Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-19T16:54:13Z No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-12-02T14:03:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-02T14:03:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JanicedeMirandaVasconcelosVilela.pdf: 3616352 bytes, checksum: 9412786c69d298726d117345dce621af (MD5) / O objetivo deste trabalho foi testar a viabilidade de utilização das técnicas de cultivo in vitro, cultivo em membrana corioalantoica de embriões de galinha (CAM) e autotransplante heterotópico para avaliação da do tecido ovariano de gatas. Na primeira etapa, foi comparado o cultivo de tecido ovariano fresco de gatas in vitro e em CAM para determinar se estes métodos seriam adequados para avaliar a eficácia da criopreservação de tecido ovariano. Para isso, ovários de 8 gatas foram cortados em cubos de 3 mm3, cultivados in vitro e em CAM por até 5 dias. A porcentagem de folículos primordiais na população de folículos morfologicamente normais (FMN) foi sempre maior que 80%, com exceção do dia 3 de cultivo em CAM. Não foi observado proliferação celular ao longo do cultivo. Adicionalmente, ambos os métodos mostraram um aumento do tecido conjuntivo a cada dia que o tecido permaneceu em cultivo. Foi observado vascularização durante o cultivo em CAM, porém sem associação com a viabilidade folicular. Nenhum dos sistemas foi capaz de promover crescimento e/ou desenvolvimento folicular. O autotransplante heterotópico já se mostrou eficiente em tecido ovariano fresco de gatas, por isso, na segunda etapa do experimento, este método foi utilizado para avaliar o protocolo de criopreservação de tecido ovariano felino. Quatro gatas foram submetidas a ovariohisterectomia e os ovários foram cortados e criopreservados. Após uma semana, foram autotransplantados para o tecido subcutâneo da região dorsal do pescoço e retirados após 7, 14, 28, 49 e 63 dias. A porcentagem de folículos morfologicamente normais primordiais e em crescimento nas amostras de tecido fresco (Grupo Controle) foram de 87,8% e 96,7%, respectivamente, e imediatamente após o descongelamento (Controle Crio) de 73,7% e 100%, respectivamente, e não foram significativamente diferentes entre si. Folículos em crescimento quase não foram vistos após o transplante. Nenhum FMN foi encontrado a partir de 49 dias de transplante. Nos fragmentos de Controle e Controle Crio, a maioria dos folículos (primordiais e em crescimento) apresentavam proliferação das células da granulosa. Dois folículos antrais foram encontrados aos 28 dias em uma das gatas e se mostraram vivos e proliferativos. Houve um aumento das fibras colágenas a partir dos 7 dias de transplante. A vascularização do tecido foi observada após 7 dias de transplante, e vasos sanguíneos calibrosos foram facilmente observados nos dias 49 e 63 após transplante. Houve uma grande perda folicular após o transplante de tecido ovariano de gatas previamente criopreservado. Em conclusão, o cultivo em CAM não parece promissor para tecido ovariano de felinos, mas o cultivo in vitro pode ser otimizado para melhor desenvolvimento dos folículos ovarianos de gatas e para avaliação do tecido após criopreservação. Os transplantes permanecem como a alternativa mais viável para avaliar a criopreservação. No entanto, o presente estudo mostrou que a sobrevivência folicular após criopreservação e transplante foi muito baixa, provavelmente devido à junção das injúrias causadas pela criopreservação com os danos provocados pelo período de isquemia-reperfusão do tecido nos primeiros dias de transplante. Desta forma, as técnicas de transplante e de criopreservação também devem ser otimizadas. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study was to test the viability of in vitro culture (IVC), culture in the chorioallantoic membrane of chick embryos (CAM) and heterotopic autotransplantation techniques for evaluation of cat ovarian tissue. In the first stage, we compared the culture of fresh cat ovarian tissue in vitro and in CAM to determine if those methods would be suitable to evaluate the efficacy of cryopreservation of ovarian tissue. For this, ovaries from 8 queens were cut in 3 mm³ cubes, and cultured in vitro and in CAM for up to 5 days. The percentage of primordial follicles in the population of morphologically normal follicles (MNF) was always higher than 80%, with the exception of day 3 in the CAM. Cellular proliferation was not observed in culture. Additionally, both methods showed an increase in connective tissue during culture. Vascularization was observed during culture in CAM, however, there was no association with follicular viability. None of the systems were capable of promoting follicular growth and/or development. Heterotopic autotransplantation has already been demonstrated to be effective for fresh cat ovarian tissue, thus, in the second stage of this study, this method was used to evaluate ovarian tissue cryopreservation. Four queens were subjected to ovariohysterectomy and the ovaries were cut and cryopreserved. After one week, they were thawed and autografted to the subcutaneous tissue of the dorsal neck region and removed after 7, 14, 28, 49 and 63 days. The percentage of primordial and growing MNF in fresh tissue samples (Control) were 87.8% and 96.7%, respectively, and immediately after thawing (Cryo Control) were 73.7% and 96.7%, respectively, and they were not significantly different. Growing follicles were hardly seen after grafting. No MNF were found after 49 days of transplantation. In Control and Cryo Control fragments, most of the follicles (primordial and growing) presented granulosa cell proliferation. Two antral follicles were found on day 28 post-transplantation in one of the queens and they were alive and proliferative. There was an increase in connective fibers from day 7 of transplantation on. Vascularization of the tissue was observed after 7 days of grafting and calibrous blood vessels were easily observed in days 49 and 63 post-grafting. There was a great follicular loss after cryopreserved ovarian tissue transplantation. In conclusion, culture in CAM does not seem promising for cat ovarian tissue, but IVC may be optimized for better cat follicle development and evaluation of the tissue after cryopreservation. Transplantation remains the most viable alternative to evaluate cryopreservation. However, this study showed that follicular survival after cryopreservation and grafting was low, probably due to the combination of injuries caused by cryopreservation with the damages caused by ischemia-reperfusion period in the early days of the tissue transplant. Thus, the techniques of cryopreservation and transplantation must also be optimized.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-16T13:56:17Z No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-23T22:07:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T22:07:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) Previous issue date: 2007-06 / Com o aprimoramento das técnicas de reprodução assistida, a produção de embriões in vivo (TE) e in vitro (PIV), tem crescido consideravelmente e por conseqüência, a demanda por metodologia eficaz de identificação do sexo desses embriões. Este trabalho teve por objetivo avaliar um sistema de identificação do sexo (Diagnóstico pré-implantacional do sexo) de embriões bovinos produzidos em programas comerciais de TE e PIV. Os embriões produzidos in vivo (n=609) foram coletados de animais das raças Holandesa e Jersey, sete dias (D7) após a Inseminação Artificial (IA) nos estágios de mórula compacta (Mc), blastocisto inicial (Bi), blastocisto (Bl) e blastocisto expandido (Bx). Os embriões foram divididos em dois grupos: Grupo TE-B, constituído por embriões biopsiados e Grupo TE-C, constituído por embriões intactos (controle). Para o experimento de produção in vitro, foram utilizados embriões de bovinos da raça Gir (n=318), nos estágios de blastocisto inicial Bi, Bl e Bx, em D-6,5. Os embriões foram divididos em dois grupos: Grupo PIV-B, constituído por embriões biopsiados e Grupo PIV-C, constituído por embriões intactos (controle). Os embriões dos Grupos TE-B (n=380) e PIV-B (n=91) foram submetidos à micromanipulação por microssecção para retirada da biopsia. Os embriões biopsiados foram cultivados até o final do processo de identificação do sexo e então transferidos para receptoras síncronas. Os embriões do Grupo TE-C (n=229) e PIV-C (n=227) foram transferidos íntegros para receptoras síncronas no mesmo momento dos biopsiados. As receptoras foram submetidas à ultra-sonografia aos 30 (TE) e 60 (TE e PIV) dias após as inovulações para diagnóstico de gestação e confirmação do sexo, respectivamente. Para a identificação do sexo dos embriões biopsiados, as respectivas biopsias foram submetidas às técnicas de PCR e eletroforese em gel de agarose. Na reação, foram utilizados 2 pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers), sendo um específico para o cromossomo Y e o outro para um gene autossômico (controle da reação que amplifica uma seqüência de DNA específica em ambos os sexos). Para a comparação das taxas de gestação aos 60 dias, entre os grupos e respectivos controles, foi utilizado o teste do quiquadrado (χ2) e não houve diferenças entre os grupos, com TE-B =206/380 (54,21%), TE-C = 128/229 (55,89%); PIV-B =24/91 (26,37%) e PIV-C=45/227 (19,82%). Das gestações confirmadas que tiveram suas respectivas biopsias submetidas à sexagem, 133 do Grupo TE-B, e 20 do Grupo PIV-B, foram avaliadas por ultra-sonografia aos 60 dias após as inovulações sendo que 124 (93,23%) e 19 (95%), respectivamente, tiveram sexo coincidente com aquele atestado pela PCR. O resultado deste trabalho indicou que o procedimento de retirada de biopsia de embriões produzidos in vivo e in vitro não interfere na viabilidade dos mesmos, e que a metodologia utilizada é viável para identificação do sexo dos embriões em programas comerciais de transferência de embriões. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / With the advance of the assisted reproductive techniques, the use of in vivo (ET) and in vitro embryo production (IVP) has increased considerable, which has lead to a demand for an efficient method for embryo sexing. The present study aimed to evaluate the effect of the micromanipulation of ET and IVP embryos on their viability and to test, in field conditions, a methodology embryo sexing. In vivo produced embryos (n=609) were collected from Holstein and Jersey females. Embryo at compact morula (Mc), initial blastocyst (Bi), blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx) stage on Day 7 post insemination (D-7) were allocated into two groups: Group ET-B, biopsied embryos and Group ET-C, intact embryos (control). For the in vitro production experiment embryos of Gir breed females were used (n=318) at the initial blastocyst (Bi), blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx) stage at Day 6,5 post insemination. Embryos were distributed into two groups: Group IVP-B, biopsied embryos and Group IVP-C, intact embryos (control). Embryos from both groups ET-B (n=380) and IVP-B (n=91) were submitted to micromanipulation by section, for biopsy removal. Biopsied embryos were cultured until the end of the process of sex identification and then were transferred for synchronized recipients. Embryos from the groups ET-C (n=229) and IVP-C (n=227) were transferred intact to the synchronized recipients. All the recipients were evaluated by ultrasonography 30 (ET) and 60 (ET, IVP) days after inovulation, for pregnancy and sex identification. For embryo sex identification the biopsies were submitted to PCR and agarose gel electrophoresis. In the PCR reaction 2 primers were used, one specific for Y chromosome and the other for a bovine autossomic gene. To compare pregnancy rates at 60 days between the groups and their respective controls a Chi-square(χ2) analysis was used. No differences were observed for pregnancy rates between groups, being ET-B = 206/380 (54.21%), ET-C = 128/229 (55.89%); IVP-B = 24/91 (26.37%) and IVP-C = 45/227 (19.82%). Of the confirmed pregnancies that had their biopsies (ET-B = 133 and IVP-B = 20) submitted to sex identification, 124 (93.23%) and 19 (95%) had the same sex in the PCR reaction and in the ultrasonography evaluation at 60 days. The results of the present study indicated that biopsy removal did not affect the viability of the in vivo and in vitro embryos. In addition, the methodology used for embryo sex identification is suitable to be used in embryo transfer commercial programs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T17:19:01Z No. of bitstreams: 1 2010_AlliceRodriguesFerreira.pdf: 493312 bytes, checksum: 38d77029716a151f89050eea62646bad (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T17:19:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AlliceRodriguesFerreira.pdf: 493312 bytes, checksum: 38d77029716a151f89050eea62646bad (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T17:19:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AlliceRodriguesFerreira.pdf: 493312 bytes, checksum: 38d77029716a151f89050eea62646bad (MD5) / O cultivo in vitro de embriões afeta mecanismos epigenéticos envolvidos no controle da expressão de genes relacionados ao desenvolvimento embrionário e inativação do cromossomo X. Fêmeas de mamíferos têm dois cromossomos X, e machos somente um. Isto levou à criação de um mecanismo evolutivo de compensação de dose, chamado inativação do cromossomo X. Durante a embriogênese, um dos dois cromossomos X é aleatoriamente inativado em cada célula da massa celular interna, e preferencialmente o paterno no trofoblasto. O objetivo deste estudo foi estabelecer o padrão de inativação do cromossomo X, avaliando a expressão alelo específica do gene MAO-A (monoamina oxidase tipo A) em embriões bovinos produzidos in vitro nos estádios de quatro células, oito a dezesseis células, mórula, blastocisto e blastocisto expandido. Um total de 100 embriões foi produzido in vitro (PIV), utilizando ovócitos aspirados de nove novilhas da raça Nelore homozigotas para o alelo A, inseminados com sêmen de um touro Holandês homozigoto para o alelo G sexado para fêmea, previamente genotipados para o gene MAO-A. Dois pools com 10 embriões cada, dos estágios de 4 células, 8-16 células, mórula, blastocisto e blastocisto expandido foram coletados. Esses pools de embriões foram congelados a -80°C para posterior extração de RNA total. Um pool de 15 ovócitos maturados e 5 palhetas de espermatozóides foi utilizado para extração de RNA. Para a fenotipagem do gene MAO-A nos pools de embriões foi utilizada a técnica de RT-PCR-RFLP. Para isso foram desenhados dois pares de primers flanqueando uma região específica do gene (GenBank accession number NM_181014.2) com um polimorfismo, permitindo assim a detecção da expressão alelo específica (Bos taurus taurus X Bos taurus indicus), ou seja, permitindo detectar qual alelo, se paternal ou maternal estava sendo expresso. Um produto de amplificação foi gerado por RT-PCR com os primers externos de cada pool de embriões de cada estágio de desenvolvimento e purificado. xv Posteriormente, os fragmentos foram sequenciados pela metodologia de dideoxy em um sequenciador ABI 3130xl (Applied Biosystem) usando os primers internos foward. O RNA total extraído das células espermáticas e ovócitos maturados foram utilizados para a detecção da presença do RNA mensageiro do gene MAO-A por RT-PCR. Os resultados mostraram que ambos os alelos estão expressos em embriões de 4-células, 8-16-células, blastocisto e blastocisto expandido, com a expressão do X paterno desaparecendo em mórula. Pode-se especular que ambos os cromossomos X estão ativos nos dois estádios iniciais, sendo inativados posteriormente e reativados em blastocisto. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Embryo culture system may affect epigenetic mechanisms involved in controlling gene expression related to embryo development and X chromosome inactivation. Female mammal has two X chromosomes, and male only one. This led to the creation of an evolutionary mechanism of dosage compensation, called X chromosome inactivation. During embryogenesis, one of two X chromosomes is randomly inactivated in each cell of the inner cell mass, and preferably the paternal chromosome in trophoblast cells. The objective of this study was to characterize the allele-specific expression of the Monoamine Oxidase type A (MAO-A) X-linked gene, during preimplantational development of bovine embryos produced in vitro. One hundred in vitro embryos were produced using oocytes aspirated from nine heifers, homozygous for the MAO-A A allele, which were inseminated using X-semen sexed from a Holstein bull homozygous for the G allele. Two pools of 10 embryos each of 4 cell, 8- 16 cell, morula, blastocyst and expanded blastocyst stages were collected. Embryos were frozen at -80 °C until total RNA extraction. Total RNA from sperm and oocytos were also isolated. For phenotyping of the MAO-A gene in the pools of embryos the RT-PCR-RFLP technique was used. Two pairs of primers, flanking a specific region of the gene (GenBank accession number NM_181014.2) carrying a single nucleotide polymorphism, were designed. Thus, the allele-specific expression was detected, identifying paternal and maternal MAO-A mRNA. Amplicons of each pool of embryos were produced by using RT-PCR, and they were sequenced by the dideoxy method using an ABI 3130 xl sequencer (Applied Biosystem). Total RNA isolated from sperm cells was used to detect MAO-A mRNA by using RT-PCR. Results showed the presence of mRNA from both alleles in 4-cell, 8-16-cell, blastocyst and expanded blastocyst embryos, and only from the maternal allele in morula. We can speculate xvii that both X chromosomes are active in the two earliest stages, being inactivated and subsequently reactivated in blastocyst.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2016-04-27T12:15:35Z No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-27T14:25:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T14:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Um dos fatores mais limitantes da produção in vitro de embriões (PIVE) é a criopreservação, pois além dos embriões serem mais sensíveis ao frio eles suportam melhor a vitrificação do que o congelamento lento. Mas a vitrificação requer a presença de um técnico especializado para a manipulação embrionária enquanto que o congelamento lento permite a transferência direta. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da substituição do SFB por BSA durante a maturação e cultivo embrionário na resposta à criopreservação utilizando o congelamento lento. Os CCOs obtidos de ovários de abatedouro foram distribuídos em 2 grupos: 1) controle: CCOs maturados e cultivados em meios suplementados com SFB, 2) CCOs maturados e cultivados em meios suplementados com BSA. Em D7 os embriões de cada grupo foram distribuídos em dois tratamentos, fresco e congelado. O experimento 1 avaliou o efeito da fonte proteica na PIVE e a resposta à criopreservação. Após o descongelamento os embriões foram avaliados às 24h e 48h quanto à expansão e eclosão. No experimento 2 foi quantificada a expressão dos genes KRT8, PLAC8, FOSL1, HSP1A1 e HSPA5 por qPCR e quanto ao número total de células e células apoptóticas. Os dados referentes ao desenvolvimento embrionário e taxa de células apoptóticas foram realizados pelo teste χ2 e número de células pela ANOVA e teste de Tukey. A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre os grupos, entretanto a taxa de blastocisto foi maior (P< 0,05) no grupo 1 (42,8±10,1%) do que no grupo 2 (27,9±8,5%). Às 24 horas pós-descongelamento o grupo SFB Fresco apresentou maior taxa de eclosão (P< 0,05) do que os demais. Entretanto, as 48 horas, a taxa de eclosão foi semelhante (P>0,05) entre os grupos SFB Controle (68,1±23.3%) e BSA Controle (70.0±31.0%) e SFB Congelado (39.2±27.1) e BSA Congelado (38,2±23,9). Não houve diferença (P>0.05) entre os grupos Frescos, e entre os grupos congelados quanto ao número total de células. A percentagem de células apoptóticas foi maior no grupo BSA Congelado do que grupo SFB Fresco, não diferindo (P< 0,05) dos demais grupos. A expressão do gene KRT8 foi maior (P< 0,05) no grupo SFB Congelado do que no BSA Congelado, mas foi semelhante (P>0.05) entre Congelados e Frescos dentro de cada grupo. O gene PLAC8 foi mais expresso no grupo BSA Fresco do que no grupo SFB Congelado (P< 0,05). Pode-se concluir que o uso de BSA em substituição ao SFB causou uma redução na produção de embriões, mas teve resposta semelhante na criopreservação. A expressão diferencial dos genes KRT8 e PLAC8 sugere que os embriões cultivados em BSA são de qualidade superior. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / One of the most limiting factors in vitro embryos (IVP) is cryopreservation, because besides the embryos are more sensitive to cold they support better vitrification than slow freezing. But vitrification requires the presence of a technical expert for embryo manipulation while slow freezing allows direct transfer. The objective of this study was to evaluate the effect of replacing SFB by BSA during maturation and embryo culture in response to cryopreservation using slow freezing. The COCs obtained from slaughterhouse ovaries were divided into 2 groups: 1) control: COCs matured and grown in media supplemented with SFB, 2) COCs matured and grown in media supplemented with BSA. D7 in the embryos of each group were divided into two treatments, fresh and frozen. Experiment 1 evaluated the effect of protein source in IVP and response to cryopreservation. After thawing the embryos were evaluated at 24 and 48 hours as the expansion and hatching. In experiment 2 was quantified the expression of genes KRT8, PLAC8, FOSL1, HSP1A1 and HSPA5 by qPCR and for the total number of cells and apoptotic cells. The χ2 test and the number of cells performed the data relating to embryonic development and cell apoptotic rate by ANOVA and Tukey test. Cleavage rate was similar (P> 0.05) between groups, however blastocyst rate was higher (P <0.05) in group 1 (42.8 ± 10.1%) than in group 2 (27.9 ± 8.5%). At 24 hours post-thaw SFB group Fresh showed the highest hatching rate (P <0.05) than the others. However, the 48 hours, the hatching rate was similar (P> 0.05) between SFB Control groups (68.1 ± 23.3%) and BSA control (70.0 ± 31.0%) and Frozen SFB (39.2 ± 27.1) and BSA Frozen (38.2 ± 23.9). There was no difference (P> 0.05) between groups Fresh, frozen and between groups regarding the total number of cells. The percentage of apoptotic cells was higher in the Frozen BSA group than group SFB Fresh, did not differ (P <0.05) from the other groups. The KRT8 gene expression was higher (P <0.05) in Frozen FBS group than in BSA Frozen, but was similar (P> 0.05) between frozen and fresh within each group. The PLAC8 gene was more expressed in the BSA Fresh group than in the Frozen SFB group (P <0.05). It can be concluded that the use of BSA replacing FBS caused a reduction in embryo production, but had similar response in cryopreservation. The differential expression of KRT8 and PLAC8 genes suggests that embryos cultured in BSA are top quality.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-17T10:25:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1092571 bytes, checksum: 58c49be4dd74df0158635ae605d33d22 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-17T10:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1092571 bytes, checksum: 58c49be4dd74df0158635ae605d33d22 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho foi realizado com o objetivo de comparar os efeitos de diferentes crioprotetores e aditivos na criopreservação do sêmen equino sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento. Para tanto, foram designados dois experimentos (E). No E1 objetivou-se comparar o efeito do glicerol (GLIC) e da dimetilformamida (DMFA), associados ou não, sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento, o que conferiu quatro grupos experimentais: glicerol a 5 % (GLIC), dimetilformamida a 5 % (DMFA), dimetilformamida a 3% associada ao glicerol a 2 % (DG) e o tratamento controle, composto pelo diluente comercial Botu-Crio® (BC). Já no E2 objetivou-se avaliar o efeito do congelamento de sêmen de garanhões em diluente contendo glicerol e/ou dimetilformamida, associados à antocianina (ATC) e/ou colesterol carreado por ciclodextrina (CCC). Para tanto, os ejaculados foram congelados em dez diferentes tratamentos, de acordo com as associações entre crioprotetores e aditivos. As amostras de ambos os experimentos foram avaliadas mediante teste de termo-resistência (TTR) e por meio de citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial, produção de peróxido de hidrogênio intracelular e peroxidação lipídica da membrana plasmática; a avaliação quanto à organização da bicamada lipídica só foi realizada no E1. Os melhores resultados obtidos no TTR do E1 foram referentes aos tratamentos DMFA e DG (p<0,05), que mantiveram as maiores médias de motilidade espermática total após trinta minutos de incubação a 37 oC. O potencial mitocondrial não sofreu alteração frente aos tratamentos aplicados (p>0,05). A maior proporção de células com integridade de membrana plasmática e acrossomal foi observada nos tratamentos DMFA e BC (p<0,05). A análise de organização de membrana revelou maior desorganização no tratamento GLIC (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio no tratamento DMFA e menor proporção no tratamento GLIC (p<0,05). Quanto à peroxidação da bicamada lipídica, não foram observadas diferenças entre os valores médios nos tratamentos (p>0,05). Em relação ao E2, não houveram interações entre crioprotetores e diluentes para maioria das características estudadas, sendo as comparações realizadas entre grupos de tratamentos. Entre os crioprotetores, o grupo DMFA apresentou os melhores resultados quanto à motilidade espermática durante o TTR, seguido do grupo DG (p<0,05) e dentre os aditivos os grupos CCC e AC foram superiores aos demais (p<0,05). Em relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, os grupos BC e GLIC apresentaram os piores resultados dentre os crioprotetores, assim como os grupos BC e ATC dentre os aditivos (p<0,05). As maiores médias obtidas quanto ao potencial mitocondrial foram referentes aos grupos DMFA e DG entre os crioprotetores, e CCC e AC entre os aditivos (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio nos grupos DMFA e DG dentre os crioprotetores, e nos grupos CCC e AC dentre os aditivos (p<0,05). Em relação à peroxidação da membrana plasmática foi observada interação entre crioprotetores e aditivos na população de células viáveis (p<0,05), de forma a revelar melhor associação da CCC à DMFA. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que os tratamentos DMFA e DG apresentaram melhores condições para manutenção da viabilidade espermática in vitro, de forma que ambos podem sem utilizados como alternativa em diluidores na criopreservação de sêmen equino. Em relação ao uso da CCC, a sua associação deve ser feita preferencialmente com a DMFA. Os resultados obtidos quanto à ação da ATC não foram satisfatórios, necessitando de novos estudos quanto à concentração ideal e seus efeitos no congelamento de sêmen de garanhões. / The aim of this study was to compare the effects of different cryoprotectants and additives in cryopreservation of Mangalarga Marchador stallions semen on sperm viability in vitro post-thaw. Thus, we designed two experiments (E). In E1 we aimed to compare the effect of glycerol and dimethylformamide, associated or not, on the sperm viability post-thawing. Therefore we collected thirty ejaculates from four stallions. Each one was divided into four treatments: 5% glycerol (GLYC), 5% dimethylformamide (DMFA), an association of 2% glycerol and 3% dimethylformamide (DG) and control treatment compound by Botu-Crio®. In E2 we aimed to evaluate the effect of stallions semen freezing in diluent containing glycerol and or dimethylformamide associated with the anthocyanin (ATC) and or cholesterol loaded cyclodextrin (CCC). We collected orty-eight ejaculates of eight stallions and each one was frozen in ten different treatments, according to the associations between cryoprotectants and additives. The samples of both experiments were evaluated by thermo- resistance test (TTR) and by flow cytometry as to integrity of plasma and acrosomal membrane, mitochondrial potential, intracellular peroxide hydrogen production, lipid peroxidation and organization of the plasma membrane bilayer (only E1). The E1 best results on the TTR were related to DMFA and DG treatments (p<0.05), who maintained the highest average total sperm motility after thirty minutes of incubation at 37 ° C. Mitochondrial potential was not affected by any group (p>0.05). The highest proportion of cells with plasma and acrosomal membrane integrity was observed in DMFA and BC treatments (p<0.05). The analysis revealed the organization of membrane disruption was greater in GLIC treatment (p<0.05). We observed a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in the treatment DMFA and a lower proportion in GLIC treatment (p<0.05). As for the peroxidation of the lipid bilayer, no differences were observed between treatments (p>0.05). About E2 there were no interactions between cryoprotectants and diluents for most traits, with comparisons made between treatment groups. Among the cryoprotectants, DMFA group showed the best results on the TTR, followed by DG group (p <0.05) and among the additives CCC and AC groups were superior to the others (p <0.05). Regarding the integrity of plasma and acrosomal membrane, the BC and GLYC groups showed the worst results among cryoprotectants, as well as BC and ATC groups among the additives (p <0.05). The highest mean about mitochondrial potential were related to DMFA and DG groups among cryoprotectants, and CCC and AC between additives (p <0.05). There was a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in DMFA and DG groups from the cryoprotectants, and CCC and AC groups among the additives (p <0.05). In relation to the plasma membrane peroxidation was observed interaction between cryoprotectants and additives in the population of viable cells (p <0.05), in order to better reveal the association CCC plus DMFA. It was concluded that the DMFA and DG treatments showed better conditions for maintaining sperm viability in vitro, so both can use like alternative method for cryopreservation of stallion semen. The association with the CCC should be made preferably by with DMFA. The results related to ATC were not satisfactory, revealing with it the need for new studies about its optimal concentration and effects on semen freezing stallions.