L'objectif de cette thèse est de mieux comprendre la régulation de la phase M du cycle cellulaire. Nos expériences ont été effectuées dans des extraits acellulaires d’embryons de Xenopus laevis. Tout d'abord, nous montrons que le moment de l'entrée en phase M est précisément déterminé par un équilibre entre l'activité de la protéine kinase CDK1 et l’activité d’une protéine phosphatase sensible à l'acide okadaïque, PP2A. Nous montrons également le rôle de la protéine CDC6 dans la régulation de l'entrée dans la première phase M embryonnaire. En effet, CDC6 inhibe CDK1 et à travers cette action régule la dynamique de cette kinase lors de l'entrée et de la progression en phase M. Ces résultats mettent en évidence un nouveau contrôle qui précise le moment du clivage embryonnaire. Ce contrôle joue un rôle clé dans la coordination entre les mécanismes de régulation du cycle cellulaire et le programme de développement de l'embryon. / The aim of this thesis is to understand better the regulation of the M-phase of the cell cycle. Experiments were done in cell-free extracts of Xenopus laevis one-cell embryos. Firstly, we show that the timing of the M-phase entry is precisely determined by a balance between the activity of CDK1 kinase and okadaic acid sensitive phosphatase, mainly PP2A. Secondly, we show the role of CDC6 protein in regulation of the entry into the first embryonic M-phase. CDC6 inhibits CDK1 and through this action regulates the dynamic of this kinase upon M-phase entry and during M-phase progression. This mechanism discovered during my PhD allows controlling precisely the timing of embryonic cleavage. This control plays a key role in coordinating the cell cycle regulating machinery and the development program of the embryo.

La malaria est la 1ère parasitose mondiale du fait de son taux de morbidité et de mortalité. Elle est responsable de 198 millions de cas dont 584 000 décès en 2013 (OMS). La forme la plus sévère est due à l’apicomplexe Plasmodium falciparum. Etant donné l’absence d’un vaccin efficace et l’augmentation des résistances aux traitements, il est crucial d’approfondir nos connaissances sur la biologie de P. falciparum afin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Le cycle de vie complexe avec deux hôtes nécessite une régulation précise et dynamique de l’expression des gènes et des modifications post-traductionnelles. Dans ce contexte, il a été montré que les kinases et les phosphatases, impliquées dans les processus de phosphorylation et de déphosphorylation respectivement, jouent un rôle crucial pour la survie du parasite. Chez les eucaryotes, les phosphatases sont impliquées dans la croissance cellulaire, la différentiation et la division. Parmi elles, PP1, une des principales sérine/thréonine phosphatases, est composée d’une sous-unité catalytique (PP1c) et d’une sous-unité régulatrice. Ces régulateurs sont essentiels et confère à PP1 une localisation, une spécificité et une régulation de son activité. La majorité des régulateurs interagissent avec PP1c via différents motifs tel que le motif RVxF. Chez P. falciparum, PP1 (PfPP1c) est exprimée et semble être essentielle au niveau du stade érythrocytaire, en particulier dans la libération des mérozoïtes infectieux. Pour mieux comprendre la fonction de PfPP1c, nous étudions les régulateurs de PP1 chez le parasite. Nos études précédentes nous ont permis de caractériser 3 régulateurs au niveau moléculaire et fonctionnel. Dans ce contexte, nous avons montré que PfLRR1 et PfI2 inhibent l’activité de PP1 alors que PfI3 l’active. Des études de génétique inverse suggèrent que ces régulateurs sont aussi essentiels que la PP1c elle-même. Récemment, nous avons identifié dans le génome de P. falciparum le facteur d’initiation de la traduction de type 2 sous-unité ß (eIF2ß) qui pourrait être un partenaire/régulateur potentiel de PfPP1. Dans la 1ère partie de cette étude, l’objectif principal a été d’étudier la présence de motifs additionnels de fixation à PfPP1c dans PfI2 et leur impact sur sa fonction. En utilisant la RMN, un troisième motif d’interaction FxxR/KxR/K a été identifié. Ce motif a été montré comme agissant de concert avec le motif canonique RVxF. En effet, la mutation des deux motifs abolie complètement l’interaction avec PfPP1. De plus, en utilisant le modèle d’ovocytes de Xénope, nous avons montré que ces motifs sont nécessaires à PfI2 pour réguler l’activité de PP1. Finalement, l’utilisation d’un peptide dérivé du motif d’interaction FxxR/KxR/K de PfI2 a montré une accumulation dans les érythrocytes infectés et un effet anti-plasmodial a été observé. Dans la 2ème partie de cette étude, nous avons étudié eIF2β, un autre régulateur potentiel de PfPP1. Par des expériences de GST pull-down, nous avons montré l’interaction entre PfeIF2β/PfPP1 et deux motifs d’interaction ont été identifiés : RVxF et FxxR/kxR/K. De plus, en utilisant le modèle d’ovocytes de Xénope, nous avons démontré que PfeIF2ß est impliqué dans la transition G2/M, suggérant un rôle inhibiteur sur l’activité de PP1. La mutation d’un des deux motifs n’empêche pas la formation du complexe alors que la mutation des deux abolie l’interaction avec PP1. Afin de déterminer la fonction de PfeIF2ß in vivo chez Plasmodium, des expériences de génétique inverse ont été réalisées. Nous avons montré l’accessibilité au locus du PfeIF2ß par Knock-in et des expériences d’interruption du gène elf2ß chez Plasmodium falciparum et berghei (espèce spécifique aux rongeurs) sont actuellement en cours afin de déterminer l’essentialité de cette protéine dans le développement du parasite. / Malaria is still the most severe infectious disease in the world because of its high rate of morbidity and mortality. Malaria is responsible for 198 million cases among which 584 000 deaths in 2013 (WHO). The most deadly parasite is the Apicomplexa Plasmodium falciparum. Given the lack of efficient vaccine with long-lasting protection and the increase of resistance against current treatments it is crucial to further deepen our understanding the biology of Plasmodium falciparum to find new means of control. The complex life cycle within two hosts necessitates a highly accurate and dynamic regulation of gene expression and of post translational modifications. In this context, it has been shown that kinases and phosphatases, involved in phosphorylation/dephosphorylation processes respectively, play a key role in parasite survival. In eukaryotes, phosphatases have been shown to be involved in cell growth, differentiation and division. Among them, Protein phosphatase type 1 (PP1) has been reported as one of the major serine/threonine phosphatase proteins involved in diverse cellular functions. PP1 is composed of a single catalytic subunit (PP1c) with a capacity to interact with a high number of regulatory subunits. These regulators are essential as they are key players in different roles of PP1c, including its trafficking, activity and specificity. Most of regulators interact with PP1c via several binding motifs including the RVXF motif. In Plasmodium falciparum, PP1c (PfPP1c) is expressed and seems to be essential for blood stage parasite, in particular merozoïte liberation. To better understand the function of PfPP1c, we investigated the regulators of protein phosphatase type I in this parasite. Our earlier studies have characterized three regulators at the molecular and functional levels. In this context, we have shown that PfLRR1 and PfI2 inhibit PP1 activity while PfI3 activates it. Reverse genetic studies suggested that these regulators are as essential as the PP1c itself. Recently, we found in P. falciparum genome the eukaryotic translation initiation factor 2 subunit ß (eIF2ß) which could be a potential partner/regulator of PfPP1. In the first part of this study, the main objective was to further explore in PfI2 the presence of additional motifs of binding to PfPP1c and their impacts on its function. Using NMR spectroscopy, a third motif was identified: FxxR/KxR/K. This motif has been found to act together with the canonical motif RVxF. Indeed, mutations in both motifs abolished completely the interaction with PfPP1. In addition, using Xenopus oocytes model, we showed that both motifs were necessary for PfI2 to regulate the activity of PP1. Finally the use of a peptide spanning the FxxR/KxR/K motif of PfI2 regulator showed an accumulation in infected erythrocytes and an antiplasmodial effect was observed.In the second part, we investigated eIF2ß as a potential regulator of PfPP1. By GST pull-down assays, we have shown the interaction between PfeIF2ß/PfPP1 and two binding motifs were identified : RVxF and FxxR/KxR/K motifs. Moreover, using Xenopus oocytes model, we demonstrated that PfeIF2ß is involved in G2/M transition, suggesting an inhibitor function of PP1 activity. Mutation of one of two motifs did not prevent the interaction while mutation of both abolished this binding. To gain more insights on the function of PfeIF2ß in Plasmodium, reverse genetic experiments were carried out. We have shown the accessibility of PfeIF2ß locus by Knock-in and we are performing Knock-out experiments on Plasmodium falciparum and berghei (specific species of the rodents) to determine the essentiality of this protein for parasite development.

Plasmodium falciparum (Pf) est un parasite intracellulaire capable d’infecter l’Homme. Dans les 48h après l’invasion des érythrocytes, il passe par le stade d’une cellule géante multinucléée qui se divise en 16 à 32 parasites. Cette multiplication rapide nécessite des mécanismes spécifiques de régulation très subtilement orchestrés. Parmi les modifications post-traductionnelles décrites chez les cellules eucaryotes, la phosphorylation réversible des protéines par les kinases/phosphatases est une des voies majeures dans la transduction des signaux cellulaires. Chez Plasmodium, des études de génétique inverse ont démontré que PfPP1, phosphatase majeure du parasite, est essentielle pour sa survie. L’activité de PP1 est connue pour être contrôlée par divers régulateurs endogènes. Cependant, malgré leur importance dans le ciblage de l’holoenzyme à un compartiment subcellulaire spécifique et/ou dans la régulation de son activité, peu de recherches ont été consacrées à l’identification de partenaires de PP1 chez Pf.Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation de PfPP1 et son impact sur la biologie de Pf, nous étudions les partenaires de cette enzyme qui seraient impliqués dans le contrôle de la phosphatase. Nos recherches récentes, basées sur des études de génomique comparative, ont permis d’identifier 4 régulateurs de PfPP1 : PfLRR1, PfI3, PfI2 et PfeiF2β. Au-delà de la capacité de ces protéines à contrôler la fonction de PP1 in vitro, nous avons montré par génétique inverse que leur rôle est vital pour Pf. En parallèle, nous avons entrepris une démarche plus globale pour la recherche de nouveaux partenaires/régulateurs de PfPP1. Nous avons notamment réalisé un criblage par double hybride de levure (Y2H) où PfPP1 est utilisé comme appât.Dans la 1ère partie de ma thèse, nous avons analysé les clones obtenus en criblage Y2H et initié la caractérisation de plusieurs d’entre eux. Notre choix d’étude s’est porté par la suite sur PF3D7_091900 et PF3D7_1202600, retrouvées 8 et 10 fois lors du criblage et présentant une interaction forte avec PP1. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser au niveau moléculaire et fonctionnel le rôle de ces protéines sur l’activité de PP1 et de déterminer les régions/motifs de ces potentiels régulateurs pouvant intervenir au niveau de la relation structure/fonction du complexe qu’ils forment avec PfPP1.Dans une 2ème partie, nous avons étudié la séquence de ces protéines. PF3D7_0919900, protéine spécifique du parasite, possède le motif RVxF, souvent impliqué dans l’interaction avec PP1 et présente des motifs RCC1 connus pour interagir avec des protéines. Ainsi elle sera nommée RCC-PIP pour Regulator of Chromosome Condensation - Phosphatase Interacting Protein. PF3D7_1202600 est, quant à elle, un orthologue de Caliban chez la drosophile, et sera nommée CLP pour Caliban-Like Protein. Elle présente 17 motifs RVxF dont 7 se situent dans le fragment obtenu suite au criblage. Différentes approches ont confirmé que ces 2 protéines sont des partenaires de PfPP1. Cependant, la réalisation d’un test pNPP in vitro a mis en évidence une fonction activatrice de RCC-PIP, alors que CLP ne présente pas d’effet.Dans une 3ème partie, l’objectif était d’étudier plus en détails RCC-PIP. Nous avons démontré que le motif RVxF est impliqué dans l’interaction avec PfPP1. Puis nous avons étudié les motifs RCC1 et leur interactome par la réalisation d’un criblage Y2H en utilisant ces motifs comme appât. Une kinase a été trouvée (PfCDPK7) suggérant que RCC-PIP aurait un rôle de plateforme capable d’interagir avec 2 enzymes antagonistes. L’étude du rôle de RCC-PIP chez le parasite est actuellement en cours. La réalisation d’un knock-in a démontré l’accessibilité du locus. Un knock-out a également été effectué, mais l’absence d’intégration du plasmide indique que RCC-PIP serait essentielle au parasite. Pour confirmer cette observation, un knock-out conditionnel chez P. berghei est en cours de réalisation. / Plasmodium falciparum is an intracellular parasite that evolves in several stages of development in the vertebrate host. Within 48 hours after the invasion of erythrocytes, it goes through the stage of a multinucleated giant cell which divides into as many parasites as nuclei (16-32 parasites). This growth/fast division requires specific regulatory mechanisms subtly orchestrated. Among the post-translational modifications described in eukaryotic cells, the reversible phosphorylation of proteins by kinases/phosphatases is one of the major pathways in the cellular signal transduction. In Plasmodium, PP1 is predicted to catalyze the majority of protein dephosphorylation events, and has been shown to be essential in its survival using reverse genetic approaches. The activity of PP1 is known to be tightly controlled by various endogenous regulators. However, despite their importance in targeting the holoenzyme to a specific subcellular compartment and/or regulating its activity, little has been devoted to identify PP1 partners in the parasite.In order to deepen our understanding of the regulation of PfPP1 and its impact on the biology of Plasmodium, we study the partners of this enzyme that may be involved in the control of its location, its specificity and activity. Our recent research, based on comparative genomic studies, have identified 4 regulators of PfPP1: PfLRR1, PfI3, PfI2 and PfeiF2β. In parallel, since Plasmodium has a particular cell cycle and the function of PP1 should be adapted, we have undertaken a more global approach to the search for new partners/regulators of PfPP1 using different approaches including a yeast two-hybrid screening where PfPP1 was used as bait.In the first part of my thesis, the clones obtained in Y2H screening were analyzed and 2 clones were selected for further characterization. These clones, corresponding to PF3D7_091900 and PF3D7_1202600 were identified 8 and 10 times during the screening, a good indication about their expression in blood stages and their interactions with PfPP1 can be still detectable under high stringency conditions. Hence, my thesis project aimed to characterize molecularly and functionally of the role of these proteins on PfPP1. _x000D_In the second part, we have analysed the sequence of these two proteins. PF3D7_0919900, a parasite-specific protein, shows the canonical binding motif « RVxF », known to be involved in the interaction with PP1, and present on the fragment obtained following the screening. The sequence also has RCC1 motifs known to interact with proteins. Thereafter, this protein was designated as RCC-PIP for Regulator of Chromosome Condensation - Phosphatase Interacting Protein. As far as PF3D7_1202600 is concerned, it seems to be an ortholog of Caliban expressed by Drosophila, and designated Pf Caliban CLP-Like Protein. It has 17 potential RVXF binding motif, of which 7 are located in the fragment obtained following the screening. Different approaches such as GST pull-down or ELISA, identified these two proteins as partners of PfPP1. Using pNPP in vitro assay, we showed a slight activation of PfPP1 by RCC-PIP, while CLP had no effect.In the third part, the objective was to study in more detail the RCC-PIP. We showed that the RVxF motif is involved in the interaction with PfPP1. We then tied to identify the partners of RCC1 by screening a cDNA library of P. falciparum using RCC1 containing protein as bait. We showed that RCC-PIP is able to interact with a kinase (PfCDPK7) suggesting that RCC-PIP may act as a platform since it is able to interact with 2 enzymes with opposed activities. Analysis of the role of RCC-PIP in the parasite is currently underway. The production of a knock-in demonstrated the accessibility of the locus. A knock-out was also carried out, but the lack of integration of the plasmid suggests that RCC-PIP is essential to the parasite. To confirm this observation, a conditional knock-out in P. berghei is in progress.

Ces dernières décennies, la dégradation continue de la qualité des eaux a engendré une augmentation des blooms algaux toxiques en zones côtières. Les biotoxines libérées de façon ubiquitaire lors de ces blooms, représentent un danger épidémique important pour l’homme et l’animal. Afin de limiter les risques de contamination et les pertes économiques, les organismes compétents ont mis en place des programmes de surveillance et ont établi des seuils de toxicité (OMS: 1 µg de MC-LR/L ; EFSA : 160 µg éq OA /kg de chair de coquillage). Cependant, les méthodes d’analyse préconisées sont longues et coûteuses, il est donc nécessaire de développer des nouvelles techniques d’analyse. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de concevoir des outils analytiques rapides, fiables et adaptables sur le terrain afin de détecter la présence des toxines les plus nocives: les microcystines (MCs) et l’acide okadaïque (OA). En premier lieu, des bioessais colorimétriques basés sur l’inhibition des protéines phosphatases par ces toxines ont été développés. Les limites de détection obtenues ont été très inférieures aux limites maximales autorisées. Par conséquence, les tests mis au point sur microplaques ont été adaptés pour élaborer des biocapteurs électrochimiques. Les seuils de sensibilités obtenus sont conformes aux normes imposées et les tests pourront être ainsi utilisés in situ. Du fait de leurs nombreux avantages, les aptamères sont devenus depuis peu des éléments de reconnaissance alternatifs aux anticorps et aux enzymes. Afin d’améliorer la sensibilité et la stabilité des outils proposés, un aptacapteur sans marquage et réutilisable pour la détection de l’OA a été finalement conçu. / The past decades have witnessed water quality degradation due to overwhelming anthropic activities. In this context, production of biotoxins in response to increasing harmful algal blooms is a point of vital concern for human and animal health. In order to overcome bio-contamination and related economic losses, relevant authorities have established toxicity levels and monitoring program for ubiquitous toxins. However, current analysis are expensive and time consuming, so it is necessary to develop fast, reliable and field adaptable methods to assure food and water safety. Based on above described consequences, the objective of the research was to design inexpensive biotools for the detection of most toxic and widespread toxins including: microcystins (MCs) and okadaïc acid (OA).The first approach was to perform colorimetric enzymatic bioassays based on the inhibition of commercial and genetically modified proteins phosphatase by toxins. The obtained detection limit (LOD) were many folds lower than maximum limit defined by WHO (1 µg of MC-LR/L) and EFSA (160 µg eq OA/kg in shellfish meat). Subsequently, developed colorimetric methodology was adapted to design electrochemical biosensors for toxins detection. Electrochemical transduction was performed by Differential Pulse Voltammetry, showed a good LOD with the possibility of being used as a field portable device.With many advantages over antibody and enzyme, aptamers have recently emerged as powerful class of nucleic acids able to recognize specific targets. To further improve the analytical figure of merit, aptamers were used to design reusable label-free biosensors for OA detection.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Protein-protein interactions are an integral component of signal transduction pathways. The interactions are mediated by modular domains which are present within the structure of the signalling molecule. These domains include PDZ, SH2, SH3, WW, PTB and LIM domains. hPTP1E is a protein-tyrosine phosphatase which contains within its primary structure a region with homology to Band 4.1 proteins, five PDZ domains and a catalytic domain. While the function of this PTPase remains unknown, the structure of hPTP1E suggest it may recruit several proteins into a multiprotein complex. In order to understand the role of hPTP1E, the protein interactions within its signalling cascade were examined. hPTP1E interacts with ZRP-1 and GEF-5.1 via its second PDZ domain and tuberin via its fourth PDZ domain in the yeast two-hybrid system. In order to characterize these proteins and their interactions, antibodies were generated against ZRP-1 and GEF-5.1. The antibodies which detected the antigen expressed in bacteria were purified by affinity chromatography. The antibodies raised against ZRP-1 and hPTP1E detected proteins of appropriate molecular weights in total cell extracts. HPTP1E is ubiquitously expressed whereas ZRP-1 is restricted to HeLa and MCF-7 cells among the cells tested. Unfortunately, antibodies against GEF-5.1 did not detect a protein of the predicted molecular weight in any of the cell extracts. Immunoprecipitation of hPTP1E fi-om cells overexpressing regions of ZRP-1 and tuberin with a hemaglutinin tag demonstrated the presence of an interaction between the phosphatase and tuberin in vivo. However, ZRP-1 and hPTP1E did not interact under these experimental conditions. Confirmation of the yeast two-hybrid results provides further support for a possible role of hPTP1E in the regulation of endocytosis. Additional molecules involved in the signalling pathways involving hPTP1E were identified by interaction trap. In one study, the proline rich amino terminus of ZRP-1 interacted with several clones encoding a segment of hCDC47 and NtZRP-p33, a clone containing an SH3 domain. The significance of these findings is unknown. HCDC47 is a minichromosome maintenance protein wich regulate DNA replication. Further, a clone called KIAA0769 containing the sequence of NtZRP-p33 depicts the typical structure for a scaffolding protein. Another yeast-two hybrid cDNA library screening using the CDC25 homology domain of GEF-5.1 did not detect an interaction with any GTPase but with 14-3-3E. 14-3-3 proteins are regulatory molecules which interact with various types of proteins by means of a phosphorylated serine residue. Mutational analysis demonstrated that the interaction is dependent on the second serine residue within the consensus sequence RSLSQG found in GEF-5.1. The primary structure of the open reading frame of GEF-5.1 was analyzed using profilescan. The software predicted the presence of several domains including a cNMP binding domain, a LTE domain, a PDZ domain, a rasassociated domain and a CDC25 homology domain. A family of guanidine nucleotide exchange factors may exist as clones KIAA0313 and T14G10 have the same structure. These results indicate a role for GEF-5.1 in Ras signalling pathways. Further, its activity may be regulated by the binding of cNMP molecules and 14-3-3E. The identification of ZRP-1 and GEF-5.1 interacting proteins as well as the analysis of the primary structure of GEF-5.1 have provided additional information about the function of hPTP1E. This cytoplasmic phosphatase may be involved in the regulation of processes such as transcription, DNA replication and. Further, an interaction between tuberin and hPTP1E suggests a role for this PTPase in the regulation of endocytosis. / La phosphorylation des protéines est une modification post-traductionelle fréquemment employée pour moduler la transmission des signaux intracellulaires. Il est nécessaire qu'un équilibre du niveau de phosphorylation soit maintenu pour le fonctionnement normal de la cellule sinon des maladies comme le cancer peuvent apparaître. Les enzymes responsables de la phosphorylation des protéines sont les protéines kinases tandis que les protéines phosphatases enlèvent les groupements phosphate. Les résidus phosphorylés dans les protéines sont certains résidus sérines, thréonines et/ou tyrosines. Les différentes enzymes sont classées en deux familles selon leur spécificité. Les protéine-tyrosine phosphatases (PTPase) sont elles-même regroupées dans deux familles selon leur localisation intracellulaire: les PTPases de type récepteur et les phosphatases cytoplasmiques. La structure des phosphatases de type récepteur inclus un domaine extracellulaire, un domaine transmembranaire et un (ou deux) domaine(s) catalytique(s). Les PTPases cytoplasmiques contiennent un domaine catalytique unique et généralement un/ ou des domaine(s) responsable(s) de leur localisation intracellulaire ou impliqué(s) dans des interactions protéine-protéine. Dans notre laboratoire, une phosphatase cytoplasmique dénommée liPTP1E par nous (et PTPL1, PTPBAS, FAP par d'autres) a été isolée. En plus de son domaine catalytique, cette protéine-tyrosine phosphatase contient 1 domaine de type "Band 4.1" qui est impliqué dans la localisation de la protéine à la membrane cellulaire via une interaction avec le cytoskelette, et 5 domaines PDZ. Ces domaines PDZ sont en général impliqués dans les interactions protéineprotéine. Plusieurs études récentes ont tenté de définir la fonction de hPTP1E. Sato et ses collègues ont isolé hPTP1E lors d'un criblage d'une librairie d'ADNc en utilisant le système des deux-hybrides dans la levure avec la partie cytoplasmique du récepteur Fas, comme appât. Ils ont aussi démontré que hPTP1E peut inhiber l'effet apoptotique de Fas. L'apoptose des cellules cibles qui est induit par les lymphocytes T cytotoxiques utiliserait le système Fas. De plus, Fas pourrait être associé à des maladies auto-immunes. En plus, hPTP1E pourrait jouer un rôle dans l'apparition de cellules resistantes aux effets de Fas tel que retrouvées dans les sarcomes de Kaposi chez les sidéens. Malgré des données convaincantes, il reste quand même des doutes quant à l'importance de hPTP1E dans ces maladies. Ainsi une étude publiée n'a pu démontrer une interaction entre les homologues de Fas et hPTP1E chez la souris. Depuis d'autres groupes étudiant les interactions de hPTP1E ont découvert plusieurs protéines qui interagissent avec celle-ci. La première, PARG, est membre de la famille des Rho-GAP, des protéines impliquées dans l'activation des GTPases de type Rho. L'interaction aurait lieu avec le 4ième domaine PDZ de hPTP1E. De plus, le domaine LEVI de RIL interagirait avec hPTP1E via ses 2ième et 4ième domaines PDZ. La fonction biologique de ces interactions n'a toutefois pas été déterminée à ce jour. Pour caractériser la fonction biologique de hPTP1E, nous avons utilisé le système des deux-hybrides de la levure pour identifier des protéines qui interagiraient avec les domaines PDZ de hPTP1E. J'ai ainsi identifié deux protéines nommés ZRP-1 et GEF-5.1, qui se lient à hPTP1E. ZRP-1 possède une structure semblable à celle de zyxin.Ces deux dernières protéines contiennent une région amino-terminale riche en résidus proline et 3 domaines de type LEM à l'extrémité carboxyl terminale. GEF-5.1, d'autre part démontre une homologie marquée aux GEFs de la famille CDC25 impliquées dans l'activation des GTPases de la famille Ras. Des anticorps ont été générés contre ZRP-1, GEF-5.1 et hPTP1E afin de fournir les outils nécessaires pour mieux caractériser ces différentes protéines. Ainsi, j'ai exprimé et purifié le troisième domaine LIM de ZRP-1 ainsi que le domaine PDZ de GEF-5.1, sous forme de protéines de fusion avec la glutathioneS-transferase (GST). Ces protéines ont servis d'antigène pour générer des anticorps chez le lapin. Des anticorps dirigés contre le deuxième domaine PDZ de hPTP1E étaient déja disponibles dans le laboratoire. Ces anticorps ont été purifiés sur une colonne d'affinité GST. Les anticorps anti-ZRP-1 et anti-hPTP1E détectent tous les deux des protéines du poids moléculaire attendu. HPTP1E est exprimé d'une facon ubiquitaire tandis que l'expression de ZRP-1 est plus restrainte parmi les cellules testées. Toutefois, les immunoglobulines dirigées contre GEF-5.1 ne détectent aucune protéine du poids moléculaire attendu dans un extrait cellulaire brut. Parallèlement, d'autres membres du laboratoire ont démontré une interaction entre la tuberine, le produit du gène TSC2, un oncogène impliqué dans la sclérose tubéreuse, et le quatrième domaine PDZ de hPTP1E. Afin de caractériser ces interactions in vivo, des immunoprécipitations de hPTP1E à partir de cellules dans lesquelles une région de ZRP-1 et/ou de la tuberine étaient surexprimé ont été conduites. Sous les conditions expérimentales utilisées, ZRP-1 n'a pas co-immunoprécipité avec hPTP1E. Cependant une interaction avec la tuberine a été détectée utilisant cette stratégie suggérant que HPTP1E pourrait jouer un rôle dans la modulation de l'endocytose. La structure de ZRP-1 inclus un domaine riche en proline qui n'est pas nécessaire pour son interaction avec hPTP1E mais qui pourrait interagir avec d'autres protéines en particulier avec des protéines contenant un/ ou des domaine(s) SH3. La moitié amino-terminale de ce domaine a été utilisé pour cribler une librairie d'ADNc par le système des deux-hybrides. Un clone appelé NtZRP-p33 contenant un domaine SH3 a été identifié. La conséquence biologique de cette interaction reste toutefois a être déterminée. Cependant, NtZRP-p33 possède une structure suggérant son implication dans la signalisation intracellulaire. Un deuxième criblage de la librairie d'ADNc a été initié pour caractériser les protéines impliquées dans le mécanisme de signalisation de hPTP1E. En utilisant le domaine de GEF-5.1 homologue à CDC25, des clones correspondants à la protéine 14-3-3 ont été isolés. Les protéines 14-3-3 forment une famille de protéines qui régularisent la fonction de plusieurs protéines. Leurs interactions se font via un residu sérine qui est phosphorylé. Des mutations du domaine catalytique ont démontré que l'interaction entre 14-3-3s et GEF-5.1 est dépendante du deuxième sérine de la séquence RSLSQG qui se retrouve immédiatement du coté carboxyl terminale du domaine GEF de la protéine GEF-5.1. Ces résultats suggèrent que l'activité de GEF-5.1 pourrait être modulée par la 14-3-38. En conclusion, les résultats expérimentaux présentés dans ce mémoire indique un rôle potentiel de hPTP1E dans plusieurs fonctions cellulaires. En s'associant à la tuberine, hPTP1E pourrait régulariser l'endocytose. Aussi, cette PTPase pourrait être impliquer dans le cycle cellulaire. Ras étant un activateur de la mitose, HPTP1E pourrait moduler l'activité de Ras par voie de GEF-5.1. Ainsi, hPTP1E pourrait agir comme proto-oncogène ou un gène suppresseur des tumeurs. Zyxin est une protéine qui se retrouve près des sites membranaires en association avec le cytoskelette. Puisque la structure de ZRP-1 et zyxin est semblable, ce dernier sert de modèle pour la fonction de ZRP-1. En collaboration avec hPTP1E, ces deux protéines pourrait régulariser la structure du cytoskelette.