Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T19:00:09Z No. of bitstreams: 1 2012_FlaviaTuanyRodriguesdeLima.pdf: 3678028 bytes, checksum: ef638ab8eda642020f478cee775fd9e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-06-20T13:58:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_FlaviaTuanyRodriguesdeLima.pdf: 3678028 bytes, checksum: ef638ab8eda642020f478cee775fd9e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T13:58:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_FlaviaTuanyRodriguesdeLima.pdf: 3678028 bytes, checksum: ef638ab8eda642020f478cee775fd9e2 (MD5) / Este trabalho teve como objetivo avaliar as crioinjurias causadas pelo processo de vitrificacao utilizando dois diferentes dispositivos de congelamento (OPS e Cryotop) de ovocitos bovinos imaturos e maturados in vitro. Um novo protocolo de congelamento foi testado e avaliado pela capacidade pos-vitrificacao do ovocito atingir o estagio de metafase II e produzir embrioes in vitro. Os resultados obtidos mostram que ovocitos bovinos imaturos vitrificados pelo Cryotop apresentam maiores taxas do que os maturados in vitro. Os ovocitos utilizados foram obtidos de ovarios de vacas mesticas em abatedouros. Os complexos cumulus oophorus (CCO) foram aspirados e selecionados de foliculos entre 2mm e 8mm. Os CCOs foram colocados em gotas de meio coberto com oleo mineral e mantidos em estufa de cultivo a 39°C em atmosfera de 5% de CO2 e 95% de umidade relativa por ate 24hs. Os CCOs selecionados foram aleatoriamente distribuidos nos diferentes grupos. A vitrificacao foi realizada conforme protocolo descrito por Vajta et al. (1998), em que se utilizam duas solucoes de vitrificacao e uma palheta especial denominada OPS (open pulled straw). E o processo de vitrificacao dos ovocitos por Cryotop foi realizada de acordo com um novo protocolo de vitrificacao proposto a partir de mudancas testadas na rotina do laboratorio de biotecnologia da reproducao da UNB. Apos a vitrificacao dos ovocitos, iniciou-se o processo de desvitrificacao dos ovocitos e a seguir retornaram ao cultivo ate completarem 24horas. Apos a maturacao, alguns dos ovocitos foram pelo desnudados e fixados em etanol e acido acetico por 48h. A seguir foram corados pelo corante lacmoide (SIGMA®). Para determinacao do estadio da meiose, os ovocitos foram observados em microscopio de contraste de fase (Olympus®) em aumento de 1000x. Os ovocitos foram classificados de acordo com a configuracao nuclear em vesicula germinativa (VG), metafase I (MI), anafase I (AI), telofase I (TI) e metafase II (MII). Os demais ovocitos seguiram para a fecundacao e cultivo in vitro e os achados do grupo controle positivo (nao vitrificados), apresentaram maior taxa de maturidade do que os ovocitos imaturos vitrificados por OPS. Em contrapartida foi verificado taxas semelhantes de maturidade (MII) entre o controle + e os grupos Cryotop imaturos e maduros assim como o grupo de CCOs maduros vitrificados por OPS. Quanto a producao embrionaria, Para todas as variaveis estudadas, as taxas para os ovocitos vitrificados foram significativamente menores do que as do grupo-controle (P<0,05), com excecao do grupo de ovocitos imaturos vitrificados por cryotop que apresentou taxas semelhantes. Os ovocitos imaturos vitrificados com o Cryotop (15,1%), quando comparados aos demais grupos de ovocitos vitrificados, apresentaram as maiores taxas embrionarias. Os ovocitos vitrificados com Cryotop apresentaram maiores taxas de clivagem e blastocisto quando comparado ao metodo OPS. Os resultados deste estudo mostraram a superioridade do dispositivo Cryotop para vitrificacao de ovocitos bovinos imaturos com o novo protocolo proposto em relacao a producao in vitro de embrioes bovinos. Indicando que a combinacao dos crioprotetores, os tempos de equilibrio ou ate mesmo os procedimentos de vitrificacao realizados foram mais eficazes na preservacao da integridade dos ovocitos do que os ja descritos na literatura, os quais nao encontraram tal eficiencia na producao de embrioes a partir de ovocitos bovinos imaturos e maturados in vitro vitrificados com uso dos mesmos crioprotetores e hastes. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study, was to evaluate the cryoinjuries caused by the vitrification process using two different freezing devices (Cryotop and OPS) of immature and in vitro matured bovine oocytes. A new freezing protocol was tested and evaluated by the ability of the oocyte after vitrification to reach the metaphase II stage and produce in vitro embryos. The results showed that immature bovine oocytes vitrified by Cryotop have higher rates than those matured in vitro. The oocytes used were obtained from ovaries of crossbred cows in slaughterhouses. The cumulus oophorus (CCO) were aspirated and selected of follicles from 2mm to 8mm. CCOs were placed on drops of 200ul of medium covered with mineral oil and maintained in an incubator at 39 ° C in 5% of CO2 and 95% of relative humidity for up to 24h. The CCOs selected were randomly distributed into different groups. Vitrification protocol was performed as described by Vajta et al. (1998), which were used two vitrification solutions and a special pick called OPS (open pulled straw). The oocytes vitrification process by Cryotop was performed according to a new vitrification protocol proposed by changes tested in the routine of reproductive biotechnology lab at UNB. After oocyte vitrification, the process of devitrification of oocytes was done and then returned to culture until they reached 24 hours. After maturation, some oocytes were denuded and fixed in ethanol and acetic acid for 48 hours. The sections were stained by lacmoide (SIGMA ®). To determine the stage of meiosis, the oocytes were observed by phase-contrast microscope (Olympus ®) increased by 1000x.The oocytes were classified according to the nuclear configuration of germinal vesicle (GV), metaphase I (MI), anaphase I (AI), telophase I (TI) and metaphase II (MII) . The rest of oocytes went to fertilization and in vitro culture .The findings of positive control group (nonvitrified) showed greater maturation than the immature oocytes vitrified by OPS. However was found similar rates of maturation (MII) between positive control and Cryotop groups immature and mature as well. The embryo production, of all variables studied, the rates for vitrified oocytes was significantly lower than the control group (P<0,05), except for the immature oocytes group vitrified by cryotop which showed similar rates. The immature oocytes vitrified with Cryotop (15.1%) when compared to other groups of vitrified oocytes showed the highest embryonic rates. The vitrified oocytes with Cryotop showed higher rates of cleavage and blastocyst when compared with the OPS. The results of this study showed the superiority of Cryotop device for vitrification of immature bovine oocytes with a new proposed protocol for the production of in vitro bovine embryos. Indicating that the combination of cryoprotectants, the equilibration times or even the vitrification procedures performed were more effective in preserving the integrity of the oocyte than those already described in the literature, that did not found such efficient production of embryos from immature bovine oocytes in vitro matured and vitrified using the same cryoprotectants and stems.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Ciências Médicas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-29T16:17:27Z No. of bitstreams: 1 2014_DanielleKaiserdeSouza.pdf: 2242916 bytes, checksum: 5c6397a38edb3ecd82fff8dd5fb821ff (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T18:00:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DanielleKaiserdeSouza.pdf: 2242916 bytes, checksum: 5c6397a38edb3ecd82fff8dd5fb821ff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T18:00:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DanielleKaiserdeSouza.pdf: 2242916 bytes, checksum: 5c6397a38edb3ecd82fff8dd5fb821ff (MD5) / Introdução: A maturação do complexo cumulus-ovócito (CCO) in vitro depende do meio de cultivo no qual se encontra e é uma biotécnica bastante difundida para a geração de embriões bovinos para a produção de gado. A biologia do desenvolvimento do ovócito tem como indicadores a maturação nuclear, esteroidogênese, apoptose e nutrição dos CCOs, tendo as células do cumulus papel central nesses aspectos. A via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3-K) tem ações comprovadas nos parâmetros citados, tornando-a ponto relevante no estudo da biologia dos CCOs bovinos. O presente trabalho visa estudar esses parâmetros para esclarecer algumas funções biológicas do meio definido e patenteado MIV B e da adição de 10 ng/mL de FSH. Para inferir a importância da PI3-K foi utilizado o inibidor dessa via (LY294002) durante o cultivo de CCOs. Métodos: Ovário bovinos foram coletados em abatedouros e os CCOs aspirados para cultivo por 22–24 horas. Os seguintes meios-teste foram utilizados, tendo o meio MIV B como base: 0FSH; 0FSH 10LY (+10 μM LY294002); 0FSH 100LY (+100 μM LY294002); 10FSH; 10FSH 10LY ou 10FSH 100LY. Posteriormente, a dose de 10 μM foi excluída, pois não apresentou nenhum efeito. A androstenediona foi suplementada para sustentar a esteroidogênese. Após o cultivo, os CCOs foram desnudos e as células do cumulus isoladas para as aferições subsequentes. Foram avaliadas a retomada e progressão da maturação nuclear, a expulsão do corpúsculo polar e a produção de hormônios 17 beta-estradiol (E2) e progesterona (P4). As células do cumulus foram analisadas para determinar a expressão de genes, por PCR real time, referentes à esteroidogênese (LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 e HSD17B1), apoptose (Bax), sobrevida celular (Bcl-2) e nutrição do CCO (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH e SNAP25). Resultados: No meio 0FSH foi encontrado imaturidade nuclear e baixa taxa de expulsão do corpúsculo polar. Porém, manteve a produção de E2 e P4 e a expressão dos receptores de FSH e LH e das enzimas da esteroidogênese, mimetizando a condição de folículo ovariano em crescimento. O meio 0FSH ainda apresenta baixa expressão de Bax, Bcl-2 e GLUT1 e aumento da expressão de G6PDH e SNAP25. A adição do inibidor (meio 0FSH 100LY) causou a progressão da meiose, inibição da expulsão do corpúsculo polar, diminuição de E2 e aumento de P4. O meio inibiu a expressão de LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 e HSD17B1. Também houve diminuição da expressão de GLUT4 e G6PDH. No meio 10FSH há retomada e progressão da meiose e expulsão do corpúsculo polar, manutenção da produção de E2 e P4. Houve baixa expressão de LHR, FSHR, CYP19A1 e HSD17B1. Além disso, houve aumento da expressão de GLUT1, G6PDH, Bcl-2 e Bax e baixa expressão de GLUT4 e SNAP25, em relação ao meio 0FSH. A suplementação do inibidor (meio 10FSH 100LY) causou inibição da expulsão do corpúsculo polar e diminuição de E2. Houve aumento da expressão de LHR e CYP19A1, além da diminuição da G6PDH e Bax. O gene PDH não sofreu modificação em nenhum dos tratamentos. SNAP25, GLUT1 e Bcl-2 não foram afetadas pelo LY294002. Conclusões: O meio MIVB 0FSH é capaz de manter a esteroidogênese e a nutrição do CCOs, baseando-se na expressão gênica. A adição de FSH causa diminuição da expressão de genes importantes da esteroidogênese, mas aumenta os de sobrevida e de metabolismo (GLUT1 e G6PDH). Além disso, a via PI3-K tem ações diferentes no meio com e sem FSH. No meio sem FSH, a via mantém a expressão dos genes esteroidogênese e metabolismo (GLUT4 e G6PDH). No meio com FSH, inibe LHR e CYP19A1 e mantém G6PDH e Bax. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: The maturation of cumulus oocyte complex (COC) in vitro depends on culture medium environment and it is a widely used biotechnology to produce bovine embryos for livestock production. The developmental biology of oocyte involves nuclear maturation, steroidogenesis, apoptosis and nutrition of COC, with central role of cumulus cells. The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) pathway controls the parameters cited previously, making PI3-K pathway relevant for the COC biology. The aim of the present work was to study those parameters to elucidate biology functions of a defined medium MIV B (patent medium of the lab) and the addition of 10 ng/mL of FSH. To infer the PI3-K role, its inhibitor (LY294002) was used in COC culture. Methods: Bovine ovaries were obtained at abattoirs and COC were aspirated for 22– 24 hours of culture. The CCOs were allocated in the following experimental groups, using the MIV B: 0FSH; 0FSH 10LY (+10 μM LY294002); 0FSH 100LY (+100 μM LY294002); 10FSH; 10FSH 10LY or 10FSH 100LY. After preliminary results the 10 μM of LY294002 were excluded because did not show effect. Androstenedione was supplemented to sustain steroidogenesis. After culture, COC were denuded and cumulus cells were isolated to subsequent evaluations. Resumption and progression of nuclear maturation, polar body extrusion, and steroid hormones final concentration 17 beta-estradiol (E2) and progesterone (P4) were evaluated. The cumulus cells were analyzed to determine gene expression, for PCR real time, of proteins involved in steroidogenesis (LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 and HSD17B1), apoptosis (Bax), cell survival (Bcl-2), and nutrition of CCO (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH and SNAP25). Results: MIV B 0FSH leads to immature nuclear status and low rates of polar body extrusion. However, the medium maintained the E2 and P4 values in culture media and expression of receptor of FSH and LH and of steroidogenic enzymes, mimetizing a growing ovarian follicle. 0FSH group presented low expression of Bax, Bcl-2 and GLUT1 and high levels of G6PDH and SNAP25. The addition of inhibitor (0FSH 100LY group) caused the meiosis progression, inhibition of polar body extrusion, decrease of E2 and enhance of P4 levels. The medium also decreased the LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 and HSD17B1 gene expression. GLUT4 and G6PDH expression were also inhibited by the medium. In the 10FSH medium the levels of resumption and progression of meiosis and polar body extrusion were higher, and E2 and P4 levels were maintained. LHR, FSHR, CYP19A1 and HSD17B1 expression were inhibited. In addition, the expression of GLUT1, G6PDH, Bcl-2 and Bax were stimulated and GLUT4 and SNAP25 were inhibited in comparison to 0FSH. The supplementation of inhibitor (10FSH 100LY group) prevented polar body extrusion and decreased E2 values. There was an increase of LHR and CYP19A1, and decrease of G6PDH and Bax expression. PDH gene expression did not change after culture treatments. SNAP25, GLUT1 and Bcl-2 expression were not affected by the LY294002. Conclusion: In conclusion, the MIV B 0FSH was able to maintain steroidogenesis and the nutrition of COC, based on gene expression. The addition of FSH caused a diminishing of gene expression of steroidogenesis, however improves those related to cell survival and metabolism (GLUT1 and G6PDH). Furthermore, PI3-K pathway demonstrates different action in the medium with and without FSH. The medium without FSH, the pathway maintains steroidogenesis and metabolism (GLUT4 and G6PDH). The medium with FSH inhibits LHR and CYP19A1 and maintains G6PDH and Bax.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-04-17T15:50:19Z No. of bitstreams: 1 2011_JoseFelipeWarmilingSpricigo.pdf: 776198 bytes, checksum: 7dc5f032a4e8d4be9695b31ffaede77b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2012-04-20T15:27:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_JoseFelipeWarmilingSpricigo.pdf: 776198 bytes, checksum: 7dc5f032a4e8d4be9695b31ffaede77b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-20T15:27:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_JoseFelipeWarmilingSpricigo.pdf: 776198 bytes, checksum: 7dc5f032a4e8d4be9695b31ffaede77b (MD5) / A vitrificaçào com cryotop surgiu como uma opçào promissora para a criopreservaçào de ovócitos, por minimizar efeitos negativos e melhorar as taxas de sobrevivência. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da vitrificaçào em diferentes momentos da maturação in vitro (MTV), quanto às características morfológieas, funcionais e moleculares, em ovócitos bovinos. Foram utilizados complexos-cumulus-ovócitos (CCOs) obtidos de ovários de abatedouio. Paia os experimentos 1 e 2, os ovócitos foram distribuídos em 4 grupos: controle (GC), não vitrificado; 0 hora vitrificado (VO); S horas vitrificado (VS) e 22 horas vitrificado (V22). Todos os grupos vitrificados foram desvitrifícados e retornaram para a MrV até completar 24 horas. Para a avaliação da cromatina, CCOs foram desnudados, fixados e corados com lacmoide. Para a taxa de fecundação, ovócitos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV), e após 18 horas de co-cultivo com os espermatozóides foram fixados e corados com lacmoide. O desenvolvimento embrionário foi avaliado, pelas taxas de clivagem e blastocistos em D2. D7 e D8, após a inseminação (pi). Para análise estatística foi empregado o teste Qui-quadrado (P<0,05). Quanto ao experimento 3. primeiramente foi quantificada a expressão de genes ligados à apoptose (Caspase-3 e P-53) e ao controle epigenético (HDAC 2, Dnmt-1 e SUV39H1) em ovócitos maturados m vitro por : 0 (GCO), 8 (GC E), 22 (GC22) e 24 horas (GC24). Posteriormente, foi avaliado o efeito da vitrificaçào em diferentes momentos da MIV (0, 8 e 22 horas) na expressão desses mesmos genes. Para isso ovócitos de todos os grupos vitrifícados e do controle foram coletados ás 24 horas de MIV. A avaliação da expressão gênica. foi realizada por qPCR e os dados analisados por ANOVA one-way. (P<0,0S). A capacidade do ovócito de atingir Mil, após a maturação, clival e se desenvolver até blastocisto foi superior no grupo controle (P<0,05) comparado aos grupos vitrifícados. não havendo diferenças significativas entre estes (P>0.05). Já a taxa de fecundação, apesar de ser superior no grupo controle (P<0.05) o grupo VO apresentou a menor porcentagem de ovócitos fecundados e maior de ovócitos degenerados (P<0,05). comparado aos demais grupos. Quanto ao perfil de expressão gêmea em ovócitos durante a MIV. foi observado que os níveis de transcritos do gene Caspase-3 estavam aumentados (P<0,05). nos grupos GC22 e GC24. comparados á GCO e GCS, também foi observado um aumento (P<0.05) da expressão do gene Dnmt-1. nos grupos GC8. GC22 e GC24 comparados ao GCO. Entretanto, não foi observada alteração na abundância dos transcritos em nenhum dos grupos submetidos à vitnficação (P>0,0:j), comparados ao CG24. Conclui-se que. apesar dos baixos resultados, a vitnficação pode ser empregada para a conservação de ovócitos bovinos, independente do momento da MIV. Os níveis de transcritos avaliados nào foram alterados em resposta à vitrificaçào. Entretanto, foi constatado um aumento na expressão da Caspase-3 e Dnmt-1, durante a MIV. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Vitrification by cryorop method has emerged as a promising option for oocytes cryopreservation, by minimizing negative effects and improving survival rates. The aim of this research was to evaluate the effect of vitrification at different tunes point during in vitro maturation (TVM) on functional, morphological and molecular characteristics of bovine oocytes. For all the experiments cumulus-oocytes-complexes (COCs) were obtained from slaughterhouse ovaries. In first and second experiments, oocytes were distributed into 4 groups: control non-vitrified(C&); 0 hour vitrified (VO); 8 hours vitrified (VS) and 22 hours vitrified (V22). In all groups oocytes were vitrified and wanned, and then returned to incubator until 24 hours of IVM. For chromatin evaluation, COCs were denuded, fixed and stained with lacmoid. To evaluate fertilization rates, oocytes, were fixed and stained with lacmoid 18 hours after in vitro insemination (pi). Embryonic development was accessed by cleavage and blastocyst rates at D2. D7 and D8 (pi). Data were analyzed by Chi-square test (P <0.05). A third experiment was designed to evaluated inRNA expression of apoptosis (Caspase-3 and P-53) and epigenetic control related genes (HDAC 2, SUV39H1 and Dnmtl).First gene expression was quantified at different time points during oocyte IVM: 0 (CGO). 8 (CG 8), 22 (CG22) and 24 hours (CG24). Then, the effect of vitrification at different moments of IVM (0, 8 and 22 hours) on genes expression was studies. Gene expression was performed by qPCR and data were analyzed by one-way ANOVA (P <0.05).. The ability of the oocyte to reach Mil after maturation, to cleave and to develop to blastocyst w:as higher in CG (P <0.05), compared to vitrified groups, which did not differ among them (P:: 0.05). For fertilization rates, CG also presented superior results compared to all vitrified groups (P <0 05). However, when vitrified groups were compared. VO had the lowest rate of fertilized oocytes and higher rate degenerated oocytes than the other groups (P <0.05). Gene expression profile in oocytes during IVM, showed that mRNA levels of Caspase-3 were increased (P <0.05) in both CG22 and C&24 compared to CGO and CGE. An increase in Dnnit-1 gene expression was also observed (P <0.05) in CGS, CG22 and CG24 compared to CGO. No difference in mRNA relative abundance was observed in any of the vitnficated group (P> 0.05), compared to CG24. hi conclusion, despite the poor results, vitrification can be used to preserve bovine oocytes , regardless to IVM time. Transcript levels of the studied genes were not affected by vitrification procedure. However, an increase in mRNA levels of Caspase-3 and Dntnt-1 genes was observed during IVM, suggesting transcription processes during this period.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-13T17:54:43Z No. of bitstreams: 1 2014_FernandaPaulini.pdf: 3724578 bytes, checksum: ee26cd70cb930d0040e2ed6366a6a918 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-14T13:34:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_FernandaPaulini.pdf: 3724578 bytes, checksum: ee26cd70cb930d0040e2ed6366a6a918 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-14T13:34:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_FernandaPaulini.pdf: 3724578 bytes, checksum: ee26cd70cb930d0040e2ed6366a6a918 (MD5) / Avanços na pesquisa básica em reprodução animal e nas biotécnicas reprodutivas dependem da perfeita visualização e monitoramento das estruturas ovarianas no desenvolvimento folicular. Assim, o primeiro capítulo desta tese traz uma revisão bibliográfica sobre as principais técnicas utilizadas no estudo e na visualização de estruturas ovarianas, com foco no potencial, na aplicabilidade e nas limitações de cada técnica. O segundo capítulo foi conduzido com um experimento que teve como objetivo comparar as estruturas internas visualizadas no ovário em diferentes espécies por tomografia computadorizada (TC). Foram utilizados ovários de rata, cadela, gata, vaca, porca, égua e jumenta. Os ovários foram escaneados com uso de microtomógrafo computadorizado, e a reconstrução das imagens deu origem a representações bi e tridimensionais dos ovários. As mesmas amostras foram posteriormente processadas para avaliação histológica e validação dos resultados obtidos pelo microTC. A TC possibilitou distinguir as regiões de córtex e medula, observar folículos antrais, identificar os ovócitos dentro deles, visualizar corpos lúteos, bem como a distribuição e morfologia dos vasos sanguíneos de médio e grande calibre, embora não tenha possibilitado a visualização de folículos pré-antrais. Esta técnica apresenta possibilidades para o estudo das estruturas internas do ovário. O terceiro capítulo consiste em uma revisão de literatura que foi motivada pela percepção de que informações sobre a estrutura e ultraestrutura ovariana de diferentes espécies encontram-se dispersas e desassociadas na literatura. Abordando sete espécies domésticas, foram consideradas as principais diferenças na presença e distribuição das organelas citoplasmáticas em ovócitos e células da granulosa de folículos pré-antrais e antrais. Verificou-se que o padrão ultraestrutural de folículos e ovócitos varia entre espécies domésticas bem como entre as fases do desenvolvimento folicular. Este tipo de conhecimento permite melhorias na compreensão anatômica e fisiológica do ovário, e pode subsidiar avanços em diversas linhas de pesquisa, como na melhoria das biotecnologias reprodutivas e no auxílio da compreensão de danos e pontos limitantes da manipulação in vitro de ovócitos em diferentes espécies. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Monitoring ovarian structures during follicular development may enable great advances in reproductive biotechnologies and animal reproduction. In this sense, this thesis was divided in three chapters, aiming to empower the understanding of diagnostic imaging, the characterization of ovarian structures and the comparison between domestic species. The first chapter of the thesis is a bibliographic revision considering the main techniques that are useful to visualize the ovarian structures. We focused on the potential, applicability and general limitations of each technique. The second chapter consists of an experiment, undertaken to compare the internal structures of the ovary using computerized microtomography. We compared the ovaries of rats, bitches, quees, cows, mares, sows and female donkey and carried out the reconstruction of the tomographic images to originate two and three dimensional representations. After scanning, the same samples were prepared for histologic evaluation, used in this research as validation criteria for ovary research based on computerized microtomography. Microtomography enabled to distinguish the regions of the cortex and medulla, to identify oocytes, corpus luteum and to visualize the morphology and distribution of medium caliber blood vessels. However, it didn’t enable the visualization of pre antral follicles. The third chapter of the thesis is a bibliographic revision motivated by the fact that information comparing the ovarian ultrastructure between species is scarce. We emphasized major differences in seven domestic species, considering the presence and distribution of cytoplasmic organelles in oocytes, granulosa cells, pre antral and antral follicles. It was observed that the ultrastructure of follicles and oocytes vary between species and between the stages of follicular development. This research subsidizes advanced comprehension of the anatomy and physiology of the ovary in different species. It may enable the understanding of several limitations points related to in vitro manipulation of oocytes and, therefore, generate future adjustments in reproductive technologies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2007. / Submitted by Rosane Cossich Furtado (rosanecossich@gmail.com) on 2009-12-04T11:36:14Z No. of bitstreams: 1 2007_MarceloTigreMoura.PDF: 520636 bytes, checksum: 7b19fc979206fdab6cd57d11632ea655 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2009-12-04T18:36:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_MarceloTigreMoura.PDF: 520636 bytes, checksum: 7b19fc979206fdab6cd57d11632ea655 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-04T18:36:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_MarceloTigreMoura.PDF: 520636 bytes, checksum: 7b19fc979206fdab6cd57d11632ea655 (MD5) Previous issue date: 2007-05-17 / A clonagem por Transferência Nuclear (TN) é uma técnica pouco eficiente e laboriosa. O processo, do ponto de vista técnico, é um dos principais fatores responsáveis pela quantidade e qualidade dos embriões produzidos. A enucleação é a etapa mais agressiva da TN. Apesar dos métodos alternativos propostos, a enucleação permanece sendo realizada como inicialmente descrita nos anos 50. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do inibidor irreversível de transcrição e replicação actinomicina D (Fluka®, Suiça) como método de enucleação química de ovócitos. Ovócitos foram maturados in vitro (MIV) por 4 ou 6 horas e expostos a actinomicina D (T1, controle; T2 = 1,0 μg ml-¹ / 16hs; T3 = 1,0 μg ml-¹ / 14hs; T4 = 2,5 μg ml-¹ / 14hs; T5 = 5,0 μg ml-¹ / 14hs). Os ovócitos foram desnudados após 20 horas de MIV e ativados com 24-26 horas de MIV. As taxas de clivagem foram avaliadas 48 horas após a ativação (D2) e as de blastocisto após 168 (D7) e 192 (D8) horas de cultivo. Parte dos ovócitos foi fixada e corada com lacmóide ou orceína para determinação da fase da meiose ou para visualização da morfologia dos cromossomos, respectivamente. Posteriormente, ovócitos tratados com actinomicina D foram utilizados para clonagem por TN, sendo que parte dos embriões (D3) foi fixada para avaliar o percentual de células apoptóticas através do teste de TUNEL. Os dados relativos às taxas de maturação, clivagem e blastocisto foram analisados pelo teste do Qui-quadrado e os percentuais de apoptose pelo teste de Mann-Whitney. A taxa de maturação (T1 = 90,4%; T2 = 82,3%; T3 = 79,1%; T4 = 83,4%; T5 = 74,7%), clivagem (T1 = 68,9%; T2 = 46,0%; T3 = 49,7%; T4= 33,4; T5= 29,3%) e de blastocisto em D8 (T1 = 41,1%; T2 = 1,4%; T3= 1,3%; T4= 0,9%; T5= 0,0%) após o tratamento com actinomicina D foi significativamente menor. Dos ovócitos fixados, 63,2% estavam em metáfase II (MII). Ao avaliar os cromossomos, foi observada uma descondensação significativa com as concentrações mais altas (2,5 e 5,0 μg ml-¹). Os demais tratamentos não apresentaram modificações perceptíveis. Ovócitos tratados com 1,0 μg ml-¹ por 14 horas foram utilizados como citoplasmas receptores. A taxa de clivagem dos embriões reconstruídos (61,3%) foi semelhante ao grupo partenogenético tratado (61,3%) e inferior ao não tratado com actinomicina D (70,2%), embora a taxa de blastocisto tenha sido mais alta no grupo de TN (11,8%) em relação ao controle tratado (3,6%) e inferior ao controle sem tratamento (38,0%). Ao analisar o índice apoptótico dos embriões, os embriões partenogenéticos tratados tiveram um índice maior que os partenogenéticos não tratados (24,2% contra 4,8%). No entanto, os embriões oriundos de TN com ovócito tratado não foram diferentes estatisticamente dos TN controle (9,3 contra 13,0%). A actinomicina D é eficiente no bloqueio da transcrição e replicação embrionária. Além disso, foi possível obter embriões reconstruídos que apresentavam percentual de células apoptóticas indistinguível do controle. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cloning by Nuclear Transfer (NT) is a low efficiency and labor intense technique. The process, in technical terms, is one of the main factors responsible for both embryo quality and quantity. Enucleation is the most aggressive step. Although alternative methods have been proposed, it remains mainly as it has been first described in the early fifties. The objective of the present work was to evaluate the effect of transcription and replication inhibitor actinomycin D as a chemical enucleation method for oocytes. Oocytes were matured in vitro (MIV) for 4 or 6 hours and exposed to actinomycin D (T1, control; T2 = 1,0 μg ml-¹ / 16hs; T3 = 1,0 μg ml-¹ / 14hs; T4 = 2,5 μg ml-¹ / 14hs; T5 = 5,0 μg ml-¹ / 14hs). The oocytes were denuded 20 hours after MIV and activated 24-26 hours after MIV. The cleavage rate was recorded 48 hours post activation and the blastocyst at 168 (D7) and 192 (D8) hours of culture. Some oocytes were fixed and stained with lacmoyd or orcein to determine the maturation status or for chromosome morphology evaluation, respectively. Furthermore, oocytes treated with actinomycin D were used as recipient cytoplasts for NT, while some embryos (D3) were fixed to evaluate the percentage of apoptotic nuclei by the TUNEL assay. The data relative to the maturation, cleavage and blastocyst rate were analyzed by the chi-square test and apoptosis percentages by the Mann-Whitney test. The maturation (T1 = 90,4%; T2 = 82,3%; T3 = 79,1%; T4 = 83,4%; T5 = 74,7%), cleavage (T1 = 68,9%; T2 = 46,0%; T3 = 49,7%; T4 = 33,4%; T5 = 29,3%) and blastocyst rate at D8 (T1 = 41,1%; T2 = 1,4%; T3 = 1,3%; T4 = 0,9%; T5 = 0,0%) after actinomycin D treatment was significantly different. Analyzing the fixed oocytes, 63,2% were in MII. While evaluating the chromosomes, it was observed a significant uncoiling when exposed to higher concentrations (2,5 and 5,0 μg ml-¹). The remaining groups had no apparent perceptible modifications. Furthermore, oocytes treated with 1 μg ml-¹ for 14 hours were used as recipient cytoplasts. The cleavage rate (61,3%) was similar to the actinomycin D treated control group (61,3%) and lower than the non-treated control (70,2%), although the blastocyst rate was higher in the NT group (11,8%) comparing to the treated control (3,6%) and lower to the untreated control (38,0%). After analyzing the embryos for apoptotic cells, the treated parthenogenetic embryos had a higher index than the parthenogenetic control (24,2% vs. 4,8%). However, the NT embryos generated by treated cytoplasts wasn’t statistically different from the NT control (9,3 vs. 13,0%). The actinomycin D treatment is efficient to block embryonic transcription and replication. Moreover, it was possible to obtain reconstructed embryos that possess an apoptotic cell index indistinguishable from the control.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016. / A criopreservação do ovócito bovino ainda é um desafio. O tamanho celular, a quantidade de água no citoplasma, a reserva de ácidos graxos, a composição da membrana plasmática, são alguns dos fatores responsáveis pela baixa eficiência da técnica. Entre as metodologias utilizadas para a criopreservação de ovócitos, a vitrificação ainda é considerado o método mais eficaz. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar diferentes alternativas para minimizar os efeitos deletérios da vitrificação em ovócitos bovinos imaturos ou maturados. Entre as abordagens utilizadas estão (1) o uso de beta- metil- ciclodextrina (MβCD), como substância para alterar a membrana plasmática e aumentar a fluidez da mesma; (2) a associação de L-Carnitina e Resveratrol durante a maturação in vitro (MIV), para diminuir a reserva de gotículas lipídicas, aumentar a produção de ATP e proteger o ovócito contra o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs); (3) o uso da maturação in vivo para melhorar a qualidade do ovócito e, (4) o uso da transferência intrafolicular de ovócito imaturo, para proporcionar aos ovócitos vitrificados uma ambiente in vivo durante todos os passos da produção de embriões. Em cada experimento, diferentes avaliações foram utilizadas para identificar o sucesso ou insucesso das alternativas propostas. Apesar de alguns procedimentos como o uso de MβCD, terem melhorado a maturação nuclear, nenhum dos procedimentos utilizados aumentou a produção de blastocistos a partir de ovócito vitrificados. Os resultados obtidos mostraram que as lesões sofridas pelo ovócito bovino durante a vitrificação e aquecimento, o comprometem de forma muito severa e irreversível. / Cryopreservation of bovine oocyte is still a challenge. The cell size, the amount of water in the cytoplasm, the reservation of fatty acids, plasma membrane composition , are some of factors responsible for low efficiency of technique for bovine oocytes. Among the methodologies used for cryopreservation of oocytes, vitrification is the one that can minimize the effects of water flow. The main objective of present thesis was to prove different methodologies for vitrification of immature or matured bovine oocytes. For different alternatives were proved: (1) MβCD, a substance to alter the plasma membrane and increase membrane fluidity. (2) the combination of L-carnitine and resveratrol during IVM, to reduce reserves of lipid droplets, increase ATP production and protect against ROS aa. (3) in vivo maturation system where, after hormonal stimulation on bovine heifers, in vivo and theatrically better oocyte were produced. (4) intrafollicular transfer of immature oocyte, we adapted a methodology for immature oocytes could be injected into pre-ovulatory follicles, resulting in a in vivo system. For each experiment, different assessments were used to identify the successes or failures of our hypothesis. A common evaluation used for all experiments was the use of immature or for some experiments matured oocytes, destined for blastocyst development, after IVF. In none of proposed experiments, we have succeeded in increasing the production of blastocysts from vitrified oocytes. Likewise, the results, indicated that the injuries suffered by bovine oocyte during vitrification and thawing, compromise the oocyte at very severe intensity.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3118832 bytes, checksum: 81687fa6c0330c0e46d76f4e683d9673 (MD5) Previous issue date: 2002-08-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed at the evaluation of the effects from cryopreservation on the in vitro matured and immature oocytes, using the conventional method. The experiment was carried out in the Animal Reproduction Laboratory - DVT-UFV, by using oocytes from cows ovaries from slaughterhouse, which were distributed into six treatments. Treatment 1 (T1): non-frozen oocytes (fresh ones) provided with the cumulus oophorus cells (COC) which were immediately submitted to the processes MIV, FIV and CIV. Treatment 2 (T2): non-frozen oocytes (fresh ones), deprived unprovided of the cumulus oophorus cells (naked), which were immediately submitted to MIV, FIV and CIV. Treatment 3 (T3): immature oocytes provided with the cumulus oophorus cells, which were submitted to cryopreservation just after selection. Later, they were thawed and those considered as normal ones were submitted to MIV, FIV and CIV. Treatment 4 (T4): naked oocytes submitted to cryopreservation. Later, they were thawed and those considered as normal ones were submitted to MIV, FIV and CIV. Treatment 5 (T5): oocytes provided with the cumulus oophorus cells, matured in vitro, and then they were frozen. Later, they were thawed and those considered as normal ones were submitted to recultivation for 2 hours in a maturation medium, and then submitted to FIV and CIV. Treatment 6 (T6): naked, in vitro matured oocytes which were submitted to cryopreservation. After thawing, those oocytes which were considered as normal ones were submitted to recultivation for 2 hours, and then to FIV and CIV. Those oocytes of the treatments 3, 4, 5 and 6 were frozen in a solution containing 1.8 mol L-1 ethylene glycol (EG) in Talp-Hepes (base medium) added with 0.4% BSA-V by the conventional method. The oocytes were dehydrated by immersion into three solutions (phases) at increasing concentrations of the cryoproctetor, (0.6; 1.2 and 1.8 mol L-1 of EG) during a maximum permanence time of five minutes for each phase, at environmental temperature. Thawing was accomplished by immersion into water bath at 30oC for 20 seconds. Later, the oocytes were rehydrated at three stages, that is, 0.9 mol L-1 EG + 0.3 mol L -1 sucrose, 0.3 mol L-1 sucrose, and without both EG and sucrose for six minutes each one. After thawing, the oocytes recovery rates were 92.6, 97.5, 96.6 and 93,2% for the treatments 3, 4, 5 and 6, respectively. In relation to the recovered oocytes, the following were also found: a cytoplasm withdrawal rate of 3.3, 0.8, 0.3 and 6.2%, and a cellular content loss of 2.2, 13.1, 3.8 and 16.1%, also for treatments 3, 4, 5 and 6, respectively. The frozen immature oocytes presented a maturation rate of 9.2 and 5.8% (treatments 3 and 4, respectively); these results were much inferior to those obtained by the fresh oocytes, that is, 82.5 (T1) and 75.4% (T2). The fecundation rates were 56.2, 0.0, 38.7, 8.6, 63.6 and 16.7%, while the clivage rates were 36.3, 7.9, 0.4, 0.0, 0.0, and 0.0% for treatments 1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively. Only the unfrozen and no-naked oocytes (T1) exhibited development of morula and blastocyst (34.5%), after fecundation. These results point out that the adopted freezing protocols affected the viability of the oocytes. / Este estudo objetivou avaliar os efeitos da criopreservação pelo método convencional em ovócitos imaturos e maturados in vitro. O experimento foi conduzido no Laboratório de Reprodução Animal - DVT-UFV, utilizando-se ovócitos provenientes de ovários de vacas abatidas em matadouro e distribuídos aleatoriamente em seis tratamentos. Tratamento 1 (T1): ovócitos não congelados (frescos) providos de células do cumulus oophorus (COC), os quais foram imediatamente submetidos à MIV, FIV e CIV. Tratamento 2 (T2): ovócitos não congelados (frescos) e desprovidos de células do cumulus oophorus (desnudados), os quais foram imediatamente submetidos ao MIV, FIV e CIV. Tratamento 3 (T3): ovócitos imaturos, providos de células do cumulus oophorus, submetidos à criopreservação imediatamente após a seleção. Posteriormente, esses ovócitos foram descongelados e aqueles considerados normais foram submetidos à MIV, FIV e CIV. Tratamento 4 (T4): ovócitos desnudados e submetidos à criopreservação. Posteriormente, foram descongelados e aqueles considerados normais foram submetidos à MIV, FIV e CIV. Tratamento 5 (T5): ovócitos providos de células do cumulus oophorus, maturados in vitro e, em seguida, congelados. Posteriormente, foram descongelados e aqueles considerados normais foram submetidos ao recultivo em meio de maturação por duas horas e, então, submetidos à FIV e CIV. Tratamento 6 (T6): ovócitos desnudos, maturados in vitro e, posteriormente, submetidos a criopreservação. Após a descongelação, os considerados normais foram submetidos ao recultivo por duas horas seguido de FIV e CIV. A congelação dos ovócitos dos tratamentos 3, 4, 5 e 6 foi realizada em solução contendo 1,8 mol L-1 de etileno glicol (EG) em Talp-Hepes (meio base) acrescido de 0,4% de BSA-V, utilizando-se o método convencional. Os ovócitos foram desidratados por imersão em três soluções (etapas), contendo concentrações crescentes do crioprotetor, (0,6; 1,2 e 1,8 mol L-1 de EG) sendo o tempo de permanência máxima de cinco minutos em cada etapa, em temperatura ambiente. A descongelação foi realizada por imersão em banho-Maria a 30oC por 20 segundos. Posteriormente, os ovócitos foram reidratados em três etapas (0,9 mol L-1 de EG + 0,3 mol L 1 de sacarose; 0,3 mol L-1 de sacarose, e sem EG e sem sacarose), com duração de seis minutos cada uma. Após a descongelação foram recuperados 92,6, 97,5, 96,6 e 93,2%, dos ovócitos dos tratamentos 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Em relação aos ovócitos recuperados, verificou-se uma taxa de citoplasma retraído de 3,3; 0,8; 0,3 e 6,2% e perda de conteúdo celular de 2,2; 13,1; 3,8 e 16,1%, também para os tratamentos 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Os ovócitos congelados imaturos apresentaram taxa de maturação de 9,2 e 5,8% (tratamentos 3 e 4, respectivamente), resultados estes bem inferiores aos obtidos para os ovócitos frescos, sendo 82,5 (T1) e 75,4% (T2). Foram encontradas taxas de fecundação de 56,2; 0,0; 38,7; 8,6; 63,6 e 16,7% e de clivagem de 36,3; 7,9; 0,4; 0,0; 0,0 e 0,0%, para os tratamentos 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Somente os ovócitos não congelados e não desnudados (T1) apresentaram desenvolvimento para mórulas e blastocistos (34,5%), após a fecundação. Estes resultados indicam que o protocolo de congelação adotado comprometeu a viabilidade do ovócito.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.