SH3-Domänen sind Proteinmodule, die über die Erkennung prolinreicher Peptidsequenzen Protein-Protein-Interaktionen in einer Vielzahl von zellulären Prozessen vermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurde die Erkennung von Peptidliganden durch ausgewählte SH3–Domänen hinsichtlich Selektivität versus Promiskuität untersucht. Diese Arbeiten dienten als Vorversuche für einen kompletten proteomischen Ansatz aller SH3-Domänen aus S. cerevisiae. Für die vier ausgewählten SH3-Domänen, nämlich Myo5, Abp1, Yhr016 und Rvs167, wurden die Ligandenpräferenzen durch Interaktionsanalysen mit einem vollständigen Satz prolinreichen Peptidliganden, abgeleitet aus dem Hefeproteom ermittelt. Hierzu wurde ein Peptid–Array Ansatz gewählt. Mit der SPOT-Technologie wurden 2953 15mere Peptide als Array auf einem Celluloseträger Schritt für Schritt synthetisiert. Hierfür wurde zuerst die Art des Celluloseträgers festgelegt und anschließend überprüft, ob sich ein Array mehrmals in Interaktionsexperimenten verwenden lässt. Es zeigte sich, dass eine Regeneration der Arrays nicht möglich war, so dass für jedes Interaktionsexperiment ein neues Peptidarray synthetisiert werden musste. Die Interaktionsstudien bestätigten die Bindung prolinreicher Sequenzmotive als eine universelle Eigenschaft der vier SH3-Domänen, wobei die einzelnen SH3–Domänen-Peptid-Interaktionen von zusätzlichen, spezifitätsdetermierenden Resten im Liganden abhängig waren. Darüber hinaus zeigten die Experimente deutliche Unterschiede hinsichtlich Selektivität und Promiskuität im Erkennungsverhalten der vier Domänen. Die Domänen konnten nach steigender Selektivität an Hand der Bestimmung von Grenzwerten und Integralen geordnet werden, nämlich Myo5 < Abp1 < Yhr016 < Rvs167. Ein gemeinsamer Ligand für alle vier Domänen konnte nicht identifiziert werden. Dagegen konnten gemeinsame Liganden für die Domänenpaare Myo5/Abp1 und Yhr016/Rvs167 bestimmt werden. Die Bindungspräferenzen zweier ausgewählter Liganden, dem Myo5/Abp1 Liganden ERPKRRAPPPAPKKP und dem Yhr016/Rvs167 Liganden VQQDSLPKLPFRSWG, wurden mit Hilfe von Substitutions- und Längenanalysen detailliert charakterisiert. Es zeigte sich deutlich, dass die selektiveren SH3-Domänen Yhr016 und Rvs167 einen klar definierten und kurzen Konsensus im Liganden binden, hingegen die mehr promiskuitiven Domänen Myo5 und Abp1 ein stärker variables und längeres Motiv im Liganden erkennen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die hier gewählte Methode geeignet ist, die proteomische Charakterisierung aller dreißig Hefe SH3-Domänen in Angriff zu nehmen. / SH3-Domains are protein modules, which recognize polyproline sequences. The Domains are involved in a variety of cellular processes. The recognition rules between peptide ligands and selected SH3-Domains were analysed in respect of selectivity versus promiscuity. This dissertation is a preliminary test for subsequent scanning the whole number of yeast SH3-Domains. The SH3-Domains Myo5, Abp1, Yhr016 and Rvs167 were selected and chosen for interaction with all yeast polyproline ligands. A peptide array was chosen and built up with SPOT-Synthesis. 2953 15-mere peptides were spotted as an array on a cellulose membrane and inspected for regeneration method. The regeneration failed and therefore four arrays were synthesised. The scanning experiments revealed an interaction between Ligand and Domain with a common polyproline core. However, these experiments demonstrated as well that specific residues were needed for operative ligand domain interaction. In addition, these four SH3-Domains exhibited clear differences in selectivity and promiscuity of recognition profiles. The integrals and the results after the setting of the threshold showed a distinct increase in selectivity. The arrangement was based on the increasing selectivity: 1. Myo5 2. Abp1 3. but cases of consistency were found between Abp1- and Myo5-SH3, as well as ligands between Yhr16- and Rvs167-SH3. The Myo5-/Abp1-Ligand ERPKRRAPPPAPKKP and the Yhr016-/Rvs167 ligand VQQDSLPKLPFRSWG were selected for characterisation of the peptide domain interaction through the analysis of substitution and length. The data showed that more selective Domains like Yhr016 and Rvs167 had a well-defined and short consensus, whereas more promiscuous Domains like Yhr016 and Rvs167 showed a mutable and longer consensus. In conclusion, the data showed that the SPOT-Synthesis is a suitable technique for a proteomic characterisation of the whole 30 yeast SH3-Domains.

Src family kinases (SFKs) are key regulators of cell proliferation, differentiation, and survival. The expression of these non-receptor tyrosine kinases is strongly correlated with cancer development and tumor progression. Thus, this family of proteins serves as an attractive drug target. The activation of SFKs can occur via multiple signaling pathways, yet many of them are poorly understood. Here, we summarize the current knowledge on G protein-coupled receptor (GPCR)- mediated regulation of SFKs, which is of considerable interest because GPCRs are among the most widely used pharmaceutical targets. This type of activation can occur through a direct interaction between the two proteins or be allosterically regulated by arrestins and G proteins. We postulate that a rearrangement of binding motifs within the active conformation of arrestin-3 mediates Src regulation by comparison of available crystal structures. Therefore, we hypothesize a potentially different activation mechanism compared to arrestin-2. Furthermore, we discuss the probable direct regulation of SFK by GPCRs and investigate the intracellular domains of exemplary GPCRs with conserved polyproline binding motifs that might serve as scaffolding domains to allow such a direct interaction. Large intracellular domains in GPCRs are often understudied and, in general, not much is known of their contribution to different signaling pathways. The suggested direct interaction between a GPCR and a SFK could allow for a potential immediate allosteric regulation of SFKs by GPCRs and thereby unravel a novel mechanism of SFK signaling. This overview will help to identify new GPCR–SFK interactions, which could serve to explain biological functions or be used to modulate downstream effectors.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Protein-protein interactions are an integral component of signal transduction pathways. The interactions are mediated by modular domains which are present within the structure of the signalling molecule. These domains include PDZ, SH2, SH3, WW, PTB and LIM domains. hPTP1E is a protein-tyrosine phosphatase which contains within its primary structure a region with homology to Band 4.1 proteins, five PDZ domains and a catalytic domain. While the function of this PTPase remains unknown, the structure of hPTP1E suggest it may recruit several proteins into a multiprotein complex. In order to understand the role of hPTP1E, the protein interactions within its signalling cascade were examined. hPTP1E interacts with ZRP-1 and GEF-5.1 via its second PDZ domain and tuberin via its fourth PDZ domain in the yeast two-hybrid system. In order to characterize these proteins and their interactions, antibodies were generated against ZRP-1 and GEF-5.1. The antibodies which detected the antigen expressed in bacteria were purified by affinity chromatography. The antibodies raised against ZRP-1 and hPTP1E detected proteins of appropriate molecular weights in total cell extracts. HPTP1E is ubiquitously expressed whereas ZRP-1 is restricted to HeLa and MCF-7 cells among the cells tested. Unfortunately, antibodies against GEF-5.1 did not detect a protein of the predicted molecular weight in any of the cell extracts. Immunoprecipitation of hPTP1E fi-om cells overexpressing regions of ZRP-1 and tuberin with a hemaglutinin tag demonstrated the presence of an interaction between the phosphatase and tuberin in vivo. However, ZRP-1 and hPTP1E did not interact under these experimental conditions. Confirmation of the yeast two-hybrid results provides further support for a possible role of hPTP1E in the regulation of endocytosis. Additional molecules involved in the signalling pathways involving hPTP1E were identified by interaction trap. In one study, the proline rich amino terminus of ZRP-1 interacted with several clones encoding a segment of hCDC47 and NtZRP-p33, a clone containing an SH3 domain. The significance of these findings is unknown. HCDC47 is a minichromosome maintenance protein wich regulate DNA replication. Further, a clone called KIAA0769 containing the sequence of NtZRP-p33 depicts the typical structure for a scaffolding protein. Another yeast-two hybrid cDNA library screening using the CDC25 homology domain of GEF-5.1 did not detect an interaction with any GTPase but with 14-3-3E. 14-3-3 proteins are regulatory molecules which interact with various types of proteins by means of a phosphorylated serine residue. Mutational analysis demonstrated that the interaction is dependent on the second serine residue within the consensus sequence RSLSQG found in GEF-5.1. The primary structure of the open reading frame of GEF-5.1 was analyzed using profilescan. The software predicted the presence of several domains including a cNMP binding domain, a LTE domain, a PDZ domain, a rasassociated domain and a CDC25 homology domain. A family of guanidine nucleotide exchange factors may exist as clones KIAA0313 and T14G10 have the same structure. These results indicate a role for GEF-5.1 in Ras signalling pathways. Further, its activity may be regulated by the binding of cNMP molecules and 14-3-3E. The identification of ZRP-1 and GEF-5.1 interacting proteins as well as the analysis of the primary structure of GEF-5.1 have provided additional information about the function of hPTP1E. This cytoplasmic phosphatase may be involved in the regulation of processes such as transcription, DNA replication and. Further, an interaction between tuberin and hPTP1E suggests a role for this PTPase in the regulation of endocytosis. / La phosphorylation des protéines est une modification post-traductionelle fréquemment employée pour moduler la transmission des signaux intracellulaires. Il est nécessaire qu'un équilibre du niveau de phosphorylation soit maintenu pour le fonctionnement normal de la cellule sinon des maladies comme le cancer peuvent apparaître. Les enzymes responsables de la phosphorylation des protéines sont les protéines kinases tandis que les protéines phosphatases enlèvent les groupements phosphate. Les résidus phosphorylés dans les protéines sont certains résidus sérines, thréonines et/ou tyrosines. Les différentes enzymes sont classées en deux familles selon leur spécificité. Les protéine-tyrosine phosphatases (PTPase) sont elles-même regroupées dans deux familles selon leur localisation intracellulaire: les PTPases de type récepteur et les phosphatases cytoplasmiques. La structure des phosphatases de type récepteur inclus un domaine extracellulaire, un domaine transmembranaire et un (ou deux) domaine(s) catalytique(s). Les PTPases cytoplasmiques contiennent un domaine catalytique unique et généralement un/ ou des domaine(s) responsable(s) de leur localisation intracellulaire ou impliqué(s) dans des interactions protéine-protéine. Dans notre laboratoire, une phosphatase cytoplasmique dénommée liPTP1E par nous (et PTPL1, PTPBAS, FAP par d'autres) a été isolée. En plus de son domaine catalytique, cette protéine-tyrosine phosphatase contient 1 domaine de type "Band 4.1" qui est impliqué dans la localisation de la protéine à la membrane cellulaire via une interaction avec le cytoskelette, et 5 domaines PDZ. Ces domaines PDZ sont en général impliqués dans les interactions protéineprotéine. Plusieurs études récentes ont tenté de définir la fonction de hPTP1E. Sato et ses collègues ont isolé hPTP1E lors d'un criblage d'une librairie d'ADNc en utilisant le système des deux-hybrides dans la levure avec la partie cytoplasmique du récepteur Fas, comme appât. Ils ont aussi démontré que hPTP1E peut inhiber l'effet apoptotique de Fas. L'apoptose des cellules cibles qui est induit par les lymphocytes T cytotoxiques utiliserait le système Fas. De plus, Fas pourrait être associé à des maladies auto-immunes. En plus, hPTP1E pourrait jouer un rôle dans l'apparition de cellules resistantes aux effets de Fas tel que retrouvées dans les sarcomes de Kaposi chez les sidéens. Malgré des données convaincantes, il reste quand même des doutes quant à l'importance de hPTP1E dans ces maladies. Ainsi une étude publiée n'a pu démontrer une interaction entre les homologues de Fas et hPTP1E chez la souris. Depuis d'autres groupes étudiant les interactions de hPTP1E ont découvert plusieurs protéines qui interagissent avec celle-ci. La première, PARG, est membre de la famille des Rho-GAP, des protéines impliquées dans l'activation des GTPases de type Rho. L'interaction aurait lieu avec le 4ième domaine PDZ de hPTP1E. De plus, le domaine LEVI de RIL interagirait avec hPTP1E via ses 2ième et 4ième domaines PDZ. La fonction biologique de ces interactions n'a toutefois pas été déterminée à ce jour. Pour caractériser la fonction biologique de hPTP1E, nous avons utilisé le système des deux-hybrides de la levure pour identifier des protéines qui interagiraient avec les domaines PDZ de hPTP1E. J'ai ainsi identifié deux protéines nommés ZRP-1 et GEF-5.1, qui se lient à hPTP1E. ZRP-1 possède une structure semblable à celle de zyxin.Ces deux dernières protéines contiennent une région amino-terminale riche en résidus proline et 3 domaines de type LEM à l'extrémité carboxyl terminale. GEF-5.1, d'autre part démontre une homologie marquée aux GEFs de la famille CDC25 impliquées dans l'activation des GTPases de la famille Ras. Des anticorps ont été générés contre ZRP-1, GEF-5.1 et hPTP1E afin de fournir les outils nécessaires pour mieux caractériser ces différentes protéines. Ainsi, j'ai exprimé et purifié le troisième domaine LIM de ZRP-1 ainsi que le domaine PDZ de GEF-5.1, sous forme de protéines de fusion avec la glutathioneS-transferase (GST). Ces protéines ont servis d'antigène pour générer des anticorps chez le lapin. Des anticorps dirigés contre le deuxième domaine PDZ de hPTP1E étaient déja disponibles dans le laboratoire. Ces anticorps ont été purifiés sur une colonne d'affinité GST. Les anticorps anti-ZRP-1 et anti-hPTP1E détectent tous les deux des protéines du poids moléculaire attendu. HPTP1E est exprimé d'une facon ubiquitaire tandis que l'expression de ZRP-1 est plus restrainte parmi les cellules testées. Toutefois, les immunoglobulines dirigées contre GEF-5.1 ne détectent aucune protéine du poids moléculaire attendu dans un extrait cellulaire brut. Parallèlement, d'autres membres du laboratoire ont démontré une interaction entre la tuberine, le produit du gène TSC2, un oncogène impliqué dans la sclérose tubéreuse, et le quatrième domaine PDZ de hPTP1E. Afin de caractériser ces interactions in vivo, des immunoprécipitations de hPTP1E à partir de cellules dans lesquelles une région de ZRP-1 et/ou de la tuberine étaient surexprimé ont été conduites. Sous les conditions expérimentales utilisées, ZRP-1 n'a pas co-immunoprécipité avec hPTP1E. Cependant une interaction avec la tuberine a été détectée utilisant cette stratégie suggérant que HPTP1E pourrait jouer un rôle dans la modulation de l'endocytose. La structure de ZRP-1 inclus un domaine riche en proline qui n'est pas nécessaire pour son interaction avec hPTP1E mais qui pourrait interagir avec d'autres protéines en particulier avec des protéines contenant un/ ou des domaine(s) SH3. La moitié amino-terminale de ce domaine a été utilisé pour cribler une librairie d'ADNc par le système des deux-hybrides. Un clone appelé NtZRP-p33 contenant un domaine SH3 a été identifié. La conséquence biologique de cette interaction reste toutefois a être déterminée. Cependant, NtZRP-p33 possède une structure suggérant son implication dans la signalisation intracellulaire. Un deuxième criblage de la librairie d'ADNc a été initié pour caractériser les protéines impliquées dans le mécanisme de signalisation de hPTP1E. En utilisant le domaine de GEF-5.1 homologue à CDC25, des clones correspondants à la protéine 14-3-3 ont été isolés. Les protéines 14-3-3 forment une famille de protéines qui régularisent la fonction de plusieurs protéines. Leurs interactions se font via un residu sérine qui est phosphorylé. Des mutations du domaine catalytique ont démontré que l'interaction entre 14-3-3s et GEF-5.1 est dépendante du deuxième sérine de la séquence RSLSQG qui se retrouve immédiatement du coté carboxyl terminale du domaine GEF de la protéine GEF-5.1. Ces résultats suggèrent que l'activité de GEF-5.1 pourrait être modulée par la 14-3-38. En conclusion, les résultats expérimentaux présentés dans ce mémoire indique un rôle potentiel de hPTP1E dans plusieurs fonctions cellulaires. En s'associant à la tuberine, hPTP1E pourrait régulariser l'endocytose. Aussi, cette PTPase pourrait être impliquer dans le cycle cellulaire. Ras étant un activateur de la mitose, HPTP1E pourrait moduler l'activité de Ras par voie de GEF-5.1. Ainsi, hPTP1E pourrait agir comme proto-oncogène ou un gène suppresseur des tumeurs. Zyxin est une protéine qui se retrouve près des sites membranaires en association avec le cytoskelette. Puisque la structure de ZRP-1 et zyxin est semblable, ce dernier sert de modèle pour la fonction de ZRP-1. En collaboration avec hPTP1E, ces deux protéines pourrait régulariser la structure du cytoskelette.