmechanismen, die XPB auf funktionaler Ebene kontrollieren, noch größtenteils unbekannt. Um das funktionelle Netzwerk, das XPB innerhalb von TFIIH reguliert, zu erforschen, haben wir die biochemische Charakterisierung von XPB verfolgt. Aufgrund ihrer erhöhten Stabilität gegenüber den humanen Proteinen wurden für diese Analyse die Proteine des
thermophilen Pilzes Chaetomium thermophilum als Modellorganismus für TFIIH verwendet.
Die vorgelegte Arbeit liefert neue Erkenntnisse über die enzymatische Funktion und Regulation von XPB. Wir konnten zeigen, dass sowohl DNA, als auch die TFIIH
Untereinheit p52 die ATPase Aktivität von XPB stimulieren und dass die p52-vermittelte Aktivierung durch p8, eine weitere Untereinheit von TFIIH, noch weiter verstärkt wird. In Gegenwart von DNA beobachtet man jedoch die höchste ATPase Aktivität. Wenn beide Aktivatoren, also p52/p8 und DNA, gleichzeitig anwesend waren, dominierte die niedrige p52-vermittelte Aktivierung gegenüber der DNA-vermittelten Aktivierung. Das p52-Protein agiert also als Aktivator und Deaktivator indem es die enzymatische Aktivität des XPB-Proteins gleichzeitig aktiviert und hemmt und kann damit folglich als Hauptregulator von XPB bezeichnet werden. Basierend auf einer korrelativen Mutagenese-Analyse der Interaktionsfläche zwischen p52 und XPB sowie auf den aktuellsten Strukturdaten, wurde ein Modell für die p52-vermittelte Aktivierung und Geschwindigkeitsregulierung von XPBs ATPase generiert. Des Weiteren wurde der Einfluss des Naturproduktes Triptolid auf die Hemmung der enzymatischen Aktivität des XPB Proteins untersucht. Darüber hinaus haben wir die doppelsträngige DNA-Translokase-Aktivität von XPB
analysiert und konnten feststellen, dass die Translokation nur erfolgen kann, wenn XPB vollständig in den Kern-TFIIH-Komplex integriert ist. Der Nukleotid-Exzisions-Reparatur-
Faktor XPA stimulierte diese Translokase-Aktivität zusätzlich. Fluoreszenz-Polarisations-Messungen mit Nukleotid-Analoga zeigten, dass XPB die höchste Affinität
für DNA im ADP + Pi gebundenen Zustand aufweist und dass diese Bindung gelockert wird, wenn ADP gebunden oder das Nukleotid dissoziiert ist. Dies deutet auf einen
Bewegungsmechanismus auf der DNA während der verschiedenen Stadien des ATPase-Zyklus hin. Abschließend konnten wir zeigen, dass das hochkonservierte RED-Motiv eine entscheidende Rolle für die Translokase Bewegung des XPB-Proteins einnimmt. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit neue Erkenntnisse, die unser Verständnis des Regulierungsnetzwerkes, das die enzymatische Aktivität von XPB innerhalb von TFIIH steuert, entscheidend vorangebracht haben.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:24409 |
| Date | January 2024 |
| Creators | Kappenberger, Jeannette Sarah |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0031 seconds