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La Division mitotique est une phase essentielle du cycle cellulaire qui assure la répartition correcte du contenu génétique. La mitose implique une réorganisation cellulaire profonde qui est principalement induite par une phosphorylation massive de protéines. Cette phosphorylation a lieu grâce à un équilibre fin entre kinases et phosphatases. À l'entrée mitotique, la phosphorylation protéique est induite par l'activation de la kinase cycline B/CDK1 et par l'inhibition de la phosphatase PP2A-B55. Résultats de notre et d'autres laboratoires ont récemment découvert une nouvelle voie essentielle pour moduler la phosphatase PP2A-B55 pendant la transition G2-M. Cette voie inclut la kinase Greatwall (GW) et ses substrats Arpp19 et ENSA. À l'entrée mitotique GW est activé et phosphoryle Arpp19 et ENSA les convertissant en inhibiteurs puissants de PP2A-B55. Étonnamment, aucun autre substrat de GW n'a été identifié jusqu'ici. Cependant, plusieurs éléments suggèrent fortement de nouveaux rôles de GW indépendamment de Arpp19 et de ENSA. L'objectif principal de ce travail était l'identification de nouveaux substrats de GW. À cette fin, j'ai utilisé plusieurs approches, y compris: (1) fractionnement biochimique des lysats de cellules ou des extraits d'oeufs de Xenopus combiné suivi d’une phosphorylation in vitro avec une kinase GW recombinante, (2) SILAC/phosphoproteomique des lysats de cellules exprimant différents niveau de GW, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID, et (5) une approche dirigée candidat. Les résultats de la phosphorylation in vitro ont révélé la présence de deux bandes de phosphorylation intéressantes qui sont actuellement analysées. Les deux approches SILAC/phosphoprotéinique et interactome ont révélé l'enrichissement des protéines impliquées dans la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique et des processus liés à l'ARN, une fonction physiologique déjà décrite pour cette voie chez la levure. Enfin, nous avons directement étudié la phosphorylation présumée par GW de trois candidats connus pour être impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Bien que phosphorylées in vitro par GW, nous n’avons pu identifier le site de phosphorylation que dans l'une de ces trois protéines. Cette protéine, qui correspond à un inhibiteur de phosphatase, semble contrôler la sortie mitotique par la modulation de la déphosphorylation protéique. Un mutant non phosphorylable de cet inhibiteur induit une sortie mitotique perturbée avec une déphosphorylation ralentie des substrats mitotiques et une altération de la dégradation de la cycline B. J’ai pu attribuer ce défaut à une association perturbée de l'inhibiteur avec la phosphatase et, par conséquent, à un timing aberrant de l'inhibition de la phosphatase. Enfin, j'ai identifié le site de phosphorylation par GW comme le facteur clé contrôlant cette association. En résumé, j'ai identifié dans cette étude un nouveau substrat de GW contrôlant l'activité de la phosphatase essentielle pour une division mitotique correcte. / Mitotic division is an essential phase of the cell cycle that ensures the correct repartition of the genetic content. Mitosis involves profound cellular reorganization that is mostly induced by massive protein phosphorylation. This phosphorylation is achieved thanks to the fine-tuning of the balance between kinases and phosphatases. At mitotic entry, protein phosphorylation is induced by the activation of the master kinase Cdk1-cyclin B and the inhibition of the phosphatase PP2A B55. Previous results from our and other laboratories recently discovered a new pathway essential to modulate PP2A-B55 during G2-M transition. This pathway includes the kinase Greatwall (GW) and its substrates Arpp19 and Ensa. At mitotic entry GW is activated and promotes the phosphorylation of Arpp19/Ensa converting them into potent inhibitors of PP2A B55. Surprisingly, no other substrates of GW have been identified so far. However, several pieces of data strongly suggest new roles of GW independently of Arpp19 and Ensa. The main aim of this work was the identification of new substrates of GW. To this end, I used several approaches including: (1) Biochemical fractionation of cell lysates or Xenopus egg extracts combined with in vitro phosphorylation with recombinant GW kinase, (2) SILAC/phosphoproteomics from cell lysates expressing different GW amounts, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID and (5) a candidate directed approach. Results from in vitro phosphorylation revealed the presence of two interesting phosphorylated bands that are currently being analysed. Both SILAC/phosphoproteomic and interactome approaches yielded the enrichment of proteins involved post-transcriptional regulation of gene expression and RNA related processes, a physiological function already described for this pathway in yeast. Finally, we directly investigated the putative phosphorylation by GW of three candidates known to be involved in the control of cell cycle. Although phosphorylated in vitro by GW, we could only identify the phosphorylation site in one of these three proteins. This protein, corresponding to a phosphatase inhibitor, appears to control mitotic exit through the modulation of mitotic protein dephosphorylation. A non-phosporylable mutant of this inhibitor promotes a perturbed mitotic exit with delayed dephosphorylation of mitotic substrates and impaired cyclin B degradation. I could attribute this defect to a perturbed association of the inhibitor with the phosphatase and consequently to an aberrant timing of phosphatase inhibition. Finally, I identified the GW phosphorylation site as a key factor controlling this association. In summary, I identified in this study a new substrate of GW controlling phosphatase activity essential for correct mitotic division.

L’un des obstacles majeurs au développement de nouveaux antipaludiques est notre connaissance limitée de la biologie parasitaire et la rareté des cibles thérapeutiques potentielles identifiées. Les interactions protéines-protéines sont impliquées et essentielles dans divers processus biologiques incluant les modifications post-traductionnelles. Les interactions substrats-kinases ou phosphatases sont considérées comme une liaison transitoire et jouent un rôle central et essentiel dans le cycle cellulaire de Plasmodium. La Ser/Thr Protéine Phosphatase de Type 1 (PP1), l’une des phosphatases majeurs des eucaryotes, est essentielle à la survie du parasite Plasmodium falciparum, responsable du paludisme. Elle est régulée par diverses sous-unités régulatrices dont plus de 200 ont été identifiées chez l’Homme, mais seulement 4 chez Plasmodium.Afin d’explorer le réseau de régulation de la P. falciparum PP1 (PfPP1), nous avons utilisé trois approches complémentaires pour caractériser l’interactome de la PfPP1. La purification par co-affinité suivie d'une analyse par spectrométrie de masse a identifié 6 protéines interagissant avec la PfPP1 dont 3 contenaient le motif consensus d’interaction RVxF, 2 autres le motif Fxx[RK]x[RK], également connu pour interagir avec la phosphatase et une protéine avec les deux motifs de liaison. Le criblage par double hybride chez la levure a identifié 134 protéines dont 30 présentent le motif RVxF et 20 ont le motif de liaison Fxx[RK]x[RK]. Le criblage in silico du génome de P. falciparum en utilisant une séquence consensus du motif RVxF a révélé 55 partenaires potentiels de la PfPP1. Afin de confirmer l’interaction de certaines protéines, 35 partenaires candidats ont été validés par un test d’interaction de type ELISA. Les résultats ont permis de détecter aussi bien des partenaires conservés de la PP1 qu'un nombre élevé d'interacteurs spécifiques à la PP1 du parasite et montrent une grande diversité dans les fonctions biologiques impliquant la PP1 chez Plasmodium. Parmi ces candidats, un partenaire appelé Gametocyte EXported Protein 15 (GEXP15) a été confirmé comme un réel partenaire de la PfPP1 par différentes approches. De plus, GEXP15 est surexprimé chez les gamétocytes, stade responsable de la transmission du parasite chez le moustique. Ces résultats ainsi que des études fonctionnelles seront présentés. / A major obstacle in the development of novel anti-malarials is our limited knowledge of basic parasite biology and the paucity of identified potential intervention targets. Protein-protein interactions are involved and essential in broad range of biological processes including the post-translational modifications. Substrate-kinase or phosphatase interactions are considered as transient binding and play a central and essential role in Plasmodium cell cycle. The Ser/Thr Protein Phosphatase Type 1 (PP1), one of the main contributors of eukaryotic phosphatase activity, is essential to malaria parasite Plasmodium falciparum and is highly regulated by many regulatory subunits. In humans, there are about 200 distinct regulators, however, only 4 have been so far reported in Plasmodium.To explore the P. falciparum PP1 (PfPP1) regulatory network as complete as possible, we carried out three complementary approaches to characterize the PfPP1 interactome. Co-affinity purification followed by Mass Spectrometry-based proteomics identified 6 PfPP1 interacting proteins (PIPs) of which 3 contained the RVxF consensus binding motif, 2 PIPs with a Fxx[RK]x[RK] binding motif, one with both binding motifs. The Yeast Two-Hybrid screening identified 134 proteins of which 30 have the RVxF binding motif and 20 contain the Fxx[RK]x[RK] binding motif. The in silico screen of the P. falciparum genome using a consensus RVxF motif as template revealed the presence of 55 potential PfPP1 interacting proteins. As further demonstration, 35 candidate partners were validated in an independent ELISA-based assay using recombinant proteins. The data reports several conserved PP1 interacting proteins as well as a high number of specific interactors to PfPP1, indicating a high diversity of biological functions for PP1 in Plasmodium. Among these candidates, one partner assigned as Gametocyte EXported Protein 15 (GEXP15) has been confirmed as a direct interactor of PfPP1 by different approaches. In addition, GEXP15 is over-expressed during gametocyte stage, responsible for the transmission of the parasite in the mosquito. These results as well as functional studies will be presented and discussed.

La malaria est la 1ère parasitose mondiale du fait de son taux de morbidité et de mortalité. Elle est responsable de 198 millions de cas dont 584 000 décès en 2013 (OMS). La forme la plus sévère est due à l’apicomplexe Plasmodium falciparum. Etant donné l’absence d’un vaccin efficace et l’augmentation des résistances aux traitements, il est crucial d’approfondir nos connaissances sur la biologie de P. falciparum afin de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Le cycle de vie complexe avec deux hôtes nécessite une régulation précise et dynamique de l’expression des gènes et des modifications post-traductionnelles. Dans ce contexte, il a été montré que les kinases et les phosphatases, impliquées dans les processus de phosphorylation et de déphosphorylation respectivement, jouent un rôle crucial pour la survie du parasite. Chez les eucaryotes, les phosphatases sont impliquées dans la croissance cellulaire, la différentiation et la division. Parmi elles, PP1, une des principales sérine/thréonine phosphatases, est composée d’une sous-unité catalytique (PP1c) et d’une sous-unité régulatrice. Ces régulateurs sont essentiels et confère à PP1 une localisation, une spécificité et une régulation de son activité. La majorité des régulateurs interagissent avec PP1c via différents motifs tel que le motif RVxF. Chez P. falciparum, PP1 (PfPP1c) est exprimée et semble être essentielle au niveau du stade érythrocytaire, en particulier dans la libération des mérozoïtes infectieux. Pour mieux comprendre la fonction de PfPP1c, nous étudions les régulateurs de PP1 chez le parasite. Nos études précédentes nous ont permis de caractériser 3 régulateurs au niveau moléculaire et fonctionnel. Dans ce contexte, nous avons montré que PfLRR1 et PfI2 inhibent l’activité de PP1 alors que PfI3 l’active. Des études de génétique inverse suggèrent que ces régulateurs sont aussi essentiels que la PP1c elle-même. Récemment, nous avons identifié dans le génome de P. falciparum le facteur d’initiation de la traduction de type 2 sous-unité ß (eIF2ß) qui pourrait être un partenaire/régulateur potentiel de PfPP1. Dans la 1ère partie de cette étude, l’objectif principal a été d’étudier la présence de motifs additionnels de fixation à PfPP1c dans PfI2 et leur impact sur sa fonction. En utilisant la RMN, un troisième motif d’interaction FxxR/KxR/K a été identifié. Ce motif a été montré comme agissant de concert avec le motif canonique RVxF. En effet, la mutation des deux motifs abolie complètement l’interaction avec PfPP1. De plus, en utilisant le modèle d’ovocytes de Xénope, nous avons montré que ces motifs sont nécessaires à PfI2 pour réguler l’activité de PP1. Finalement, l’utilisation d’un peptide dérivé du motif d’interaction FxxR/KxR/K de PfI2 a montré une accumulation dans les érythrocytes infectés et un effet anti-plasmodial a été observé. Dans la 2ème partie de cette étude, nous avons étudié eIF2β, un autre régulateur potentiel de PfPP1. Par des expériences de GST pull-down, nous avons montré l’interaction entre PfeIF2β/PfPP1 et deux motifs d’interaction ont été identifiés : RVxF et FxxR/kxR/K. De plus, en utilisant le modèle d’ovocytes de Xénope, nous avons démontré que PfeIF2ß est impliqué dans la transition G2/M, suggérant un rôle inhibiteur sur l’activité de PP1. La mutation d’un des deux motifs n’empêche pas la formation du complexe alors que la mutation des deux abolie l’interaction avec PP1. Afin de déterminer la fonction de PfeIF2ß in vivo chez Plasmodium, des expériences de génétique inverse ont été réalisées. Nous avons montré l’accessibilité au locus du PfeIF2ß par Knock-in et des expériences d’interruption du gène elf2ß chez Plasmodium falciparum et berghei (espèce spécifique aux rongeurs) sont actuellement en cours afin de déterminer l’essentialité de cette protéine dans le développement du parasite. / Malaria is still the most severe infectious disease in the world because of its high rate of morbidity and mortality. Malaria is responsible for 198 million cases among which 584 000 deaths in 2013 (WHO). The most deadly parasite is the Apicomplexa Plasmodium falciparum. Given the lack of efficient vaccine with long-lasting protection and the increase of resistance against current treatments it is crucial to further deepen our understanding the biology of Plasmodium falciparum to find new means of control. The complex life cycle within two hosts necessitates a highly accurate and dynamic regulation of gene expression and of post translational modifications. In this context, it has been shown that kinases and phosphatases, involved in phosphorylation/dephosphorylation processes respectively, play a key role in parasite survival. In eukaryotes, phosphatases have been shown to be involved in cell growth, differentiation and division. Among them, Protein phosphatase type 1 (PP1) has been reported as one of the major serine/threonine phosphatase proteins involved in diverse cellular functions. PP1 is composed of a single catalytic subunit (PP1c) with a capacity to interact with a high number of regulatory subunits. These regulators are essential as they are key players in different roles of PP1c, including its trafficking, activity and specificity. Most of regulators interact with PP1c via several binding motifs including the RVXF motif. In Plasmodium falciparum, PP1c (PfPP1c) is expressed and seems to be essential for blood stage parasite, in particular merozoïte liberation. To better understand the function of PfPP1c, we investigated the regulators of protein phosphatase type I in this parasite. Our earlier studies have characterized three regulators at the molecular and functional levels. In this context, we have shown that PfLRR1 and PfI2 inhibit PP1 activity while PfI3 activates it. Reverse genetic studies suggested that these regulators are as essential as the PP1c itself. Recently, we found in P. falciparum genome the eukaryotic translation initiation factor 2 subunit ß (eIF2ß) which could be a potential partner/regulator of PfPP1. In the first part of this study, the main objective was to further explore in PfI2 the presence of additional motifs of binding to PfPP1c and their impacts on its function. Using NMR spectroscopy, a third motif was identified: FxxR/KxR/K. This motif has been found to act together with the canonical motif RVxF. Indeed, mutations in both motifs abolished completely the interaction with PfPP1. In addition, using Xenopus oocytes model, we showed that both motifs were necessary for PfI2 to regulate the activity of PP1. Finally the use of a peptide spanning the FxxR/KxR/K motif of PfI2 regulator showed an accumulation in infected erythrocytes and an antiplasmodial effect was observed.In the second part, we investigated eIF2ß as a potential regulator of PfPP1. By GST pull-down assays, we have shown the interaction between PfeIF2ß/PfPP1 and two binding motifs were identified : RVxF and FxxR/KxR/K motifs. Moreover, using Xenopus oocytes model, we demonstrated that PfeIF2ß is involved in G2/M transition, suggesting an inhibitor function of PP1 activity. Mutation of one of two motifs did not prevent the interaction while mutation of both abolished this binding. To gain more insights on the function of PfeIF2ß in Plasmodium, reverse genetic experiments were carried out. We have shown the accessibility of PfeIF2ß locus by Knock-in and we are performing Knock-out experiments on Plasmodium falciparum and berghei (specific species of the rodents) to determine the essentiality of this protein for parasite development.

Plasmodium falciparum (Pf) est un parasite intracellulaire capable d’infecter l’Homme. Dans les 48h après l’invasion des érythrocytes, il passe par le stade d’une cellule géante multinucléée qui se divise en 16 à 32 parasites. Cette multiplication rapide nécessite des mécanismes spécifiques de régulation très subtilement orchestrés. Parmi les modifications post-traductionnelles décrites chez les cellules eucaryotes, la phosphorylation réversible des protéines par les kinases/phosphatases est une des voies majeures dans la transduction des signaux cellulaires. Chez Plasmodium, des études de génétique inverse ont démontré que PfPP1, phosphatase majeure du parasite, est essentielle pour sa survie. L’activité de PP1 est connue pour être contrôlée par divers régulateurs endogènes. Cependant, malgré leur importance dans le ciblage de l’holoenzyme à un compartiment subcellulaire spécifique et/ou dans la régulation de son activité, peu de recherches ont été consacrées à l’identification de partenaires de PP1 chez Pf.Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation de PfPP1 et son impact sur la biologie de Pf, nous étudions les partenaires de cette enzyme qui seraient impliqués dans le contrôle de la phosphatase. Nos recherches récentes, basées sur des études de génomique comparative, ont permis d’identifier 4 régulateurs de PfPP1 : PfLRR1, PfI3, PfI2 et PfeiF2β. Au-delà de la capacité de ces protéines à contrôler la fonction de PP1 in vitro, nous avons montré par génétique inverse que leur rôle est vital pour Pf. En parallèle, nous avons entrepris une démarche plus globale pour la recherche de nouveaux partenaires/régulateurs de PfPP1. Nous avons notamment réalisé un criblage par double hybride de levure (Y2H) où PfPP1 est utilisé comme appât.Dans la 1ère partie de ma thèse, nous avons analysé les clones obtenus en criblage Y2H et initié la caractérisation de plusieurs d’entre eux. Notre choix d’étude s’est porté par la suite sur PF3D7_091900 et PF3D7_1202600, retrouvées 8 et 10 fois lors du criblage et présentant une interaction forte avec PP1. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser au niveau moléculaire et fonctionnel le rôle de ces protéines sur l’activité de PP1 et de déterminer les régions/motifs de ces potentiels régulateurs pouvant intervenir au niveau de la relation structure/fonction du complexe qu’ils forment avec PfPP1.Dans une 2ème partie, nous avons étudié la séquence de ces protéines. PF3D7_0919900, protéine spécifique du parasite, possède le motif RVxF, souvent impliqué dans l’interaction avec PP1 et présente des motifs RCC1 connus pour interagir avec des protéines. Ainsi elle sera nommée RCC-PIP pour Regulator of Chromosome Condensation - Phosphatase Interacting Protein. PF3D7_1202600 est, quant à elle, un orthologue de Caliban chez la drosophile, et sera nommée CLP pour Caliban-Like Protein. Elle présente 17 motifs RVxF dont 7 se situent dans le fragment obtenu suite au criblage. Différentes approches ont confirmé que ces 2 protéines sont des partenaires de PfPP1. Cependant, la réalisation d’un test pNPP in vitro a mis en évidence une fonction activatrice de RCC-PIP, alors que CLP ne présente pas d’effet.Dans une 3ème partie, l’objectif était d’étudier plus en détails RCC-PIP. Nous avons démontré que le motif RVxF est impliqué dans l’interaction avec PfPP1. Puis nous avons étudié les motifs RCC1 et leur interactome par la réalisation d’un criblage Y2H en utilisant ces motifs comme appât. Une kinase a été trouvée (PfCDPK7) suggérant que RCC-PIP aurait un rôle de plateforme capable d’interagir avec 2 enzymes antagonistes. L’étude du rôle de RCC-PIP chez le parasite est actuellement en cours. La réalisation d’un knock-in a démontré l’accessibilité du locus. Un knock-out a également été effectué, mais l’absence d’intégration du plasmide indique que RCC-PIP serait essentielle au parasite. Pour confirmer cette observation, un knock-out conditionnel chez P. berghei est en cours de réalisation. / Plasmodium falciparum is an intracellular parasite that evolves in several stages of development in the vertebrate host. Within 48 hours after the invasion of erythrocytes, it goes through the stage of a multinucleated giant cell which divides into as many parasites as nuclei (16-32 parasites). This growth/fast division requires specific regulatory mechanisms subtly orchestrated. Among the post-translational modifications described in eukaryotic cells, the reversible phosphorylation of proteins by kinases/phosphatases is one of the major pathways in the cellular signal transduction. In Plasmodium, PP1 is predicted to catalyze the majority of protein dephosphorylation events, and has been shown to be essential in its survival using reverse genetic approaches. The activity of PP1 is known to be tightly controlled by various endogenous regulators. However, despite their importance in targeting the holoenzyme to a specific subcellular compartment and/or regulating its activity, little has been devoted to identify PP1 partners in the parasite.In order to deepen our understanding of the regulation of PfPP1 and its impact on the biology of Plasmodium, we study the partners of this enzyme that may be involved in the control of its location, its specificity and activity. Our recent research, based on comparative genomic studies, have identified 4 regulators of PfPP1: PfLRR1, PfI3, PfI2 and PfeiF2β. In parallel, since Plasmodium has a particular cell cycle and the function of PP1 should be adapted, we have undertaken a more global approach to the search for new partners/regulators of PfPP1 using different approaches including a yeast two-hybrid screening where PfPP1 was used as bait.In the first part of my thesis, the clones obtained in Y2H screening were analyzed and 2 clones were selected for further characterization. These clones, corresponding to PF3D7_091900 and PF3D7_1202600 were identified 8 and 10 times during the screening, a good indication about their expression in blood stages and their interactions with PfPP1 can be still detectable under high stringency conditions. Hence, my thesis project aimed to characterize molecularly and functionally of the role of these proteins on PfPP1. _x000D_In the second part, we have analysed the sequence of these two proteins. PF3D7_0919900, a parasite-specific protein, shows the canonical binding motif « RVxF », known to be involved in the interaction with PP1, and present on the fragment obtained following the screening. The sequence also has RCC1 motifs known to interact with proteins. Thereafter, this protein was designated as RCC-PIP for Regulator of Chromosome Condensation - Phosphatase Interacting Protein. As far as PF3D7_1202600 is concerned, it seems to be an ortholog of Caliban expressed by Drosophila, and designated Pf Caliban CLP-Like Protein. It has 17 potential RVXF binding motif, of which 7 are located in the fragment obtained following the screening. Different approaches such as GST pull-down or ELISA, identified these two proteins as partners of PfPP1. Using pNPP in vitro assay, we showed a slight activation of PfPP1 by RCC-PIP, while CLP had no effect.In the third part, the objective was to study in more detail the RCC-PIP. We showed that the RVxF motif is involved in the interaction with PfPP1. We then tied to identify the partners of RCC1 by screening a cDNA library of P. falciparum using RCC1 containing protein as bait. We showed that RCC-PIP is able to interact with a kinase (PfCDPK7) suggesting that RCC-PIP may act as a platform since it is able to interact with 2 enzymes with opposed activities. Analysis of the role of RCC-PIP in the parasite is currently underway. The production of a knock-in demonstrated the accessibility of the locus. A knock-out was also carried out, but the lack of integration of the plasmid suggests that RCC-PIP is essential to the parasite. To confirm this observation, a conditional knock-out in P. berghei is in progress.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Parkinson disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease. It is characterized by loss of dopaminergic cells in the substantia nigra, which causes loss of dopaminergic synapses onto striatal medium spiny neurons (MSNs). Dendritic spines that are localized to these striatal MSNs receive synaptic inputs from both the nigral dopamine neurons and cortical glutamate neurons. Signaling downstream of excitatory, glutamatergic drive is modulated by dopamine. This tripartite connection: glutamate, dopamine, and MSN dendritic spine, is important for normal motor function. Glutamate released from presynaptic terminals binds to and activates two classes of inotropic glutamate receptors that are localized to dendritic spines on striatal MSNs: the α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor (AMPAR) and the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR). Once these receptors are activated, they allow for Ca2+ influx, which in turn activates Ca2+-dependent processes that underlie neural plasticity, including long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD). Proper machinery in the pre- and post-synaptic neurons is required for normal signal transduction. Moreover, this signal transduction requires proper organization of synaptic proteins, which is achieved by specific protein-protein interactions. These protein-protein interactions are dynamic and can be modulated under various conditions, including pathological changes in the phosphorylation status of a specific protein. Catalytically active proteins called phosphatases and kinases specifically regulate the phosphorylation status of synaptic proteins. Pathologically, in PD there is increased autophosphorylation and activation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII). This increased phosphorylation may be due to changes in the activity of the serine/threonine protein phosphatase 1 (PP1), a highly conserved protein serine/threonine phosphatase that has a diverse set of functions in eukaryotes. Serine/threonine phosphatase substrate specificity is obtained via interactions with targeting and regulatory proteins. One such protein, spinophilin, is a scaffolding protein that targets PP1 to various synaptic substrates to regulate their phosphorylation. Interestingly, the association of PP1 with spinophilin is enhanced in a rat model of PD. The NMDAR is another protein that has altered phosphorylation in animal models of PD. We have found that there is a decrease in the NMDAR-spinophilin interaction in an animal model of PD. Here, we have found that spinophilin and the NMDAR interact in brain tissue and when overexpressed in a mammalian cell system. Moreover, we have identified novel mechanisms that regulate this interaction and have identified putative consequences of altering this association. These studies give us novel insight into mechanisms and consequences underlying pathological changes observed in an animal model of PD. Understanding these changes will inform novel therapeutic targets that may be useful in modulating striatal function.

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Excerpt: Interferon (IFN) regulatory factor 7 (IRF7) is phosphorylated and activated in response to pathogenic infections for production of type I IFNs

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<p>Maintenance of vascular homeostasis is an active process that is dependent on continuous signaling by the quiescent endothelial cells (ECs) that line mature vessels. Defects in vascular homeostasis contribute to numerous disorders of significant clinical impact including hypertension and atherosclerosis. The signaling pathways that are active in quiescent ECs are distinct from those that regulate angiogenesis but are comparatively poorly understood. Here we demonstrate that the previously uncharacterized scaffolding protein Caskin2 is a novel regulator of EC quiescence and that loss of Caskin2 in mice results in elevated blood pressure at baseline. Caskin2 is highly expressed in ECs from various vascular beds both in vitro and in vivo. When adenovirally expressed in vitro, Caskin2 inhibits EC proliferation and migration but promotes survival during hypoxia and nutrient deprivation. Likewise, loss of Caskin2 in vivo promotes increased vascular branching and permeability in mouse and zebrafish models. Caskin2 knockout mice are born in normal Mendelian ratios and appear grossly normal during early adulthood. However, they have consistently elevated systolic and diastolic blood pressure at baseline and significant context-dependent abnormalities in systemic metabolism (e.g., body weight, fat deposition, and glucose homeostasis). Although the precise molecular mechanisms of these effects remain unclear, we have shown that Caskin2 interacts with several proteins known to have important roles in endothelial biology and cardiovascular disease including the serine/threonine phosphatase PP1, the endothelial receptor Tie1, and eNOS, which is a critical regulator of vascular homeostasis. Ongoing work seeks to further characterize the functions of Caskin2 and its mechanisms of action with a focus on how Caskin2-mediated regulation of endothelial phenotype relates to its systemic effects on cardiovascular and metabolic function.</p> / Dissertation