SARS-CoV-2-Antikörpertests sind deswegen von Bedeutung, weil damit insbesondere die Ausbreitung des Virus exakt nachverfolgt und politische Maßnahmen und Einschränkungen angepasst werden können. Zum Antikörpernachweis werden hauptsächlich das Spike und das Nukleo-Protein als Fängerprotein verwendet. Ausgangspunkt für die vorliegenden Studie war die Beobachtung, dass Covid-positive Seren, die in S-Protein basierten Antikörpertests stark reagiert hatten, teilweise im N-Protein-Tests gar nicht reagierten und umgekehrt. Daraufhin stellte sich die Frage, wie sich die Kombination der Nukleo- und Spike-Proteine in einem Kombinations-Test, im Vergleich zu einem Test mit dem Nukleo-Protein und dem Spike-Protein allein, auf die Sensitivität und Spezifität auswirkt.
So entstand die Idee, die beiden Proteine in einem gemeinsamen Test zu kombinieren, um einerseits die Sensitivität zu verbessern, ohne aber gleichzeitig eine Verschlechterung der Spezifität in Kauf nehmen zu müssen. Um diese Arbeitshypothese optimal untersuchen zu können, wurde ein eigener S-Protein-ELISA und ein Kombinatios-ELISA, der das Spike und das Nukleo-Protein als Fängerprotein benutzt, etabliert und mit dem bereits von Frau Schnurra etablierten N-Protein-ELISA verglichen. Untersucht wurde die Hypothese mithilfe der drei ELISA-Antikörpertests, in denen 123 Covidseren von 2020 und 180 Blutbankseren und Plasmen von vor 2019 miteinander verglichen wurden. Der N-Protein-ELISA, der S-Protein-ELISA und der Kombinations-ELISA folgten dabei einem fast identischen Protokoll. Somit wurde garantiert, dass ausschließlich die Auswirkung der Proteine und Proteinkombinationen verglichen wurden und Sensitivitäten und Spezifitäten nicht wegen verschiedener Testqualitäten oder verwendeter Substanzen schwankten.
Um den optimalen Vergleich der ELISA ermöglichen zu können, wurde die Spezifität der drei Tests mithilfe der ROC-Analyse auf 98,33 % angeglichen. Im Vergleich der Sensitivitäten der drei Tests ist zu sehen, dass die Sensitivität tatsächlich gesteigert werden kann, wenn das S- und das N-Protein miteinander kombiniert werden. Der N-Protein-ELISA hat mit 82,9 % (CI: 75,1% - 89,1%) die geringste Sensitivität, gefolgt von dem S-Protein-ELISA mit 93,5 % (CI: 87,6% - 97,2%). Die höchste Sensitivität hat der ELISA, der die beiden Proteine kombiniert mit 95,9 % (CI 90,8% - 98,7%). Werden die AUC‘s der drei Tests berechnet, die die Genauigkeit eines Tests angeben, wie zum Beispiel die Unterscheidung der diagnostischen Gruppe in krank und gesund, schneidet auch hier der Kombinationstest mit 0,986 (CI: 0,965 – 0,996) am besten ab. Auf dem zweiten Platz landet der S-Protein-ELISA mit 0,985 (CI: 0,964- 0,995) und auf dem dritten Platz der N-Protein-ELISA mit 0,96 (CI: 0,931 – 0,979).
Wird die Spezifität der drei Tests bei einem Cut-off von 1 miteinander verglichen, ist deutlich, dass sich die Spezifität durch die Kombination der beiden Proteine verschlechtert. Von 180 Seren und Plasmen, die vor 2019 abgenommen wurden, wird im N-Protein-ELISA ein Serum als falsch positiv erkannt, im S-Protein-ELISA ein Serum und ein Plasma. Im Kombinations-ELISA werden jeweils die beiden zuvor genannten Seren und das Plasma als falsch positiv erkannt. Eine zusätzliche Überprüfung ist hierbei erforderlich, indem noch mehr Covid-negative Seren untersucht werden.
Zur praktischen Nutzung der Ergebnisse kommen folgende Möglichkeiten in Frage: Wird ein besonders sensitiver Test benötigt, wie es zum Beispiel der Fall ist, wenn eine große Bevölkerung auf ihre Durchseuchung untersuchen werden soll, könnte ein ELISA benutzt werden, der beide Proteine kombiniert. Anschließend müssten die positiven Seren in einem hoch spezifischen Test, wie zum Beispiel dem Siemens-Test, nachgetestet werden. Das hätte den Vorteil, dass mit einem relativ günstigen ELISA die größte Anzahl an Seren aussortiert werden könnte. Daraufhin müsste dann nur noch eine kleine Gruppe an Seren mit dem teureren Antikörpertest, in diesem Falle dem Siemens-Test, nachgetestet werden. Wird primär ein besonders spezifischer ELISA benötigt, könnte das N-Protein wieder allein verwendet werden.
:Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III
1 EINFÜHRUNG 1
1.1 Besonderheiten des SARS-Coronavirus-2 1
1.1.1 Aufbau des SARS-CoV-2 3
1.1.2 Antikörperantwort auf SARS-CoV-2 5
1.2 SARS-CoV-2 Diagnostik 7
1.2.1 SARS-CoV-2 Akutdiagnostik/ Direkter Erregernachweis 8
1.2.2 SARS-CoV-2-Antikörpertests/ Indirekter Erregernachweis 9
1.2.2.1 Die Bedeutung von SARS-CoV-2 Antikörpertests 10
1.3 Aufgabenstellung 11
2 MATERIAL UND METHODEN 12
2.1 Materialien 12
2.1.1 Blutproben 12
2.1.2 Herstellung des RBD-Bestandteils des S1-Proteins 12
2.2 Methoden 13
2.2.1 Allgemeines ELISA-Protokoll 13
2.2.2 Datenanalyse 14
3 ERGEBNISSE 15
3.1 Entwicklung des ELISA-Protokolls 15
3.1.1 Antigenbeschichtungslösung 15
3.1.2 Antigenbeschichtungskonzentration 16
3.1.3 Vergleich verschiedener Entwicklungszeiten 19
3.1.4 Versuch der Reduktion falsch positiver Ergebnisse 24
3.1.5 Herstellung des Calibrators 29
3.1.6 Herstellung des Standardserums 32
3.1.7 Finales Elisa Protokoll 36
3.2 Stabilisierung des ELISAs 36
3.2.1 Stabilisierung der Beschichtung 36
3.2.2 Stabilisierung von Positiv-/ Negativkontrolle und Calibrator 39
3.3 Vergleich der Sensitivitäten und Spezifitäten der verschiedenen ELISA 39
3.3.1 Sensitivitäten der Antikörpertests bei einem Cut-off von 1 40
3.3.1.1 Aufschlüsselung der Testergebnisse der Sensitivität 42
3.3.2 Spezifitäten der Antikörpertests 43
3.3.2.1 Aufschlüsselung der Testergebnisse der Spezifität 44
3.3.3 Angleichung der Spezifität zum Vergleich der drei ELISA 45
3.3.3.1 Angleichung der Spezifität auf 99,4% 45
3.3.3.2 Angleichung der Spezifität auf 98,3 % 47
3.4 Vergleich der Flächen unter den ROC-Kurven 50
4 DISKUSSION 51
5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 58
6 LITERATURVERZEICHNIS 61
7 ANHANG 68
8 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 69
9 LEBENSLAUF 70
10 PUBLIKATIONEN 71
11 DANKSAGUNG 72
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:77831 |
| Date | 07 February 2022 |
| Creators | Reiners, Nina Ellen |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/updatedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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