Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29092010-100933 |
| Date | 21 July 2010 |
| Creators | Cologna, Camila Takeno |
| Contributors | Braga, Eliane Candiani Arantes, Varanda, Wamberto Antonio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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