Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T19:00:09Z No. of bitstreams: 1 2012_FlaviaTuanyRodriguesdeLima.pdf: 3678028 bytes, checksum: ef638ab8eda642020f478cee775fd9e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-06-20T13:58:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_FlaviaTuanyRodriguesdeLima.pdf: 3678028 bytes, checksum: ef638ab8eda642020f478cee775fd9e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T13:58:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_FlaviaTuanyRodriguesdeLima.pdf: 3678028 bytes, checksum: ef638ab8eda642020f478cee775fd9e2 (MD5) / Este trabalho teve como objetivo avaliar as crioinjurias causadas pelo processo de vitrificacao utilizando dois diferentes dispositivos de congelamento (OPS e Cryotop) de ovocitos bovinos imaturos e maturados in vitro. Um novo protocolo de congelamento foi testado e avaliado pela capacidade pos-vitrificacao do ovocito atingir o estagio de metafase II e produzir embrioes in vitro. Os resultados obtidos mostram que ovocitos bovinos imaturos vitrificados pelo Cryotop apresentam maiores taxas do que os maturados in vitro. Os ovocitos utilizados foram obtidos de ovarios de vacas mesticas em abatedouros. Os complexos cumulus oophorus (CCO) foram aspirados e selecionados de foliculos entre 2mm e 8mm. Os CCOs foram colocados em gotas de meio coberto com oleo mineral e mantidos em estufa de cultivo a 39°C em atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade relativa por ate 24hs. Os CCOs selecionados foram aleatoriamente distribuidos nos diferentes grupos. A vitrificacao foi realizada conforme protocolo descrito por Vajta et al. (1998), em que se utilizam duas solucoes de vitrificacao e uma palheta especial denominada OPS (open pulled straw). E o processo de vitrificacao dos ovocitos por Cryotop foi realizada de acordo com um novo protocolo de vitrificacao proposto a partir de mudancas testadas na rotina do laboratorio de biotecnologia da reproducao da UNB. Apos a vitrificacao dos ovocitos, iniciou-se o processo de desvitrificacao dos ovocitos e a seguir retornaram ao cultivo ate completarem 24horas. Apos a maturacao, alguns dos ovocitos foram pelo desnudados e fixados em etanol e acido acetico por 48h. A seguir foram corados pelo corante lacmoide (SIGMA®). Para determinacao do estadio da meiose, os ovocitos foram observados em microscopio de contraste de fase (Olympus®) em aumento de 1000x. Os ovocitos foram classificados de acordo com a configuracao nuclear em vesicula germinativa (VG), metafase I (MI), anafase I (AI), telofase I (TI) e metafase II (MII). Os demais ovocitos seguiram para a fecundacao e cultivo in vitro e os achados do grupo controle positivo (nao vitrificados), apresentaram maior taxa de maturidade do que os ovocitos imaturos vitrificados por OPS. Em contrapartida foi verificado taxas semelhantes de maturidade (MII) entre o controle + e os grupos Cryotop imaturos e maduros assim como o grupo de CCOs maduros vitrificados por OPS. Quanto a producao embrionaria, Para todas as variaveis estudadas, as taxas para os ovocitos vitrificados foram significativamente menores do que as do grupo-controle (P<0,05), com excecao do grupo de ovocitos imaturos vitrificados por cryotop que apresentou taxas semelhantes. Os ovocitos imaturos vitrificados com o Cryotop (15,1%), quando comparados aos demais grupos de ovocitos vitrificados, apresentaram as maiores taxas embrionarias. Os ovocitos vitrificados com Cryotop apresentaram maiores taxas de clivagem e blastocisto quando comparado ao metodo OPS. Os resultados deste estudo mostraram a superioridade do dispositivo Cryotop para vitrificacao de ovocitos bovinos imaturos com o novo protocolo proposto em relacao a producao in vitro de embrioes bovinos. Indicando que a combinacao dos crioprotetores, os tempos de equilibrio ou ate mesmo os procedimentos de vitrificacao realizados foram mais eficazes na preservacao da integridade dos ovocitos do que os ja descritos na literatura, os quais nao encontraram tal eficiencia na producao de embrioes a partir de ovocitos bovinos imaturos e maturados in vitro vitrificados com uso dos mesmos crioprotetores e hastes. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study, was to evaluate the cryoinjuries caused by the vitrification process using two different freezing devices (Cryotop and OPS) of immature and in vitro matured bovine oocytes. A new freezing protocol was tested and evaluated by the ability of the oocyte after vitrification to reach the metaphase II stage and produce in vitro embryos. The results showed that immature bovine oocytes vitrified by Cryotop have higher rates than those matured in vitro. The oocytes used were obtained from ovaries of crossbred cows in slaughterhouses. The cumulus oophorus (CCO) were aspirated and selected of follicles from 2mm to 8mm. CCOs were placed on drops of 200ul of medium covered with mineral oil and maintained in an incubator at 39 ° C in 5% of CO2 and 95% of relative humidity for up to 24h. The CCOs selected were randomly distributed into different groups. Vitrification protocol was performed as described by Vajta et al. (1998), which were used two vitrification solutions and a special pick called OPS (open pulled straw). The oocytes vitrification process by Cryotop was performed according to a new vitrification protocol proposed by changes tested in the routine of reproductive biotechnology lab at UNB. After oocyte vitrification, the process of devitrification of oocytes was done and then returned to culture until they reached 24 hours. After maturation, some oocytes were denuded and fixed in ethanol and acetic acid for 48 hours. The sections were stained by lacmoide (SIGMA ®). To determine the stage of meiosis, the oocytes were observed by phase-contrast microscope (Olympus ®) increased by 1000x.The oocytes were classified according to the nuclear configuration of germinal vesicle (GV), metaphase I (MI), anaphase I (AI), telophase I (TI) and metaphase II (MII) . The rest of oocytes went to fertilization and in vitro culture .The findings of positive control group (nonvitrified) showed greater maturation than the immature oocytes vitrified by OPS. However was found similar rates of maturation (MII) between positive control and Cryotop groups immature and mature as well. The embryo production, of all variables studied, the rates for vitrified oocytes was significantly lower than the control group (P<0,05), except for the immature oocytes group vitrified by cryotop which showed similar rates. The immature oocytes vitrified with Cryotop (15.1%) when compared to other groups of vitrified oocytes showed the highest embryonic rates. The vitrified oocytes with Cryotop showed higher rates of cleavage and blastocyst when compared with the OPS. The results of this study showed the superiority of Cryotop device for vitrification of immature bovine oocytes with a new proposed protocol for the production of in vitro bovine embryos. Indicating that the combination of cryoprotectants, the equilibration times or even the vitrification procedures performed were more effective in preserving the integrity of the oocyte than those already described in the literature, that did not found such efficient production of embryos from immature bovine oocytes in vitro matured and vitrified using the same cryoprotectants and stems.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-22T20:53:14Z No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-23T22:54:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T22:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_TatianeCarmoDuarteMundim.pdf: 429588 bytes, checksum: a569d620900910d9afcf1c181c02b277 (MD5) Previous issue date: 2008-11 / Embriões produzidos por hiperestimulação hormonal são usados como controle in vivo na maioria das publicações relacionadas à expressão gênica. Entretanto, ainda não se sabe se esses embriões são os controles mais apropriados a serem utilizados em estudos de perfil da expressão gênica. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi comparar a expressão dos genes candidatos relacionados ao desenvolvimento embrionário bovino: GRB-10, IGF-II, IGF-IIR, MnSOD, GPX-4, CATALASE, BAX, e INTERFERON-τ, entre embriões produzidos in vivo através de superovulação (SOV), através de Produção in vitro (PIV) e in vivo produzidos por ovulação natural, sem nenhuma estimulação hormonal (OVN). A comparação foi realizada através da técnica de RT-PCR usando β-ACTIN e GAPDH como os controles constitutivos. Quando a expressão individual dos genes foi analisada, GRB-10 foi menos expresso em embriões OVN do que em SOV (P = 0,04) e PIV (P = 0,01), no entanto, nenhuma diferença foi encontrada entre os outros genes. Genes relacionados à resposta ao estresse foram agrupados e comparados entre os diferentes tipos de embriões. A soma da expressão dos genes MnSOD, GPX-4, CATALASE tende (P = 0,10) a ser maior em embriões PIV do que em OVN. A expressão de todos os genes estudados foi também somadas para cada tratamento, e a expressão gênica geral foi menor em embriões OVN quando comparados com embriões de SOV(P = 0,06) ou de PIV(P = 0,04). Nenhuma diferença foi observada entre os embriões SOV e PIV(P = 0,70). Finalmente, os genes foram agrupados de acordo com suas funções, relacionadas ao desenvolvimento embrionário (GRB-10, IGF-II e IGF-IIR), a resposta ao estresse (MnSOD, xiv GPX-4 e CATALASE) e a qualidade embrionária (BAX, INTERFERON-τ). A análise de correlação foi realizada e mostrou um comportamento distinto nos embriões de OVN quando comparados com os de SOV (r = -0,9429) e com os de PIV (r = - 0,8833) para os genes GRB-10, IGF-II e IGF-IIR. No entanto, o comportamento desses genes foi similar para os embriões de SOV e de PIV (r = 0.9890). Concluímos que a estimulação hormonal ovariana afeta os embriões através da alteração de sua expressão gênica. Portanto, se os embriões de SOV tiverem que ser usados como contrôle em estudos de expressão gênica, os dados deverão ser analisados com cautela. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Embryos produced by hormonal hyperstimulation are used as “in vivo” control in the majority of publications related to gene expression. However, if those are the most appropriated control for gene expression profile studies it is not known. Thus, the objective of this study was to compare the expression of GRB-10, IGF-II, IGF-IIR, MnSOD, GPX-4, CATALASE, BAX, and Interferon-τ genes among embryos produced in vivo by hormonal hyperstimulation (SOV), by in vitro fertilization (IVF) or in vivo without any hormonal stimulus (NOV). Comparison was performed using a semi-quantitative RT-PCR using β-Actin and GAPDH as constitutive controls. When the individual gene expression was analyzed, GRB-10 was less expressed in NOV than SOV (P = 0.04) and IVF (P = 0.01) embryos, whereas no differences were found for the other genes. Then, genes related to stress response were grouped and compared among the types of embryos. The sum of expression of MnSOD, GPX-4, CATALASE genes tended (P = 0.10) to be greater in IVF than NOV embryos. The expression of all studied genes were also added together for each treatment, the “overall” gene expression was lower in the NOV embryos when compared with SOV (P = 0.06) or IVF (P = 0.04). No difference was observed between the SOV and IVF embryos (P = 0.70). Finally, genes were grouped according to their function as being related to embryo development (GRB-10, IGF-II, IGF-IIR), stress response (MnSOD, GPX4, CATALASE) and embryo quality (BAX, INTERFERONτ). A correlation analysis was performed and showed a distinct behavior for NOV embryos when compared with SOV (r = -0.9429) or IVF (r = -0.8833) for GRB-10, IGF-II and IGF-IIR genes. However, the behavior of xvi xvii those genes was similar for SOV and IVF embryos (r = 0.9890). We conclude that ovarian hormonal stimulation affects embryos by altering their gene expression. Therefore, if SOV embryos have to be used as experimental control for gene expression studies, data should be analyzed with caution.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2017. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-18T11:45:32Z No. of bitstreams: 1 2017_EleonoraAraújoBarbosa.pdf: 30270734 bytes, checksum: ad667f9d4ec8daa410fd10cf3545a488 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-18T11:45:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_EleonoraAraújoBarbosa.pdf: 30270734 bytes, checksum: ad667f9d4ec8daa410fd10cf3545a488 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-18T11:45:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_EleonoraAraújoBarbosa.pdf: 30270734 bytes, checksum: ad667f9d4ec8daa410fd10cf3545a488 (MD5) Previous issue date: 2018-05-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O Brasil é um dos maiores produtores de bovinos do mundo, e grande parte da reprodução desses animais ainda é realizada por monta natural. Levando em conta que a maior parte do território nacional se encontra em regiões de clima tropical, a adaptabilidade desses animais a temperaturas ambientais aumentadas é extremamente importante, tanto do ponto de vista produtivo como reprodutivo. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da presença ou ausência de sombra, nos parâmetros fisiológicos e seminais de bovinos de raças localmente adaptadas. Touros Curraleiro Pé-Duro, Crioulo Lageano, Pantaneiro e Nelore, foram submetidos a presença ou ausência de sombra e coletados mensalmente durante o período do verão na região Centro-Oeste do Brasil, para avaliação de parâmetros fisiológicos e seminais. As raças apresentaram resultados semelhantes para as características fisiológicas e seminais tanto na sombra quanto no sol, e as raças Curraleiro Pé- Duro e Nelore do grupo sol, apresentaram aumento na quantidade de defeitos menores dos espermatozoides no sêmen fresco, na última coleta quando comparados as coletas anteriores na mesma raça e tratamento, entretanto, não apresentaram diferença significativa entre as raças e tratamentos na última coleta. As raças estudadas demonstram alta adaptabilidade as condições climáticas presentes no verão da região Centro-Oeste do Brasil. / Brazil is one of the largest cattle producers in the world, and much of the reproduction of these animals is still carried out by natural breeding. Most of the national territory is in regions of tropical climate, then the adaptability of these animals to increased environmental temperatures is extremely important, both from productive and reproductive point of view. The objective of the present study was to evaluate the effect of the presence or absence of shade on physiological and seminal parameters of cattle of locally adapted breeds. Curraleiro Pé-Duro, Crioulo Lageano, Pantaneiro and Nelore buuls, were submitted to the presence or absence of shade and collected monthly during the summer period in the Center-West region of Brazil, for the evaluation of physiological and seminal parameters. Breeds presented similar results for physiological and seminal characteristics in both under shade and under the sun, Curraleiro Pé-Duro and Nelore of the sun group showed an increase in the number of minor sperm defects in fresh semen, in the last collection when compared to previous collections in same breed and treatment, however, showed no significant difference between breeds and treatments in the last collection. Breeds studied show high adaptability to the climatic conditions present in the summer of the Center-West region of Brazil.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-16T13:56:17Z No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-23T22:07:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T22:07:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) Previous issue date: 2007-06 / Com o aprimoramento das técnicas de reprodução assistida, a produção de embriões in vivo (TE) e in vitro (PIV), tem crescido consideravelmente e por conseqüência, a demanda por metodologia eficaz de identificação do sexo desses embriões. Este trabalho teve por objetivo avaliar um sistema de identificação do sexo (Diagnóstico pré-implantacional do sexo) de embriões bovinos produzidos em programas comerciais de TE e PIV. Os embriões produzidos in vivo (n=609) foram coletados de animais das raças Holandesa e Jersey, sete dias (D7) após a Inseminação Artificial (IA) nos estágios de mórula compacta (Mc), blastocisto inicial (Bi), blastocisto (Bl) e blastocisto expandido (Bx). Os embriões foram divididos em dois grupos: Grupo TE-B, constituído por embriões biopsiados e Grupo TE-C, constituído por embriões intactos (controle). Para o experimento de produção in vitro, foram utilizados embriões de bovinos da raça Gir (n=318), nos estágios de blastocisto inicial Bi, Bl e Bx, em D-6,5. Os embriões foram divididos em dois grupos: Grupo PIV-B, constituído por embriões biopsiados e Grupo PIV-C, constituído por embriões intactos (controle). Os embriões dos Grupos TE-B (n=380) e PIV-B (n=91) foram submetidos à micromanipulação por microssecção para retirada da biopsia. Os embriões biopsiados foram cultivados até o final do processo de identificação do sexo e então transferidos para receptoras síncronas. Os embriões do Grupo TE-C (n=229) e PIV-C (n=227) foram transferidos íntegros para receptoras síncronas no mesmo momento dos biopsiados. As receptoras foram submetidas à ultra-sonografia aos 30 (TE) e 60 (TE e PIV) dias após as inovulações para diagnóstico de gestação e confirmação do sexo, respectivamente. Para a identificação do sexo dos embriões biopsiados, as respectivas biopsias foram submetidas às técnicas de PCR e eletroforese em gel de agarose. Na reação, foram utilizados 2 pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers), sendo um específico para o cromossomo Y e o outro para um gene autossômico (controle da reação que amplifica uma seqüência de DNA específica em ambos os sexos). Para a comparação das taxas de gestação aos 60 dias, entre os grupos e respectivos controles, foi utilizado o teste do quiquadrado (χ2) e não houve diferenças entre os grupos, com TE-B =206/380 (54,21%), TE-C = 128/229 (55,89%); PIV-B =24/91 (26,37%) e PIV-C=45/227 (19,82%). Das gestações confirmadas que tiveram suas respectivas biopsias submetidas à sexagem, 133 do Grupo TE-B, e 20 do Grupo PIV-B, foram avaliadas por ultra-sonografia aos 60 dias após as inovulações sendo que 124 (93,23%) e 19 (95%), respectivamente, tiveram sexo coincidente com aquele atestado pela PCR. O resultado deste trabalho indicou que o procedimento de retirada de biopsia de embriões produzidos in vivo e in vitro não interfere na viabilidade dos mesmos, e que a metodologia utilizada é viável para identificação do sexo dos embriões em programas comerciais de transferência de embriões. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / With the advance of the assisted reproductive techniques, the use of in vivo (ET) and in vitro embryo production (IVP) has increased considerable, which has lead to a demand for an efficient method for embryo sexing. The present study aimed to evaluate the effect of the micromanipulation of ET and IVP embryos on their viability and to test, in field conditions, a methodology embryo sexing. In vivo produced embryos (n=609) were collected from Holstein and Jersey females. Embryo at compact morula (Mc), initial blastocyst (Bi), blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx) stage on Day 7 post insemination (D-7) were allocated into two groups: Group ET-B, biopsied embryos and Group ET-C, intact embryos (control). For the in vitro production experiment embryos of Gir breed females were used (n=318) at the initial blastocyst (Bi), blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx) stage at Day 6,5 post insemination. Embryos were distributed into two groups: Group IVP-B, biopsied embryos and Group IVP-C, intact embryos (control). Embryos from both groups ET-B (n=380) and IVP-B (n=91) were submitted to micromanipulation by section, for biopsy removal. Biopsied embryos were cultured until the end of the process of sex identification and then were transferred for synchronized recipients. Embryos from the groups ET-C (n=229) and IVP-C (n=227) were transferred intact to the synchronized recipients. All the recipients were evaluated by ultrasonography 30 (ET) and 60 (ET, IVP) days after inovulation, for pregnancy and sex identification. For embryo sex identification the biopsies were submitted to PCR and agarose gel electrophoresis. In the PCR reaction 2 primers were used, one specific for Y chromosome and the other for a bovine autossomic gene. To compare pregnancy rates at 60 days between the groups and their respective controls a Chi-square(χ2) analysis was used. No differences were observed for pregnancy rates between groups, being ET-B = 206/380 (54.21%), ET-C = 128/229 (55.89%); IVP-B = 24/91 (26.37%) and IVP-C = 45/227 (19.82%). Of the confirmed pregnancies that had their biopsies (ET-B = 133 and IVP-B = 20) submitted to sex identification, 124 (93.23%) and 19 (95%) had the same sex in the PCR reaction and in the ultrasonography evaluation at 60 days. The results of the present study indicated that biopsy removal did not affect the viability of the in vivo and in vitro embryos. In addition, the methodology used for embryo sex identification is suitable to be used in embryo transfer commercial programs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-05-05T17:45:23Z No. of bitstreams: 1 2009_JosedeOliveiraCarvalhoNeto.pdf: 892538 bytes, checksum: d6830e182d5bd383c67b689fda62bdc3 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-19T06:07:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_JosedeOliveiraCarvalhoNeto.pdf: 892538 bytes, checksum: d6830e182d5bd383c67b689fda62bdc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-19T06:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_JosedeOliveiraCarvalhoNeto.pdf: 892538 bytes, checksum: d6830e182d5bd383c67b689fda62bdc3 (MD5) Previous issue date: 2009-05 / Estudos utilizando sêmen sexado por citometria de fluxo têm demostrado uma menor fertilidade deste quando comparado ao não sexado. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade estrutural e funcional da célula espermática após sexagem por citometria de fluxo. Amostras de sêmen congelado de quatro touros foram utilizadas. Um ejaculado de cada touro foi coletado e fracionado em três partes, sendo: não sexado (NS), contendo espermatozóide sexado X (SX) e Y (SY). Uma palheta de sêmen foi descongelada sendo uma amostra retirada para avaliação da cinética espermática por sistema computadorizado (CASA computer-assisted semen analysis), aglutinação de cabeça, alterações morfológicas, integridade das membranas plasmáticas e acrossomal, capacitação espermática e integridade da cromatina. O restante foi depositado em gradiente de Percoll de 90:45% (NS90) ou 60:45% (NS60, SX e SY). Após centrifugação em gradiente de Percoll, o pellet resultante foi homogeneizado, sendo utilizado para avaliação espermática ou PIV. Cada procedimento foi repetido três vezes em manipulações diferentes. Para PIV, 2271 ovócitos maturados in vitro foram utilizados, sendo avaliada taxa de fecundação por coloração lacmóide 18 horas pi, clivagem avaliada em D2 (48 hpi) e a taxa de produção de blastocisto avaliada em D6, D7, D8 e D9 de cultivo. Os dados foram analizados usando procedimento GLIMMIX do programa SAS(R) (p < 0,05). Nas características espermáticas avaliadas antes ou após a passagem pelo gradiente de Percoll, nenhuma diferença foi observada entre os grupos SX e SY para todas as variáveis estudadas. As avaliações realizadas antes e após a passagem pelo gradiente de Percoll mostraram que o sêmen não sexado apresentou maior motilidade, maior porcentagem de células com membrana íntegra e células vivas com acrossoma intacto do que o sêmen sexado. Foi observado um efeito do gradiente de Percoll nas amostras de sêmen não sexado, sendo que aquelas submetidas ao gradiente de 90:45% apresentaram maior motilidade, maior porcentagem de células com membrana intacta e menor taxa de recuperação do que as submetidas ao gradiente de 60:45%. Para taxa de fecundação não foi encontrada diferença entre os grupos. O grupo NS90 apresentou maior taxa de clivagem do que o grupo SY, enquanto que os grupos NS60 e SX foram semelhantes aos demais. A taxa de produção de blastocisto dos dias 6, 7, 8 e 9 de cultivo foi maior no grupo NS90 do que no NS60, SX e SY. Com relação à cinética de desenvolvimento embrionário, não foi observado diferença entre os grupos no estágio do embrião nos dias 6, 7, 8 e 9 pi. Os resultados indicam que o processo de sexagem afeta as características espermáticas, mas não causa diminuição da fertilidade in vitro. No entanto, a diferença nas taxas de blastocisto entre os grupos NS60 e NS90 indica que há um efeito do protocolo de seleção espermática na produção de embriões. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Several studies using sex-sorted sperm by flow cytometry have shown that sexed sperm has lower fertility than the non-sexed. Therefore, the objective of the present study was to evaluate structural and functional characteristics of sperm sexed by flow cytometry. In addition, in vitro embryo production and development was assessed when sexed and non-sexed sperm were used for in vitro fertilization. Frozen sexed and non-sexed semen from four sires were used. One ejaculate from each bull was obtained and separated into three portions, being non-sexed (NS), sexed for X (SX) and sexed for Y (SY). Frozen-thawed semen from each sample was analyzed for motility by computer-assisted semen analysis (CASA), sperm head agglutination, sperm morphology, plasma membrane integrity, acrosome integrity, capacitation and chromatin integrity. Then, the samples were placed in 90:45% (NS90) or 60:45% (NS60, SX e SY) Percoll gradient. After Percoll centrifugation, the pellet was used for sperm analysis or IVF. All sperm quality tests and IVF experiments were repeated three times in independent replicates. For IVF a total of 2271 in vitro matured oocytes were used. To assess fertilization rate presumptive zygotes were fixed and stained with lacmoid at 18 hpi. Cleavage was evaluated at D2 (48 hpi) and blastocyst at D6, D7, D8 and D9 of culture. Data were analyzed using proc GLIMMIX of SAS(R) (p < 0.05). No differences were observed between SX and SY groups for any of the sperm variables evaluated either before or after Percoll centrifugation. The evaluations performed before and after Percoll treatment showed that non-sexed sperm had higher motility, higher percentage of cells with intact membrane and higher percentage of live cells with intact acrosome than sexed sperm. An effect of Percoll gradient was observed in the non-sexed samples, with those submitted to 90:45% gradient presenting higher motility, higher percentage of cells with intact membrane and lower recovery rate than those submitted to a 60:45% gradient. No differences among groups were observed for fertilization rate. NS90 group showed higher cleavage rate than the SY group, while groups NS60 and SX had similar rates to the others. Blastocyst rates at D6, D7, D8 and D9 of culture was greater for group NS90, and similar among NS60, SX and SY groups. Regarding embryo development kinetics, all groups showed similar developmental stages on D6, D7, D8 and D9. The results suggest that although the sex-sorting procedure by flow cytometry affected sperm characteristics, it did not cause a decrease on in vitro fertility. In addition, differences in blastocyst rates between groups NS60 and NS90 indicated an effect of sperm selection protocol on embryo production.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-10T21:23:06Z No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T15:37:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T15:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LigianedeOliveiraLeme.pdf: 1254618 bytes, checksum: 056b35332f8c0d914e9ba088b6e79b03 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / O sucesso da criopreservação de embriões bovinos é essencial para melhor aproveitamento de embriões produzidos em excesso, para o estabelecimento de bancos de germoplasma e para comercialização de genética. Neste estudo, foi analisada a alteração na expressão de genes induzida pelo procedimento de vitrificação por Cryotop em blastocistos bovinos usando lâminas de microarranjo EmbryoGENE. Embriões bovinos produzidos in vitro em estágio de blastocisto (144 a 156 horas pós-inseminação) foram vitrificados com Cryotop e não vitrificados (controle). Após 4 horas de cultivo, embriões que re-expandiram ou evoluíram para o estágio de blastocisto expandido foram usados para análises do microarranjo e para quantificação em reação de cadeia de polimerase em tempo real (qPCR). As análises da expressão global revelaram 43 genes diferencialmente expressos em embriões vitrificados comparados aos do grupo controle (p<0,05). Um total de 9 genes foram validados por qPCR, dos quais o FOSL1, envolvido no processo de apoptose, mostrou expressão diferencial (p<0,05) para ambos os métodos, estando super-expresso em embriões vitrificados. Os resultados sugerem que a apoptose tem um papel fundamental na resposta de embriões ao processo de vitrificação. Considerando que a resposta à vitrificação está muito relacionada à qualidade do embrião, levantou-se a hipótese de que a seleção dos embriões para a vitrificação poderia influenciar também a diferença na proporção macho:fêmea, devido a velocidade de desenvolvimento e tolerância ao estresse. Por isso, na segunda etapa deste estudo, foi avaliado o efeito de touros na cinética do desenvolvimento embrionário e na resposta dos embriões à criopreservação. Para isso foram utilizados 5 touros e comparou-se além da produção de embriões, a resposta à criopreservação pelo método Cryotop dos embriões produzidos. Inicialmente, embriões em estágio de blastocisto foram vitrificados (144 a 156 horas pós-inseminação), para avaliação da criotolerância relativa aos touros; enquanto que embriões em estágio de blastocisto expandido foram removidos do cultivo no D6, D7 e D8, e sexados, para avaliação da cinética de desenvolvimento. Na segunda etapa, embriões em estágio de blastocisto expandido foram vitrificados (168 horas pós-inseminação). Todos os embriões (re-expandidos, evoluídos para o estágio de blastocisto eclodido e degenerados), de ambos tratamentos, com 24 horas de cultivo pós-vitrificação foram usados para sexagem. Os resultados sugerem que a escolha do touro, apesar de não interferir na cinética de desenvolvimento embrionário (p>0,05), afeta a produção de blastocistos e também a resposta à criopreservação (p<0,05). E ainda, que os touros que produzem embriões mais crioresistentes nem sempre são os que produzem maior taxa de embriões PIV. Além disso, embriões macho e fêmea têm a mesma capacidade de resposta à vitrificação por Cryotop. / The cryopreservation success of bovine embryos is essential for the better use of excess produced embryos, for the establishment of germplasm banks and genetics commercialization. In this study, gene expression alteration induced by the Cryotop vitrification procedure in bovine blastocysts using EmbryoGENE microarray slides was analyzed. Bovine in vitro produced embryos at blastocyst stage (144 to 156 hours postinsemination) were vitrified with Cryotop and non-vitrified (control). After 4 hours of culture, re-expanded or expanded blastocyst stage embryos were submitted to microarray analyzes and real time polymerase chain reaction (qPCR) quantification. Global gene expression analysis revealed 43 differentially expressed genes in vitrified embryos compared to control group (p <0.05). Nine genes in total were evaluated by qPCR, of which FOSL1, involved in apoptosis process, showed differential expression (p <0.05) for both methods, being overexpressed in vitrified embryos. The results suggest that apoptosis plays a key role in embryos response of vitrification process. Considering that vitrification response is closely related to embryo quality, it was hypothesized that embryos selection for vitrification could also influence the difference in male:female ratio due to developmental speed and stress tolerance. Therefore, in the second stage of this study, the bull´s influence on embryo developmental kinetics and embryo response to cryopreservation was evaluated. For this, five bulls were taken and embryos cryopreservation by Cryotop method was compared in addition to embryo production. Initially, blastocyst stage embryos were vitrified (144 to 156 hours post-insemination), to evaluate the cryotolerance relative to the bulls; while expanded blastocyst stage embryos were removed from culture at D6, D7 and D8, then sexed for developmental kinetics. As a second experiment, expanded blastocyst stage embryos were vitrified (168 hours post-insemination). All embryos (re-expanded, hatched blastocyst stage e, and degenerated) of both treatments, with 24 hours post-vitrification culture were used for sexing. The results suggest that sire´s choice, although not interfering in embryonic development kinetics, affects the blastocysts rates and the cryopreservation response. Besides, bulls producing more cryoresistent embryos are not always the ones that produce the highest IVP embryo rate. In addition, male and female embryos have the same Cryotop vitrification response.