SH3-Domänen sind Proteinmodule, die über die Erkennung prolinreicher Peptidsequenzen Protein-Protein-Interaktionen in einer Vielzahl von zellulären Prozessen vermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurde die Erkennung von Peptidliganden durch ausgewählte SH3–Domänen hinsichtlich Selektivität versus Promiskuität untersucht. Diese Arbeiten dienten als Vorversuche für einen kompletten proteomischen Ansatz aller SH3-Domänen aus S. cerevisiae. Für die vier ausgewählten SH3-Domänen, nämlich Myo5, Abp1, Yhr016 und Rvs167, wurden die Ligandenpräferenzen durch Interaktionsanalysen mit einem vollständigen Satz prolinreichen Peptidliganden, abgeleitet aus dem Hefeproteom ermittelt. Hierzu wurde ein Peptid–Array Ansatz gewählt. Mit der SPOT-Technologie wurden 2953 15mere Peptide als Array auf einem Celluloseträger Schritt für Schritt synthetisiert. Hierfür wurde zuerst die Art des Celluloseträgers festgelegt und anschließend überprüft, ob sich ein Array mehrmals in Interaktionsexperimenten verwenden lässt. Es zeigte sich, dass eine Regeneration der Arrays nicht möglich war, so dass für jedes Interaktionsexperiment ein neues Peptidarray synthetisiert werden musste. Die Interaktionsstudien bestätigten die Bindung prolinreicher Sequenzmotive als eine universelle Eigenschaft der vier SH3-Domänen, wobei die einzelnen SH3–Domänen-Peptid-Interaktionen von zusätzlichen, spezifitätsdetermierenden Resten im Liganden abhängig waren. Darüber hinaus zeigten die Experimente deutliche Unterschiede hinsichtlich Selektivität und Promiskuität im Erkennungsverhalten der vier Domänen. Die Domänen konnten nach steigender Selektivität an Hand der Bestimmung von Grenzwerten und Integralen geordnet werden, nämlich Myo5 < Abp1 < Yhr016 < Rvs167. Ein gemeinsamer Ligand für alle vier Domänen konnte nicht identifiziert werden. Dagegen konnten gemeinsame Liganden für die Domänenpaare Myo5/Abp1 und Yhr016/Rvs167 bestimmt werden. Die Bindungspräferenzen zweier ausgewählter Liganden, dem Myo5/Abp1 Liganden ERPKRRAPPPAPKKP und dem Yhr016/Rvs167 Liganden VQQDSLPKLPFRSWG, wurden mit Hilfe von Substitutions- und Längenanalysen detailliert charakterisiert. Es zeigte sich deutlich, dass die selektiveren SH3-Domänen Yhr016 und Rvs167 einen klar definierten und kurzen Konsensus im Liganden binden, hingegen die mehr promiskuitiven Domänen Myo5 und Abp1 ein stärker variables und längeres Motiv im Liganden erkennen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die hier gewählte Methode geeignet ist, die proteomische Charakterisierung aller dreißig Hefe SH3-Domänen in Angriff zu nehmen. / SH3-Domains are protein modules, which recognize polyproline sequences. The Domains are involved in a variety of cellular processes. The recognition rules between peptide ligands and selected SH3-Domains were analysed in respect of selectivity versus promiscuity. This dissertation is a preliminary test for subsequent scanning the whole number of yeast SH3-Domains. The SH3-Domains Myo5, Abp1, Yhr016 and Rvs167 were selected and chosen for interaction with all yeast polyproline ligands. A peptide array was chosen and built up with SPOT-Synthesis. 2953 15-mere peptides were spotted as an array on a cellulose membrane and inspected for regeneration method. The regeneration failed and therefore four arrays were synthesised. The scanning experiments revealed an interaction between Ligand and Domain with a common polyproline core. However, these experiments demonstrated as well that specific residues were needed for operative ligand domain interaction. In addition, these four SH3-Domains exhibited clear differences in selectivity and promiscuity of recognition profiles. The integrals and the results after the setting of the threshold showed a distinct increase in selectivity. The arrangement was based on the increasing selectivity: 1. Myo5 2. Abp1 3. but cases of consistency were found between Abp1- and Myo5-SH3, as well as ligands between Yhr16- and Rvs167-SH3. The Myo5-/Abp1-Ligand ERPKRRAPPPAPKKP and the Yhr016-/Rvs167 ligand VQQDSLPKLPFRSWG were selected for characterisation of the peptide domain interaction through the analysis of substitution and length. The data showed that more selective Domains like Yhr016 and Rvs167 had a well-defined and short consensus, whereas more promiscuous Domains like Yhr016 and Rvs167 showed a mutable and longer consensus. In conclusion, the data showed that the SPOT-Synthesis is a suitable technique for a proteomic characterisation of the whole 30 yeast SH3-Domains.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16019 |
| Date | 21 November 2005 |
| Creators | Dröseler, Christoph |
| Contributors | Schneider, E., Volk, H.-D., Kamradt, Th. |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
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