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Previous issue date: 2018-06-28 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The Amazon region has an immense Biodiversity of aquatic ecosystems of the planet and
several biochemical pathways in these aquatic ecosystems, acting in the recycling of the
organic carbon, such as the alpha amylase. For this, the objective of this work was to isolate
amylolytic bacteria from Amazonian aquatic ecosystems, selection of a good alpha amylase
producer, cloning and expression of the alpha amylase gene (Amy). In order to isolate the
colony forming units (CFUs) and to identify the qualitative and quantitative amylolytic
enzyme activity, besides cloning the AMYKOR gene of the alpha amylase and expressing it
in E. coli. The water samples were collected in the Negro, Solimões and Mamori rivers, and
later, clones with the ability to hydrolyze starch were identified. It was then extracted from
the total DNA of the amylolytic bacteria for amplification of the Ribosomal 16 S RNA and
alpha-amylase genes for molecular taxonomic identification. Sequence analysis showed that
Bacillus koreensis was the best producer of alpha-amylase. Subsequently, sequences of the
alpha amylase gene were sent to the chemical synthesis, which was subsequently cloned and
expressed in E. coli. B. koreensis and the recombinant alpha-amylase producing E. coli clone
were cultured in 50 ml LB medium with shaking at 30 °C and 37 °C respectively. Cells were
removed by slow speed centrifugation and the enzymes from supernatants precipitated with
50% ethanol, recovering a total of 106 units of alpha amylase (recombinant) and 120 units
of wild alpha amylase from Bacillus koreensis). The results of the biochemical
characterization showed that both the natural and the recombinant enzyme presented
optimum pH equal to 6 and optimum temperature of 60 °C, for both enzymes studied. We
verified the parameters of apparent enzyme kinetics of Km of 4.8 mg / mL and the apparent
maximum rate of 2.6 mg-1. mL-1. minute-1 of the recombinant alpha amylase, as well as
apparent enzyme kinetics parameters of apparent Km of 4.0 mg / ml and the apparent
maximum rate of 2.3 mg-1. mL-1. minute-1 of the wild-type alpha amylase from Bacillus
koreensis. It can be seen that both natural and recombinant alpha amylase exhibited optimum
temperatures, optimum pHs and similar kinetic parameters. These parameters indicate that
the enzyme has potential for industrial use. / A região amazônica possui uma imensa Biodiversidade de ecossistemas aquáticos do planeta
e várias vias bioquímicas nestes ecossistemas aquáticos, atuando na reciclagem do carbono
orgânico, tal como, a alfa amilase. Para isto, o objetivo deste trabalho foi isolar bactérias
amilolíticas dos ecossistemas aquáticos da Amazônia, seleção de um bom produtor de alfa
amilase, clonagem e expressão do gene da alfa amilase (Amy). Com o propósito de isolar as
unidades formadoras de colônias (UFC’s) e identificar a atividade enzimática amilolítica
qualitativa e quantitativa, além de, clonar o gene AMYKOR da alfa amilase e expressar em
E. coli. A mostras de água foram coletadas nos rios Negro, Solimões e o Mamori, e
posteriormente, foram identificados clones com a capacidade de hidrolisar amido. A seguir,
foi extraído do DNA total das bactérias amilolíticas para amplificação dos genes de RNA
Ribossomal 16 S e do gene de alfa-amilase para identificação taxonômica molecular. As
análises das sequências mostraram ser Bacillus koreensis o isolado melhor produtor de alfaamilase.
Subsequentemente, foi enviado para a síntese química a sequências do gene alfa
amilase, que posteriormente, foi clonado e expresso em E. coli. O B. koreensis e o clone
recombinante de E. coli produtores de alfa-amilase foram cultivados em 50 mL meio LB
com agitação a 30ºC e 37ºC respectivamente. A células foram retiradas por centrifugação a
baixa velocidade e as enzimas dos sobrenadantes precipitadas com etanol 50%, recuperandose
um total de 106 unidades de alfa amilase (recombinante) e 120 unidades de alfa amilase
selvagem de Bacillus koreensis). Os resultados da caracterização bioquímica mostraram que
tanto a enzima natural como a recombinante apresentaram pH ótimo igual a 6 e temperatura
ótima de 60 °C, para ambas as enzimas estudadas. Verificamos os parâmetros da cinética
enzimática aparente de Km de 4,8 mg/mL e a velocidade máxima aparente de 2,6 mg-1 . mL-
1 . minuto-1 da alfa amilase recombinante, bem como, os parâmetros da cinética enzimática
aparentes de Km aparente de 4,0 mg/mL e a velocidade máxima aparente de 2,3 mg-1 . mL-1
. minuto-1 da alfa amilase selvagem do Bacillus koreensis. Pode-se verificar que tanto a alfa
amilase natural como a recombinante apresentaram temperaturas ótimas, pHs ótimos e
parâmetros cinéticos similares. Esses parâmetros indicam que a enzima tem potencial para
uso industrial.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/6674 |
| Date | 28 June 2018 |
| Creators | Neves, Rogério de Oliveira, 92-98238-4124 |
| Contributors | ppgbiotec@ufam.edu.br, Astolfi Filho, Spartaco |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
| Relation | 1984485651082134923, 500 |
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