Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T17:19:01Z
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2010_AlliceRodriguesFerreira.pdf: 493312 bytes, checksum: 38d77029716a151f89050eea62646bad (MD5) / O cultivo in vitro de embriões afeta mecanismos epigenéticos envolvidos no controle da expressão de genes relacionados ao desenvolvimento embrionário e inativação do cromossomo X. Fêmeas de mamíferos têm dois cromossomos X, e machos somente um. Isto levou à criação de um mecanismo evolutivo de compensação de dose, chamado inativação do cromossomo X. Durante a embriogênese, um dos dois cromossomos X é aleatoriamente inativado em cada célula da massa celular interna, e preferencialmente o paterno no trofoblasto. O objetivo deste estudo foi estabelecer o padrão de inativação do cromossomo X, avaliando a expressão alelo específica do gene MAO-A (monoamina oxidase tipo A) em embriões bovinos produzidos in vitro nos estádios de quatro células, oito a dezesseis células, mórula, blastocisto e blastocisto expandido. Um total de 100 embriões foi produzido in vitro (PIV), utilizando ovócitos aspirados de nove novilhas da raça Nelore homozigotas para o alelo A, inseminados com sêmen de um touro Holandês homozigoto para o alelo G sexado para fêmea, previamente genotipados para o gene MAO-A. Dois pools com 10 embriões cada, dos estágios de 4 células, 8-16 células, mórula, blastocisto e blastocisto expandido foram coletados. Esses pools de embriões foram congelados a -80°C para posterior extração de RNA total. Um pool de 15 ovócitos maturados e 5 palhetas de espermatozóides foi utilizado para extração de RNA. Para a fenotipagem do gene MAO-A nos pools de embriões foi utilizada a técnica de RT-PCR-RFLP. Para isso foram desenhados dois pares de primers flanqueando uma região específica do gene (GenBank accession number NM_181014.2) com um polimorfismo, permitindo assim a detecção da expressão alelo específica (Bos taurus taurus X Bos taurus indicus), ou seja, permitindo detectar qual alelo, se paternal ou maternal estava sendo expresso. Um produto de amplificação foi gerado por RT-PCR com os primers externos de cada pool de embriões de cada estágio de desenvolvimento e purificado. xv Posteriormente, os fragmentos foram sequenciados pela metodologia de dideoxy em um sequenciador ABI 3130xl (Applied Biosystem) usando os primers internos foward. O RNA total extraído das células espermáticas e ovócitos maturados foram utilizados para a detecção da presença do RNA mensageiro do gene MAO-A por RT-PCR. Os resultados mostraram que ambos os alelos estão expressos em embriões de 4-células, 8-16-células, blastocisto e blastocisto expandido, com a expressão do X paterno desaparecendo em mórula. Pode-se especular que ambos os cromossomos X estão ativos nos dois estádios iniciais, sendo inativados posteriormente e reativados em blastocisto. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Embryo culture system may affect epigenetic mechanisms involved in controlling gene expression related to embryo development and X chromosome inactivation. Female mammal has two X chromosomes, and male only one. This led to the creation of an evolutionary mechanism of dosage compensation, called X chromosome inactivation. During embryogenesis, one of two X chromosomes is randomly inactivated in each cell of the inner cell mass, and preferably the paternal chromosome in trophoblast cells. The objective of this study was to characterize the allele-specific expression of the Monoamine Oxidase type A (MAO-A) X-linked gene, during preimplantational development of bovine embryos produced in vitro. One hundred in vitro embryos were produced using oocytes aspirated from nine heifers, homozygous for the MAO-A A allele, which were inseminated using X-semen sexed from a Holstein bull homozygous for the G allele. Two pools of 10 embryos each of 4 cell, 8- 16 cell, morula, blastocyst and expanded blastocyst stages were collected. Embryos were frozen at -80 °C until total RNA extraction. Total RNA from sperm and oocytos were also isolated. For phenotyping of the MAO-A gene in the pools of embryos the RT-PCR-RFLP technique was used. Two pairs of primers, flanking a specific region of the gene (GenBank accession number NM_181014.2) carrying a single nucleotide polymorphism, were designed. Thus, the allele-specific expression was detected, identifying paternal and maternal MAO-A mRNA. Amplicons of each pool of embryos were produced by using RT-PCR, and they were sequenced by the dideoxy method using an ABI 3130 xl sequencer (Applied Biosystem). Total RNA isolated from sperm cells was used to detect MAO-A mRNA by using RT-PCR. Results showed the presence of mRNA from both alleles in 4-cell, 8-16-cell, blastocyst and expanded blastocyst embryos, and only from the maternal allele in morula. We can speculate xvii that both X chromosomes are active in the two earliest stages, being inactivated and subsequently reactivated in blastocyst.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/7432 |
| Date | 15 December 2010 |
| Creators | Ferreira, Allice Rodrigues |
| Contributors | Franco, Maurício Machaim |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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