Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-10T22:53:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gisely Juliane Barbosa de Albertim.pdf: 3413482 bytes, checksum: 3b7142ff44bc24f648147cb01ae4d8dc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T22:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gisely Juliane Barbosa de Albertim.pdf: 3413482 bytes, checksum: 3b7142ff44bc24f648147cb01ae4d8dc (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / CNPQ / FACEPE / A regulação do volume celular é importante em vários processos fisiológicos. A diminuição regulatória do volume (RVD) é o processo pelo qual as células recuperam o seu volume após terem sido submetidas a um choque hipoosmótico. Este processo se deve principalmente à liberação de K⁺ e Cl⁻ através de canais e transportadores iônicos. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação dos canais de potássio e canais de cloreto envolvidos na RVD e na proliferação das células-tronco mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical humano (hWJ-MSCs). As hWJ-MSCs foram isoladas de acordo com a técnica de migração espontânea do explante. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 15 % soro fetal bovino, 10 % F-12, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina e mantidas em atmosfera de 5% de CO₂ a 37 °C. Nos experimentos da RVD, as hWJ-MSCs foram depositadas em uma cubeta acoplada a um microscópio invertido com um sistema de vídeo imagem, sendo submetidas inicialmente a um choque hipoosmótico (300 mOsm→200 mOsm) por perfusão. A dinâmica de variação do volume foi monitorada por 30 min e as imagens antes (300 mOsm) e durante o choque hipoosmótico (200 mOsm) foram obtidas a cada minuto e analisadas usando o software ImageJ. As hWJ-MSCs foram submetidas aos seguintes inibidores de canais: tetraetilamônio (TEA) 10 mM, (canal de Kv); glibenclamida (GB) 100 µm, (canal de Kir6.x); 4-aminopiridina (4-AP) 5 mM, (canal de Kv1, KCNA), Iberiotoxina (IBTX) 10 nM (canal BKca), (ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino) benzóico (NPPB), (canal de Cl⁻ ), ácido disulfônico di-isocianatoestilbeno (DIDS) 100 µm e Tamoxifeno (TAM) 10 µm. Posteriormente, as células foram submetidas aos ensaios de MTT, curva de crescimento, quantificação do conteúdo de DNA e RT-PCR. A técnica de patch clamp na configuração Whole-cell foi empregada para caracterização das correntes iônicas. Os dados foram analisados usando o teste t Student’s ou ANOVA, com pós-teste de Tukey ou de Bonferroni. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A RVD presente nas hWJ-MSCs foi suprimida na presença dos inibidores de canais de potássio e de canais de cloreto. As hWJ-MSCs apresentaram três perfis de corrente iônica: Maxi K (BK ou Kca); corrente de potássio transiente de saída (Ito) e uma corrente de retificação tardia (Kᴅʀ). As hWJ-MSCs na presença dos inibidores de canais iônicos reduziram a proliferação permanecendo na fase G0/G1 do ciclo celular. As hWJ-MSCs expressaram os canais de potássio (MaxiK, KCND2, KCND3, KCNS1, KCNH2 e KCNH1) e os canais de cloreto (pl-VDAC e CLCN3). Deste modo, conclui-se que os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv), canais de potássio dependentes de ATP, ativados por cálcio de alta condutância (Kca) e canais de cloreto participam no mecanismo da RVD e consequentemente interferem na proliferação das hWJ-MSCs. / Cell volume regulation is one of the most fundamental homeostatic mechanisms and essential for normal cellular function. The phenomenon of shrinkage and / or cell swelling caused by osmotic changes are called regulatory volume increase (RVI) and regulatory volume decrease (RVD), respectively. The RVD is the process by which cells recovery its volume after being subjected to hypoosmotic environment. This process occurs due to release K⁺ and Cl⁻ through ion channels and transporters. The aim of this study was to investigate the involvement of ionic channels involved in RVD and proliferation of mesenchymal stem cells from Wharton's Jelly of the human umbilical cord (hWJ-MSCs). The hWJ-MSCs were isolated according to the spontaneous migration of the explant technique. Cells were grown in DMEM supplemented with 15% fetal bovine serum, 10 % F-12, 100 U / ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin and maintained in an atmosphere of 5 % CO₂ at 37 °C. In the experiments the RVD, the hWJ-MSCs were placed in a chamber coupled to an inverted microscope with a video image system and initially subjected to shock hypo-osmotic (300 mOsm → 200 mOsm) perfusion. The dynamics of volume change was monitored for 30 minutes before (300 mOsm) and during hypo-osmotic shock (200 mOsm) and the images (every min) analyzed using the ImageJ software. Specific cation channel inhibitors such as tetraethylammonium (TEA) 10 mM (Kv channel); glibenclamide (GB) 100 μm (Kir6.x channel); 4-aminopyridine (4-AP) 5 mM (Kv1 channel KCNA), iberotoxin (IBTX) 10 nM (BKCa channel) and cellular anion inhibitors (5-Nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB) (Cl⁻channel), disulfonic acid di-isocianatoestilben- (DIDS) 100 μm (Cl⁻ channel) and tamoxifen (TAM) 10 μm (Cl- channel) were used as molecular tools to evaluate the influence of ion channels in regulate mechanism RVD and cell proliferation. Subsequently, the cells were subjected to MTT assay, growth curve, flow cytometer to quantify the DNA content and RT-PCR. The patch clamp technique in Whole-cell configuration was employed to characterize the ionic currents. For statistical analysis, one-way ANOVA followed Tukey's or Bonferroni post hoc test were performed. A p-value less than 0.05 were considered statistically significant. The RVD in hWJ-MSCs was abolished in the presence of ionic channels inhibitors (potassium and chloride). The electrophysiological recording presents, at least, three different profiles compatible with: noisy current as a Maxi K current (BK or Kca), transient outward K+ current (Ito) and a slower activating delayed rectifier (Kᴅʀ). Also showed that hWJ- MSCs in the presence of the ionic channel inhibitors reduced the cell proliferation and arrest cells in G0/G1 cell cycle stage. As hWJ-MSCs expressed of the potassium channels (MaxiK, KCND2, KCND3, KCNS1, KCNH2 and KCNH1) and chloride channels (pl-VDAC and CLCN3). The results showed that there are a relationship of cell cycle progression and membrane permeability. Thus, we concluded that there is participation of KATP, BKCa Kv and Cl⁻ channels in the mechanism of RVD and proliferation of hWJ-MSCs.

MOURA, Carlos Tiago Martins. Participação dos canais iônicos na hiperreatividade induzida por ovalbumina em traquéias isoladas de ratos. 2004. 122 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2004. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-07T16:20:30Z No. of bitstreams: 1 2004_dis_ctmmoura.pdf: 735616 bytes, checksum: 735e9cdf07f498aba4693fd851ba5e0c (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-08T11:25:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2004_dis_ctmmoura.pdf: 735616 bytes, checksum: 735e9cdf07f498aba4693fd851ba5e0c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-08T11:25:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2004_dis_ctmmoura.pdf: 735616 bytes, checksum: 735e9cdf07f498aba4693fd851ba5e0c (MD5) Previous issue date: 2004 / In order to verify the interference of the antigenic challenge on traqueal contractility in vitro, male rats (250 -350 g) were ovalbumine (OVA)-sensitized and, 13 to 14 days later, they were challenged through the sensitizing antigen inhalation (OVA, 1 mg/ml, followed by 5 mg/ml). Animals were sacrificed immediately (SD0) or 24 hours (SD24) after the antigenic challenge through chloral hydrate anaesthesia (0,4 g/Kg). Some animals were treated with metilsergide (1 mg/Kg) 40 minutes before the challenge. Control animals (CONT) received only the vehicle (NaCl 0,9 %) by inhalation. Tracheal rings were carefully removed and mounted in a 10 ml isolated bath chamber with modified Krebs-Henseleit solution (at 37±0,5 oC) bubbled with a mixture of 5% of CO2 in 95% of O2. Concentration-effect curves (CCE) were constructed for potassium chloride (KCl), acetycholine (ACh) or serotonin (5-HT). In another experiments, CCE for Ca2+ addition were constructed under Ca2+-free conditions (with 10-5 M EDTA, nifedipine and indomethacin, 10-6 M each) in the presence of KCl, ACh or 5-HT. Sensitization and subsequent antigenic challenge (SD) promoted a significant increase of the maximal response (RM) of the CCE to KCl (force in grams, mean ± S.E.M.: CONT = 0,52 ± 0,01; SD24 = 1,22 ± 0,03; n = 06; p < 0.01), ACh (CONT = 2.11 ± 0,10; SD24 = 3,53 ± 0,03; n = 06; p < 0.01) or to 5-HT (CONT = 0,60 ± 0,03; SD24 = 1,48 ± 0,09; n = 06; p < 0.01). Tracheal rings of sensitized and challenged animals showed a rise in RM for Ca2+ only when they were pre-contracted with KCl (CONT = 0,84 ± 0,08; SD24 = 1,98 ± 0,05; n = 6; p < 0.01) or ACh (CONT = 0,98 ± 0,09; SD24 = 1,54 ± 0,15; n = 6; p < 0,05). When 5-HT was used as agonist this hyperresponsiveness did not occur, being observed only in the nifedipine absence (CONT = 0.81 ± 0,06; SD24 without nifedipine = 1,23 ± 0,08; n = 05; p < 0.01). The sensitized but not challenged animals (SENS) were compared to SD animals in the presence of niflumic acid (AN). AN inhibited the antigenic shock-induced hyperresponsiveness for 5-HT (SENS = 1,28 ± 0,09; SD24 + AN = 1.01 ± 0,08; n = 05), while it was ineffective in inhibit that for the ACh (SENS = 1,44 ± 0,01; SD24 + AN = 1,67 ± 0,03; n = 05; p < 0.01). Therefore, the results show that there is a participation of Ca2+ channels, both voltage- and receptor-operated channels, in the hyperresponsiveness of the respiratory smooth muscle, induced by the representation of the antigen to previously sensitized animals and, in addition, the Cl- channels Ca2+-activated have an important role on 5-HT hyperresponsiveness development. / Com o objetivo de verificar a interferência da broncoprovocação antigênica sobre a contratilidade traqueal, ratos machos (250 -350 g) foram sensibilizados à ovalbumina (OVA) e, 13 a 14 dias depois, desafiados em intervalos de 15 minutos através da inalação do antígeno sensibilizante (OVA, 1 mg/ml, seguida de 5 mg/ml). O sacrifício dos animais foi feito imediatamente (SD0) ou 24 horas (SD24) após o desafio antigênico através de anestesia com hidrato de cloral (0,4 g/Kg). Alguns animais foram tratados com metilsergida (1 mg/Kg) 40 minutos antes do desafio. Os animais controle (CONT) inalaram apenas o veículo (NaCl 0,9 %). A traquéia foi removida e montada em cuba para orgão isolado contendo 10 ml de solução de Krebs-Henseleit modificada (mantida a 37±0,5 oC) e aerada com mistura carbogênica (O2/CO2–95:5). Foram confeccionadas curvas concentração-efeito (CCE) para cloreto de potássio (KCl), acetilcolina (ACh) ou serotonina (5-HT). Em outros experimentos foram realizadas CCE ao Ca2+ em preparações mantidas previamente em solução sem Ca2+ (contendo 10-5 M de EDTA, nifedipina e indometacina, 10-6 M para ambas) e estimuladas por KCl, ACh ou 5-HT. A sensibilização e o posterior desafio antigênico (SD) promoveram um significativo aumento da resposta máxima (RM) das CCE ao KCl (força em grama, média ± E.P.M.: CONT = 0,52 ± 0,01; SD24 = 1,22 ± 0,03; n = 06; p < 0,01), à ACh (CONT = 2,11 ± 0,10; SD24 = 3,53 ± 0,03; n = 06; p < 0,01) ou à 5-HT (CONT = 0,60 ± 0,03; SD24 = 1,48 ± 0,09; n = 06; p < 0,01). As traquéias de animais sensibilizados e desafiados apresentaram aumento da RM ao Ca2+ apenas quando pré-contraídas com KCl (CONT = 0,84 ± 0,08; SD24 = 1,98 ± 0,05; n = 6; p < 0,01) ou ACh (CONT = 0,98 ± 0,09; SD24 = 1,54 ± 0,15; n = 6; p < 0,05). Quando o agonista utilizado foi a 5-HT esta diferença não ocorreu, sendo observada uma maior RM somente na ausência de nifedipina (CONT = 0,81 ± 0,06; SD24 sem nifedipina = 1,23 ± 0,08; n = 05; p < 0,01). Foram comparados os animais apenas sensibilizados e não desafiados (SENS) com os SD na presença de ácido niflúmico (AN). O AN inibiu a hiperreatividade para a 5-HT induzida pelo desafio antigênico (SENS = 1,28 ± 0,09; SD24 + AN = 1,01 ± 0,08; n = 05), enquanto que foi ineficaz em inibir a hiperreatividade para a ACh (SENS = 1,44 ± 0,01; SD24 + NA = 1,67 ± 0,03; n = 05; p < 0,01). Portanto, os resultados mostram que há envolvimento de canais de Ca2+, tanto dependentes de voltagem (VOC) como operados por receptor (ROC), na hiperreatividade do músculo liso respiratório, induzida pela reapresentação do antígeno a animais previamente sensibilizados e que o desenvolvimento da hiperreatividade para a 5-HT está relacionado à abertura de canais de Cl- ativados por Ca2+

Canais iônicos são nanoporos aquosos formados por proteínas imersas na membrana celular. Sua função biológica básica é permitir o transporte de íons no sentido de seu gradiente eletroquímico. Dada a enorme quantidade de processos biológicos relacionados ao movimento iônico, a importância dos canais iônicos em biologia e medicina dificilmente pode ser exagerada. Neste trabalho, apresentamos uma introdução à vasta área do conhecimento de canais iônicos, discutimos suas perspectivas em pesquisa básica e aplicada e, em especial, a importância do estudo computacional da permeação iônica por canais. Seguimos analisando o estado da arte em relação a modelos computacionais de canais iônicos e discutindo criticamente as vantagens e desvantagens das abordagens existentes, fazendo considerações sobre suas perspectivas. Concluindo que a técnica de Dinâmica Browniana apresenta potencial para o estudo de propriedades básicas da condução iônica por nanoporos, propomos um modelo simples de canal iônico unidimensional através desta técnica para uma geometria que permite solução analítica da equação de Poisson, a qual é apresentada. A simplicidade do modelo proposto lhe confere grande eficiência computacional, a qual é ampliada com a proposta de um critério de “tempo de injeção” dos íons no canal, cuja expressão é demonstrada e que poupa o simulador de considerar explicitamente dois reservatórios eletrolíticos junto ao canal. O simulador desenvolvido baseado neste modelo é estudado e comparado com a literatura, mostrando bons resultados em sua região esperada de validade. Dado o estágio atual do estudo computacional de canais iônicos, é importante dispormos de modelos conceitualmente simples e computacionalmente eficientes. A sua existência possibilita, por exemplo, estudos de Dinâmica Molecular muito eficientes considerando a água explicitamente, algo importante para a análise de novos modelos da água adequados a nanoporos. / Ion channels are nanopores formed through the cell membrane by proteins. Their basic biological function is allowing ionic transport down the electrochemical gradient. Given the huge amount of biological processes that are related to ionic fluxes, the biological and medical importance of ion channels hardly can be overstated. In this work we present a brief introduction to the vast field of ion channels and discuss its perspectives in basic and applied research, emphasizing the importance of computational approaches to study ion permeation through channels. Next, we analyze the state of the art regarding computational models of ion channels, critically discussing the advantages and disadvantages of the current approaches and considering the perspectives of each. We conclude that the Brownian Dynamics approach has potential to be used to study ionic conductance through nanopores and we propose a simple Brownian Dynamics unidimensional channel model for a geometry that allows analytical solution of the Poisson equation, which is presented. The simplicity of the proposed model grants it great computational efficiency, which is further amplified with the proposal of an “injection time” criterion to allow ions to enter the channel. The formula for the “injection time” is demonstrated and its implementation lifts the requirement to simulate two reservoirs next to the channel. The simulator developed based on this model is studied and its results are compared with the literature, showing good agreement in its expected region of validity. Given the current state of computational study of ion channels, it is important to have simple and efficient models, such as ours, available. For instance, their existence allows the realization of very fast Molecular Dynamics studies that consider water explicitly, something very important for the analysis of new explicitly polarizable water models that are required for nanopores.

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-08T17:02:11Z No. of bitstreams: 1 2017_DanielOliveiradaMata.pdf: 2848903 bytes, checksum: 6360949ef385746e8198ea48f90efb2f (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-05T13:04:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DanielOliveiradaMata.pdf: 2848903 bytes, checksum: 6360949ef385746e8198ea48f90efb2f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-05T13:04:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DanielOliveiradaMata.pdf: 2848903 bytes, checksum: 6360949ef385746e8198ea48f90efb2f (MD5) Previous issue date: 2018-06-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / Os escorpiões, pertencentes ao filo Arthropoda, representam aproximadamente 1,5% das espécies presentes na classe dos aracnídeos. No Brasil, existem diversas espécies de escorpiões presentes em todas as regiões, dentre eles os que mais se destacam são os pertencentes ao gênero Tityus devido à sua grande distribuição geográfica e importância médica. Dentre eles, uma espécie que se destaca é o Tityus fasciolatus mais presente na região central do Brasil. Essa espécie de escorpião, assim como as outras, possui uma peçonha extremamente complexa formada por uma série de compostos, e dentre eles estão os peptídeos conhecidos como neurotoxinas capazes de interagir e afetar o funcionamento dos canais de sódio dependentes de voltagem, responsáveis pela iniciação e propagação dos potenciais de ação. A peçonha do escorpião Tityus fasciolatus foi coletada e submetida ao fracionamento utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC). As frações obtidas foram analisadas em espectrômetro de massa (MALDI-TOF) a fim de identificar o peptídeo de interesse, que teve sua sequência determinada e sua atividade testada nos sete subtipos de canais de sódio de mamíferos e em canais de sódio de inseto e aracnídeo por meio da técnica de patch-clamp em configuração voltage clamp. O peptídeo purificado denominado Tf1a foi capaz de alterar a cinética de todos os subtipos de canais de mamífero e, ainda, agir sobre os canais de inseto e de aranha modificando também seu funcionamento. O efeito observado permite classificar a toxina Tf1a como uma β-toxina escorpiônica do tipo like. Sendo assim esse trabalho foi capaz de descrever uma nova neurotoxina purificada da peçonha de um escorpião e caracterizar a sua atividade em diversos tipos de canais iônicos, colaborando assim com o entendimento da ação destes peptídeos. / Scorpions, belonging to the Arthropoda phylum, represent approximately 1.5% of the species present in the Arachnidae class. There are several species of scorpions present in all regions of Brazil, among them the ones that stand out most are those belonging to the genus Tityus thanks to its great geographic distribution and medical importance. Between them, one species that stands out is the Tityus fasciolatus most present in the central region of Brazil. This species of scorpion, like the others, has an extremely complex venom formed by a several compounds. Among them are the peptides also known as neurotoxins capable of interacting and affect the functioning of the voltagegated sodium channels, responsible for the initiation and propagation of the action potential. The venom of the scorpion Tityus fasciolatus was collected and submitted to fractionation using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) technique. The fractions obtained were analyzed by mass spectrometer (MALDI-TOF) to identify the peptide of interest, which had its sequence determined and its activity tested on the seven subtypes of mammalian sodium channels and on insect and arachnid sodium channels by the use of the patch-clamp technique in voltage clamp configuration. The purified peptide named Tf1a was able to change the kinetics of all subtypes of mammalian channels and also act on the insect and arachnid channels, modifying their normal functioning. The effects caused allows us to classify the toxin Tf1a as a β-like scorpion toxin. Thus, this work was able to describe a new neurotoxin purified from the venom of a scorpion and characterize its activity in several types of ion channels, thus collaborating with the understanding of the action of these peptides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Robson Amaral (robsonamaral@bce.unb.br) on 2018-05-09T18:32:58Z No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-07T11:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T11:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) Previous issue date: 2018-06-07 / Aranhas possuem uma complexa variedade de componentes em sua peçonha. Dentre esses componentes, os peptídeos neurotóxicos destacam-se por sua capacidade de paralisar a presa por meio da interação com canais iônicos dependentes de voltagem e com receptores glutamatérgicos presentes no sistema nervoso central (SNC) e no sistema nervoso periférico (SNP). Estudos prévios no laboratório de Toxinologia da Universidade de Brasília (UnB) verificaram que a peçonha da aranha caranguejeira Acanthuscurria paulensis apresenta cerca de 100 compostos, distribuídos entre intervalos de massa de 635-21.895 Da, sendo a fração com maior abundância, de massa monoisotópica [M+H]+ = 5457,79 Da, denominada Ap1a. Foi evidenciando que o peptídeo Ap1a apresenta 48 resíduos de aminoácidos e três pontes dissulfeto. O objetivo do presente trabalho é descrever o(s) alvo(s) molecular(es) do peptídeo Ap1a, isolado da aranha A. paulensis, através de ensaios eletrofisiológicos em canais de Na+ e K+ , bem como analisar seu efeito em ensaios de ligação de [3,4 3 H]- L- Glutamato. Foram realizadas 48 cromatografias da peçonha bruta de A. paulensis para obtenção da fração de interesse, denominada Ap1a, a qual eluiu, aproximadamente, aos 41% de acetonitrila. Para purificação da fração de interesse realizou- se uma recromatografia com gradiente de acetonitrila otimizado. O peptídeo Ap1a, 1 μM, apresentou efeitos em todos os canais de sódio de mamíferos testados: hNav 1.1, hNav 1.3 e hNav 1.7, sendo que, ao se avaliar a ativação dos canais testados, o canal hNav 1.1 foi o que mais deslocou o potencial de ativação para voltagens mais hiperpolarizadas (ΔV1/2 = - 6,58 mV ± 0,72) quando em presença da Ap1a. Contudo, ao se analisar as alterações na amplitude da corrente iônica, o canal hNav 1.7 apresentou maior efeito (32,43% ± 4,93). O peptídeo Ap1a à 1 μM não apresentou efeito nos canais de sódio tanto de barata (Blattella germanica) quanto de ácaro (Varroa destructor). Além disso, nenhum bloqueio ou modulação nos canais potássio de inseto do tipo Shaker, Shab, Shal, Shaw e hKv 10.1 foi evidenciado. Ensaios de ligação de [3,4 3 H]- L- Glutamato foram realizados em triplicata na presença de concentrações crescentes do peptídeo Ap1a (0,01 a 1000 μM), todavia em nenhuma das concentrações utilizadas foi observado alguma diferença estatística significativa na ligação de [3,4 3 H]-L-glutamato. Com base nisso, o presente estudo contribuiu para a ampliação do conhecimento específico do peptídeo Ap1a, isolado da peçonha da A. paulenis, uma das inúmeras aranhas caranguejeiras endêmicas do Brasil, através da realização de uma ampla investigação eletrofisiológica em diversos canais iônicos dependentes de voltagem, bem como em receptores ionotrôpicos de glutamato. / Spiders have venom composed by several compounds of different chemical classes, among them potentially neurotoxic peptides, which are essencial in the prey paralysis process acting in voltage-dependent ion channels and in glutamatergic receptors present in the central nervous system (CNS) and peripheral nervous system (PNS). Previous studies in the laboratório de Toxinologia da Universidade de Brasília (UnB) found that the venom of the tarantula Acanthuscurria paulensis presents about 100 compounds, distributed between mass intervals of 635-21,895 Da, being the fraction with greater abundance, of monoisotopic mass [ M + H] + = 5457.79 Da, designated Ap1a. It was also found that the Ap1a has 48 amino acid residues and three disulfide bonds. The aim of the present work is to describe the molecular target (s) of the Ap1a, isolated from the A. paulensis tarantula, through electrophysiological recordings on Na + and K + channels, as well as to analyze its effect in binding assays of [3,4 3 H] -L-glutamate. Ap1a was purified through chromatography of the crude venom followed by rechromatography. Ap1a, 1 μM, showed effects on all the mammalian sodium channels tested: hNav 1.1, hNav 1.3 and hNav 1.7, and, when evaluating the activation of the channels tested, hNav 1.1 was the one that displaced the most activation potential for more hyperpolarized voltages (ΔV1 / 2 = -6.58 mV ± 0.72) when in the presence of Ap1a. However, when analyzing the changes in the amplitude of the ionic current, hNav 1.7 had a greater effect (32.43% ± 4.93). Ap1a, 1 μM, also showed no effect on the sodium channels of both cockroach (Blattella germanica) and mite (Varroa destructor). In addition, no blockage or modulation in the Shaker, Shab, Shal and Shaw potassium channels was found. [3,4 3 H] -L-Glutamate binding assays were performed in triplicate in the presence of increasing concentrations of Ap1a (0.01 to 1000 μM), however at any of these concentrations used was no significant statistical difference in binding of [3,4 3 H] -L-glutamate. Based on this, the present study contributed to increase the specific knowledge of Ap1a, isolated from A. paulenis venom, one of the numerous endemic tarantula in Brazil, through a broad electrophysiological investigation in several voltage dependent ion channels, as well as in ionotropic glutamate receptors.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-15T13:26:00Z No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:23:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Anestésicos gerais são diariamente utilizados em uma miríade de procedimentos cirúrgicos. Todavia o intricado mecanismo molecular de ação desses compostos ainda é desconhecido. A hipótese mais creditada sugere uma ação de anestésicos em diferentes canais iônicos de tecidos neurais por interação em múltiplos sítios de ligação nessas proteínas de membrana. Estudos in vitro recentes mostram alteração na condução dos canais de potássio dependentes de voltagem pela ligação de anestésicos halogenados em múltiplas cavidades com distintas afinidades em diferentes conformações. Entre esses canais está o canal iônico dependente de voltagem de mamífero Kv1.2. Foi demonstrado que uma mutação pontual G329T nesse canal iônico confere maior sensibilidade ao anestésico geral sevoflurano. Nesse contexto, a investigação da interação envolve não somente a descoberta de regiões putativas de ligação, como também de que forma essa interação poderia alterar o equilíbrio entre as diferentes conformações do canal iônico. Contudo, a ligação do anestésico pode ser uma condição necessária, mas não suficiente para ter efeito modulatório. Sabese que o sevoflurano, um anestésico inalável, potencializa o canal Kv1.2, deslocando a curva de condutância-voltagem para voltagens mais negativas e aumentando a condutância máxima. Para tanto, foram realizadas simulações de dinâmica molecular do canal Kv1.2 selvagem e do canal Kv1.2 G329T em bicamada lipídica com solvente explícito, a fim de amostrar as flutuações estruturais das conformações aberta e fechada desta proteína. Uma ligeira diminuição da flutuação da cadeia do canal mutante foi conferida por análise de RMSD (Root Mean Square Deviation) e RMSF (Root Mean Square Fluctuation) ao longo das trajetórias. Dessas simulações, foram escolhidos ao acaso 120 frames de cada simulação para a realização de docking molecular por meio do AutoDock Vina, assim obtidos aproximadamente 2400 modos de interação. Após o agrupamento e análise das soluções, foram eleitos os centros das nuvens de soluções de quatro potenciais sítios distintos para estruturar o complexo anestésico-canal e, então, avaliar a afinidade do ligante sítio-específica por cálculos de energia livre baseados em simulações de dinâmica molecular. Pela utilização do método LIE (Linear Interaction Energy), percebeu-se grande afinidade pelo sítio próximo ao filtro de seletividade, de tal forma que este pode estar favorecendo a estabilização da conformação condutiva, logo aumentando a condutância do canal. Pela mutação estar associada com um aumento da constante de equilíbrio para um estado pré-aberto, é proposto que um conjunto de sítios podem estar desestabilizando esse estado. Como resposta ao resultado obtido e pelo desafio em conciliar os resultados microscópicos com o efeito na relação condutância voltagem por anestésico, é apresentado um esquema teórico para avaliar múltiplos estados de ligação. Aqui, é exposta uma perspectiva inicial para uso do modelo teórico apresentado. Ao considerar, por indisponibilidade da definição precisa das outras conformações, apenas as conformações aberta e fechada do canal, além das afinidades obtidas para múltiplos sítios, foi possível calcular as densidades de probabilidades para os estados ligados e, dessa forma, encontrar um deslocamento da curva condutância-voltagem com a mesma tendência ao experimental. Os presentes dados revelam importantes regiões de interação anestésico/proteína e permite a proposição de formas de análise do intricado mecanismo de modulação por ligantes, favorecendo assim futuros estudos experimentais dos mecanismos de ação na anestesia. _____________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / General anesthetics are daily used in a myriad of surgical procedures worldwide. Nevertheless their molecular mechanism of action remains elusive. An accredited hypothesis suggests that anesthetics modulate distinct ion channels in neural tissue by interacting in multiple binding sites in these membrane proteins. New in vitro studies show that halogenated anesthetics modifies the conductance/voltage relation of voltage gated potassium channels by binding to multiple cavities with different affinities in a conformationdependent fashion. Within this context, the present investigation is focused not only on searching the putative binding sites, but also on discovering the manner by which the binding could modify the conformation energy landscape, since the binding of the anesthetic can be a necessary but not sufficient condition to have a modulatory effect. The mammal Kv1.2 channel stands as a potential target of inhalation anesthetics. Sevoflurane, a halogenated anesthetic, potentiates this channel, shifting the conductance/voltage relation leftward and increasing the maximum conductance. Recently, the G329 point mutation in this channel has been associated with an augmentation of the sensitivity to the general anesthetic sevoflurane. To explore this issue, molecular dynamics simulations of the Kv1.2 wild type and Kv1.2 G329T inserted in a phospholipidic membrane with explicit water treatment were performed. The sampling was performed to both open and closed conformations. A slightly reduction of fluctuation near the linker S4-S5 was noticed on the mutant by analysis of RMSF through the simulated trajectory. From these simulations, 120 frames were selected from each construction for running docking calculation. These approach was used in order to account for molecular flexibility of the protein. From the molecular docking applying AutoDock Vina, nearly 2400 binding modes were obtained. After clustering and analysis of solutions, four putative independent binding cavities were selected to construct the anesthetic/channel complex and then ligand site-specific affinities were estimated by free energy calculations based on molecular dynamics simulations. By employing the LIE (Linear Interaction Energy) method, a relative strong affinity by the site near the selectivity filter was noted. The interaction with this site could favor the stabilization of the conductive state, hence increasing the conductance of the channel. Since the G329T mutation is associated with an increased equilibrium constant of the pre-open state, it is proposed that a group of sites could destabilize this state. As an answer to the issue of conciliating the obtained binding affinities with the anesthetic effect on the conductance/voltage relation, it is presented here a theoretic model to evaluate multiple binding states. In an initial attempt to analyze the accuracy of the prediction by the model, considering only the conductive open and closed conformations, since the unavailability of a detailed structure of the other relevant states, besides the calculated binding affinities, it was possible to compute probability densities for the bound states, thus estimating a leftward shift on the conductance-voltage curve. The present data reveals putative anesthetic binding regions and potential binding free energies and allows proposition of a approach to rationalize the complex mechanism of modulation by multiple binding sites with multiple occupancies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-17T18:50:27Z No. of bitstreams: 1 2018_LeonardoCirqueiraPimentel.pdf: 22698391 bytes, checksum: a84e79cda85f13261ade4ac2ccb02f4a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-20T21:09:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_LeonardoCirqueiraPimentel.pdf: 22698391 bytes, checksum: a84e79cda85f13261ade4ac2ccb02f4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-20T21:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_LeonardoCirqueiraPimentel.pdf: 22698391 bytes, checksum: a84e79cda85f13261ade4ac2ccb02f4a (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / O uso de anestésicos gerais na medicina é datado em mais de 100 anos. Apesar da evolução da anestesiologia e do uso consolidado dessa classe de fármacos, o mecanismo molecular da anestesia geral ainda é desconhecido. Diversos estudos vêm mostrando que os canais iônicos são os principais alvos dos anestésicos, com um grande número de interações entre ligantes e receptores já caracterizados. Porém, está sendo mostrado que a interação é bastante complexa: existe a presença de múltiplos sítios de ligação, que sofrem influência tanto da concentração de anestésicos quanto da conformação do canal. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a interação do anestésico geral sevoflurano com o canal iônico de potássio dependente de voltagem de mamíferos Kv1.2. Esse par é de muito interesse da medicina atual, pois o sevoflurano é um anestésico bastante utilizado e o Kv1.2 é expresso em neurônios do sistema nervoso central e em células cardíacas, com papel chave em diversos distúrbios. Experimentos de eletrofisiologia mostram que o sevoflurano leva à uma ativação mais precoce dos canais Kv1.2 e causa um aumento na corrente máxima. Muitos trabalhos vêm tentando clarificar quais são os sítios de ligação do Kv1.2, e estudos envolvendo ferramentas computacionais vêm sugerindo uma ligação do sevoflurano ao poro de condução da proteína. Esse sítio precisa ter sua existência validada, afinal a presença do anestésico nesse local pode atrapalhar a função do Kv1.2. Para investigar se a ligação é possível, em um primeiro estudo neste trabalho, foram caracterizadas diversos parâmetros físico-químicos de um segmento de membrana, e na sequência as propriedades da migração do sevoflurano da água para a bicamada lipídica. A energia livre de partição mostrou que o anestésico tem maior afinidade pela região anfifílica do interior da membrana, tornando possível o acesso do sevoflurano aos diversos sítios transmembrânicos sugeridos e reduzindo a probabilidade de acesso aos sítios mais hidratados. Descrições termodinâmicas juntamente com ferramentas computacionais de modelagem molecular permitiram o desenvolvimento de um experimento de competição em condições fisiológicas, que indicaram que a ligação do sevoflurano sob fluxo iônico é pouco provável. Além disso, simulações com voltagem mostraram que mesmo quando ligado ao poro central, o sevoflurano não atrapalha a condução iônica. Esses resultados são de grande importância ao mostrar que a ligação do sevoflurano ao sítio do poro central é uma ligação de pouca probabilidade, e que caso ocorra, o funcionamento do canal não é alterado. / The use of general anesthetics in medicine is dated to more than a hundred years. Despite the anesthesiology evolution and the well-established usage of this drug class, the molecular mechanism of general anesthesia is still unknown. Several studies have been showing that the ion channels are the main targets of anesthetics, with a huge and still growing number of characterized receptor-ligand interactions. However, these interactions are complex: there are multiple binding sites, which are influenced by the anesthetic concentration and the channel conformation. This work main goal was to study the interaction between sevoflurane and the mammal voltage dependant potassium channel Kv1.2. Nowadays medicine is very interested in this interaction pair because sevoflurane is widely used and Kv1.2 is expressed in central nervous system and in heart cells, with a key role in neuronal and cardiac disturbance. Eletrophysiology experiments show that sevoflurane induces an easier channel opening and an increase in Kv1.2 maximum currents. Some studies are trying to clarify what are the binding sites, and a site located in the main pore of the channel is being suggested. This site has to be validated, because the presence of sevoflurane at the main pore of the channel can alter Kv1.2 functioning. To check if binding is possible, in the first part of this work, there was a physico-chemical characterization of a membrane patch, and later a sevoflurane water-membrane migration free-energy description. The partition free-energy variation shows that the anesthetic has more affinity to the inner membrane amphiphilic region, making it possible for sevoflurane to acess several suggested transmembrane sites and reducing binding probabilites to hidrated sites. Thermodinamic descriptions joined with computational tools of molecular modeling allowed to develop a competition experiment under physiological conditions, which showed that sevoflurane binding to the central cavity is less probable. Furthermore, simulations in the presence of voltage showed that sevoflurane bound at the central cavity did not hinder ionic conduction across the channel. These results are very important, because they show that sevoflurane binding to the central pore is a low probability event, and when it occurs, the channel functioning is not altered.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-17T19:50:58Z No. of bitstreams: 1 2018_LetíciaStockVieira.pdf: 37362496 bytes, checksum: 68c3a25c71170b7b1b388d4fd0cc1795 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-20T21:34:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_LetíciaStockVieira.pdf: 37362496 bytes, checksum: 68c3a25c71170b7b1b388d4fd0cc1795 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-20T21:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_LetíciaStockVieira.pdf: 37362496 bytes, checksum: 68c3a25c71170b7b1b388d4fd0cc1795 (MD5) Previous issue date: 2018-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes). / Anestesia geral é um recurso fundamental na medicina moderna. Em contraste com o uso de anestésicos há mais de 100 anos, seus alvos e mecanismo de ação moleculares ainda são largamente desconhecidos. Porquanto não se descarte a hipótese de que essas moléculas exerçam seus efeitos por meio de alterações de propriedades físico-químicas de membranas celulares, um conjunto crescente de evidências sugere um cenário alternativo. Neste, o estado de anestesia seria induzido pela modulação direta de múltiplos receptores proteicos. Entre os potenciais receptores, estudos de eletrofisiologia e em modelos animais demonstram que o canal iônico neuronal dependente de voltagem de mamíferos Kv1.2 é modulado diretamente pelo anestésico geral sevoflurano. Esses estudos sugerem que sevoflurano se liga a múltiplos sítios em Kv1.2, resultando em um aumento na probabilidade de abertura do canal, e em um aumento da sua condutância máxima. Nesse contexto, o presente trabalho se propõe a identificar sítios de ligação de sevoflurano nas conformações aberta e fechada de Kv1.2 e investigar quanto da modulação da proteína pode ser explicada pela ligação direta do anestésico, no contexto de um modelo de dois estados. Preambular a essa investigação, no entanto, está o desenvolvimento do arcabouço teórico necessário ao tratamento concentração-dependente da interação de pequenas moléculas a múltiplos sítios de ligação saturáveis, para que se possa quantificar o impacto do modulador no equilíbrio entre conformações da proteína. Da forma como foram descritas, as equações são gerais e facilmente transponíveis a diferentes sistemas de interação proteína-ligante. O estudo mostra, sob uma perspectiva atomística molecular, que sevoflurano se liga com dependência conformacional a Kv1.2. A estabilização do estado aberto promovida pela ligação da molécula anestésica é capaz de recapitular o aumento da probabilidade de abertura do canal verificado experimentalmente. Ademais, os sítios de ligação de sevoflurano a Kv1.2 sugeridos pela estratégia aqui desenvolvida se encontram próximos a resíduos de aminoácido identificados como relevantes à modulação por meio de estudos de mutagênese e marcação com ligantes fotoativos. Em conjunto, os resultados apresentados corroboram a hipótese da modulação direta e contribuem uma perspectiva microscópica para se compreender os efeitos causados por sevoflurano. / Anesthetics are routinely used in medical procedures for almost two centuries. Despite its ubiquity, the molecular mechanism leading to the endpoint of anesthesia remains unknown. While anesthetics might also act by altering cellular membranes’ physicochemical properties, recent studies favor direct allosteric modulation of multiple proteins targets. One such target, evidenced by electrophysiology and in vivo experiments, is the voltage-gated channel Kv1.2. Investigations on sevoflurane, a major general anesthetic, suggest the molecule potentiates Kv1.2 by binding to multiple independent sites, causing a left-shift to the open probability curve (increasing open probability), while also increasing its maximum conductance. Here, we set out to identify Kv1.2 sevoflurane binding sites and quantify the impact of direct modulation in Kv1.2 potentiation. For that, we have developed an original theoretical framework to investigate concentration-dependent interaction of small ligands to multiple saturable protein binding sites which allow for thorough calculation of the functional impact of such binding to equilibrium between well-known conformational states, i.e. open and closed Kv1.2 structures. Anesthetic’s local distribution and binding affinities are evaluated by a combination of docking and free-energy-perturbation calculations. The results suggest sevoflurane binds Kv1.2 in conformationdepend manner. Also, the calculated ligand-effected open-conformation stabilization agrees with experimental measurements, successfully recovering open-probability leftward shift from microscopic data alone. Key binding sites identified by the docking-FEP strategy are also found to be in close proximity to residues identified as relevant by recent photolabeling and mutagenesis experiments. Altogether, results support the direct modulation hypothesis and contributes to understanding sevoflurane effects from a molecular standpoint. Moreover, the theory developed in this work is general and could be applied to various ligand-receptor systems.

Canais iônicos são nanoporos aquosos formados por proteínas imersas na membrana celular. Sua função biológica básica é permitir o transporte de íons no sentido de seu gradiente eletroquímico. Dada a enorme quantidade de processos biológicos relacionados ao movimento iônico, a importância dos canais iônicos em biologia e medicina dificilmente pode ser exagerada. Neste trabalho, apresentamos uma introdução à vasta área do conhecimento de canais iônicos, discutimos suas perspectivas em pesquisa básica e aplicada e, em especial, a importância do estudo computacional da permeação iônica por canais. Seguimos analisando o estado da arte em relação a modelos computacionais de canais iônicos e discutindo criticamente as vantagens e desvantagens das abordagens existentes, fazendo considerações sobre suas perspectivas. Concluindo que a técnica de Dinâmica Browniana apresenta potencial para o estudo de propriedades básicas da condução iônica por nanoporos, propomos um modelo simples de canal iônico unidimensional através desta técnica para uma geometria que permite solução analítica da equação de Poisson, a qual é apresentada. A simplicidade do modelo proposto lhe confere grande eficiência computacional, a qual é ampliada com a proposta de um critério de “tempo de injeção” dos íons no canal, cuja expressão é demonstrada e que poupa o simulador de considerar explicitamente dois reservatórios eletrolíticos junto ao canal. O simulador desenvolvido baseado neste modelo é estudado e comparado com a literatura, mostrando bons resultados em sua região esperada de validade. Dado o estágio atual do estudo computacional de canais iônicos, é importante dispormos de modelos conceitualmente simples e computacionalmente eficientes. A sua existência possibilita, por exemplo, estudos de Dinâmica Molecular muito eficientes considerando a água explicitamente, algo importante para a análise de novos modelos da água adequados a nanoporos. / Ion channels are nanopores formed through the cell membrane by proteins. Their basic biological function is allowing ionic transport down the electrochemical gradient. Given the huge amount of biological processes that are related to ionic fluxes, the biological and medical importance of ion channels hardly can be overstated. In this work we present a brief introduction to the vast field of ion channels and discuss its perspectives in basic and applied research, emphasizing the importance of computational approaches to study ion permeation through channels. Next, we analyze the state of the art regarding computational models of ion channels, critically discussing the advantages and disadvantages of the current approaches and considering the perspectives of each. We conclude that the Brownian Dynamics approach has potential to be used to study ionic conductance through nanopores and we propose a simple Brownian Dynamics unidimensional channel model for a geometry that allows analytical solution of the Poisson equation, which is presented. The simplicity of the proposed model grants it great computational efficiency, which is further amplified with the proposal of an “injection time” criterion to allow ions to enter the channel. The formula for the “injection time” is demonstrated and its implementation lifts the requirement to simulate two reservoirs next to the channel. The simulator developed based on this model is studied and its results are compared with the literature, showing good agreement in its expected region of validity. Given the current state of computational study of ion channels, it is important to have simple and efficient models, such as ours, available. For instance, their existence allows the realization of very fast Molecular Dynamics studies that consider water explicitly, something very important for the analysis of new explicitly polarizable water models that are required for nanopores.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-10-21T16:52:43Z No. of bitstreams: 1 2014_ChristianoDelCantoniGati.pdf: 2602107 bytes, checksum: 18a064226ebc5138f5ae768e6881caa7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-21T17:37:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ChristianoDelCantoniGati.pdf: 2602107 bytes, checksum: 18a064226ebc5138f5ae768e6881caa7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-21T17:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ChristianoDelCantoniGati.pdf: 2602107 bytes, checksum: 18a064226ebc5138f5ae768e6881caa7 (MD5) / Os canais para K+ são agrupados em quatro famílias sendo uma delas a de canais voltagem-dependentes (Kv). Os canais Kv estão presentes na formação hipocampal, estrutura chave na consolidação da memória declarativa e espacial. Apesar de trabalhos mostrem a participação de canais para K+ nos processos de aprendizagem e memória, não está claro qual o papel dos canais Kv. Em função de evidências da literatura, acreditamos que canais Kv subtipo 1.1 (Kv1.1) contribuem positivamente para a formação de memória espacial enquanto os Kv subtipo 2.1 (Kv2.1) têm efeito oposto no mesmo fenômeno. O objetivo deste trabalho é testar essa hipótese. Para ratificar a influência dos canais Kv na memória espacial, além de padronizar testes comportamentais e eletrofisiológicos relacionados a processos da memória, foi utilizada a 4-aminopiridina (4-AP), um bloqueador seletivo para canais Kv, e a escopolamina, um antagonista de receptor muscarínico com comprovado efeito amnésico. Também foram selecionadas duas toxinas para os testes: HgeTx1 e ScTx1. A HgeTx1 é um peptídeo do escorpião Hadrurus gertschi e um bloqueador de canais Kv1.1. A ScTx1 é um peptídeo da aranha Stromatopelma calceata e um bloqueador de canais Kv2.1. Enquanto a ScTx1 foi adquirida comercialmente, a HgeTx1 foi obtida a partir da peçonha de escorpiões por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, sigla em inglês) e caracterizada quimicamente por meio de espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. A administração das substâncias foi intrahipocampal bilateral na região de CA1 (i.h.) ou intraperitoneal (i.p.). Ratos Wistar machos sob o efeito de diferentes substâncias supracitadas (exceto as toxinas) foram submetidos a três testes comportamentais de aprendizagem e memória espacial: o campo aberto (CA), o labirinto radial de oito braços (LR) e o labirinto aquático de Morris (LAM). Todas as substâncias (incluindo as toxinas) também foram utilizadas em preparações de fatias da formação hipocampal de cérebros (slice) de ratos para verificar seus efeitos sobre a indução de long-term potentiation (LTP) nas sinapses Schaefer-CA1, um dos possíveis mecanismos celulares/moleculares da memória. Os testes comportamentais confirmaram o envolvimento dos canais Kv na memória dependente da formação hipocampal. Os testes no CA mostraram que a escopolamina i.p. (n = 5) provocou prejuízo da habituação espacial, efeito revertido parcialmente pela 4-AP i.h. (n = 5). Nos testes no LR, o bloqueio dos canais Kv pela 4-AP i.h. (n = 6) facilitou tanto a memória operacional quanto a memória de referência, enquanto o desempenho dos animais foi prejudicado pela escopolamina i.p. (n = 6). Os testes com o LAM mostraram resultados semelhantes, pois a 4-AP i.h. melhorou o desempenho dos ratos. Os testes eletrofisiológicos in vitro complementaram os comportamentais. A escopolamina inibiu a indução de LTP (n = 6), enquanto a 4-AP o intensificou (n = 6), achados que reforçam os do CA e LR. Foi também interessante observar que a 4-AP reverteu o efeito supressor da escopolamina (n = 6), resultado semelhante ao obtido no CA. Por fim, a HgeTx1 diminuiu a magnitude do LTP (n = 6) e a ScTx1 o aumentou (n = 6), satisfazendo predições deste trabalho. Os resultados obtidos até o momento não só fortalecem a importância dos canais Kv na aprendizagem e memória espacial, mas também corroboram nossa hipótese sugerindo que os canais Kv1.1 e Kv2.1 possuem efeitos distintos e complementares na formação da memória. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / K+ channels are the most diverse among ion channels. They are grouped into four families, one of which is the voltage-dependent (Kv) channels. These are widely distributed in the mammalian brain, especially in the hippocampus, a key structure in the consolidation of declarative and spatial memories. Although studies show the involvement of K+ channels in learning and memory, the role of Kv channels in these processes still unclear. Based on previous studies, we believe that Kv subtype 1 (Kv1) channels contribute positively to the spatial memory formation, while Kv subtype 2 (Kv2) have the opposite effect on the same phenomenon. The aim of this work was to test this hypothesis. We used 4-aminopyridine (4-AP), a selective blocker for Kv channels, and scopolamine, a muscarinic receptor antagonist with proved amnesic effect to confirm the influence of Kv channels on spatial memory. Additionally, the same drugs were used to standardizing behavioral and electrophysiological tests related to memory processes. Two toxins were selected for the tests: HgeTx1 and ScTx1. The former is a peptide from the Hadrurus gertschi scorpion, being a Kv1.1 channel blocker. ScTx1 is a peptide from the Stromatopelma calceata spider, being a Kv2.1 channel blocker. While ScTx1 was commercially obtained, HgeTx1 was obtained directly from the scorpion venom by high performance liquid chromatography (HPLC) and chemically characterized by means of MALD-TOF mass spectrometry. Compounds were administered bilateral into CA1 region of the hippocampus (i.h.) or intraperitoneally (i.p.). Male Wistar rats, under the effect of the different substances mentioned above (except toxins), were submitted to three behavioral spatial learning and memory tests: the open field (OF), the eight-arm radial maze (RM) and the Morris water maze (WM). All substances (including toxins) were also used in hippocampal slices of the rat brain to test their effects on the induction of long-term potentiation (LTP) on CA1 pyramidal neurons, a cell/molecular memory model. The behavioral tests confirmed the involvement of Kv channels in hippocampal-dependent memory formation. The OF tests showed that i.p. scopolamine (n = 5) induced a defict in spatial habituation. This effect was partially reversed by i.h. 4 -AP (n = 5). In RM tests, Kv channel blockade by i.h. 4 –AP (n = 6) facilitated working and reference memory, whereas the animal´s performance was impaired by i.p. scopolamine (n = 6). The WM tests showed similar results, since 4-AP improved the rat performance. In vitro electrophysiological tests complemented the behavioral. Scopolamine inhibited LTP induction (n = 6), while 4-AP potentiated it (n = 6), results consistent with the results of from the OF and RM. Interestingly, 4-AP reversed the suppressive effect of scopolamine on LTP (n = 6), similar to the result seen in the OF. Finally, Hgetx1 decreased LTP magnitude (n = 6) and ScTx1 increased it (n = 6), confirming the predictions of the present work. Thus, our results underscore the importance of Kv channels on spatial learning and memory and corroborate our hypothesis that Kv1 and Kv2 channels have distinct and complementary effects on memory.