Strukturaufklärung gehört zu den wichtigsten Gebieten der Grundlagenforschung, da sie direkte Einblicke in biologische Systeme und ihre Mechanismen liefert. Der NMR Spektroskopie kommt dabei eine besondere Bedeutung zu, denn sie ermöglicht Forschung unter physiologischen Bedingungen. Dementsprechend ist die Entwicklung neuer Techniken zur Verbesserung dieser Methode weiterhin ein zentrales Forschungsgebiet.
Paramagnetische Markierung von Biomolekülen ermöglicht die Bestimmung von NMR Parametern, wie z.B. residuale dipolare Restkopplungen (RDCs) oder Pseudokontaktverschiebungen (PCSs), die für die Strukturaufklärung wertvolle Winkel- und Abstandsinformationen über das Zielmolekül beinhalten. In diesem Zusammenhang wurden Lanthanoidionen-koordinierende Tags entwickelt und erfolgreich an Proteinen angebracht. Durch die paramagnetischen Eigenschaften der Lanthanoidionen wird eine partielle Ausrichtung des Zielmoleküls im Magnetfeld des NMR Spektrometers induziert und somit das Messen residualer dipolarer Kopplungen ermöglicht. Zusätzlich werden die NMR Signale durch eine Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen dem Lanthanoidion und den Kernen verschoben (PCS). In der konventionellen NMR Spektroskopie werden diese Effekte, aufgrund der Brownschen Molekularbewegung und dem Fehlen eines Metallions, nicht beobachtet.
In der Fachliteratur ist ein Transfer dieser Methode auf Oligonukleotide nicht bekannt, obwohl DNA und RNA zu den wichtigsten Biomolekülen überhaupt zählen. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des kürzlich entwickelten Cys-Ph-TAHA Tags ein Protokoll zur Bestimmung von paramagnetischen Effekten in der DNA entwickelt. Dafür wurde eine modifizierte Nukleobase synthetisiert, die eine passende Bindungsstelle für den Tag aufweist. Mit der neu entwickelten Methode wurden zwei paramagnetische und eine diamagnetische Referenzprobe hergestellt.
Mittels hochauflösender NMR Spektroskopie konnten paramagnetisch-induzierte PCSs und RDCs gemessen werden. Die Auswertung zeigte eine hohe Qualität der gemessenen PCSs in beiden paramagnetischen Proben. Die RDCs wiesen einen signifikanten Fehler auf. Die in der NMR Spektroskopie übliche Isotopenmarkierung (13C/15N) ist bei im DNA-Synthesizer hergestellten Oligonukleotiden auf Grund der teuren Ausgangsmaterialien nicht möglich, sodass die hergestellten NMR Proben eine natürliche Isotopenhäufigkeit aufwiesen. In den NMR Spektren zur Bestimmung der RDCs ist damit das Verhältnis von Signal-zu-Rausch relativ niedrig, was zusammen mit der paramagnetischen Relaxationsverstärkung zu einem größeren Messfehler führt. Dennoch konnten die erhaltenen paramagnetischen Daten mit einem Ensemblemodell beschrieben werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der paramagnetischen Markierung erfolgreich auf die Stoffklasse der Oligonukleotide übertragen. Dabei wurde ein reproduzierbares Protokoll entwickelt, mit dem eine Bindungsstelle in einen DNA Strang eingebaut und das Zielmolekül anschließend mit dem Cys-Ph-TAHA Tag markiert wurde. Die erfolgreiche Anwendung der Methode konnte durch die erhaltenen paramagnetischen Messwerte von hoher Qualität verifiziert werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-goettingen.de/oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0022-5F9C-9 |
| Date | 16 January 2015 |
| Creators | Täubert, Sebastian |
| Contributors | Griesinger, Christian Prof. Dr. |
| Source Sets | Georg-August-Universität Göttingen |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis |
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